荧光指纹图谱法筛查基因突变技术及其临床应用
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中华医学杂志 1998年第11期第78卷 临床研究
作者：向华 刘敬忠 周艳 朱章菱 张晶 肖白
单位：100020 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院[向华(现在中国科学院微生物学研究所遗传室100080)、刘敬忠、周艳、朱章菱、张晶、肖白]
关键词：
中华医学杂志981115 我们采用一种以DNA自动测序仪为基础的基因突变筛查新技术——荧光指纹图谱法(fluorescent fingerprint，FF)，筛查乙型血友病基因突变。该技术可使DNA自动测序仪的基因突变检出效率提高几倍至十几倍，已应用于乙型血友病等的基因诊断，并首次发现了5种新的突变类型。
一、对象与方法
1.对象：32例已知基因突变及26例wild type均经DNA序列测定证实，10例乙型血友病患者均经临床确诊，其外周血细胞的基因组DNA用常规方法抽提[1]。
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2.方法：F Ⅸ基因分8段进行PCR扩增，经部分沉淀法[1]去除dNTP和引物后，用4种分别带有不同荧光标记的ddNTPs在同一反应管内进行双脱氧末端终止反应，产物在ABI-373A型自动测序仪上进行高压电泳，收集测序数据，运用胶文件(gel file)将电泳彩色图谱展示在计算机屏幕上，每个样品获得一列4色彩色图谱，称之为荧光指纹图谱(图1)。由于荧光指纹图谱中4种碱基由4种不同颜色的色带(G蓝、A绿、T黄、C红)表示，并且各个样品的指纹图谱完全平行，因此，如果某个样品有不同的色带(代表碱基替换)或色带位移(代表缺失或插入)，则可以直观快速地发现。这样一次可以对屏幕上所有样品(多至36个)在该测序范围内有无突变同时做出判断。最后只需对有突变的样品，进一步用计算机序列分析软件对其突变的精确位置和类型进行确证。
二、结果
1.荧光指纹图谱法及筛查已知基因突变的双盲试验：图1为利用胶文件程序在ABI-373A型自动测序仪计算机屏幕上显示出来的20个测序标本的荧光指纹图谱的一部分。图谱中蓝色条带代表G，黄色代表T，红色代表C，绿色代表A。箭头所指的一条带颜色发生了变化，即由蓝变黄，说明发生了G→T的碱基替代。而17中箭头所指之绿色带，发生了由黄变绿，即T→A的突变。利用FF，分2批进行了58个DNA标本的双盲试验。结果32个突变标本全部能检出，而且所得到的突变类型与原来测出的结果完全一致。证明，FF技术筛查基因突变的灵敏度为100%，所检出突变类型的准确度为100%。
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G.蓝色条带；T.黄色条带；C.红色条带；A.绿色条带
9，箭头指处为蓝色变黄色，即G→T.17，箭头指处为黄色变绿色，即T→A
图1 显示出2条色带变化即2个基因突变的荧光指纹图谱
图2 检出3例乙型血友病患者的FⅨ基因突变的荧光指纹图谱
2.10例乙型血友病患者的基因诊断结果：图2显示用荧光指纹图谱法检出3例乙型血友病患者FⅨ基因突变。图2a中箭头指出第3例发生了T(黄)→C(红)的突变。图2b中箭头所指第5例有1个C(红)→T(黄)的突变。在图C中可以发现第3列的上部(箭头处)发生了图谱位移，这是由于缺失了一蓝(G)一黄(T)2条色带引起，即该样品发生了GT 2个碱基的缺失。采用FF法共检出10例重型乙型血友病患者的FⅨ基因的基因突变。其中5例为国内外首次报道的突变类型。即1号17 729缺失AC，Frame shift，肽链截短；3号6452 A→G，26Glu→Gly，Gla区修饰位点突变；7号 30103 T→A，217 Val→Glu，催化区突变；9号在Splicing site， 17667缺失A，无法正常切接，产生异常mRNA；10号在Splicing site，17 798 G→T，无法正常切接，产生异常mRNA。 三、讨论
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荧光指纹图谱法的特点是灵敏、快速、直观。该方法以DNA自动测序技术为基础，确保了其灵敏准确及自动化程度较高的特点。同时，该方法构思新颖，由于采用胶文件软件将一次电泳的所有同类样品展示在计算机屏幕上，每个样品的荧光指纹图谱(由4种颜色分别代表4种碱基)只占一列，因此，不同样品相同位置可互为参照，一次即可将全部样品有无突变同时检出，与常规自动测序法分析突变相比，FF可以大大提高突变检出效率。
58例已知基因型DNA标本双盲试验结果表明，FF技术筛查基因突变的阳性检出灵敏度及准确率均达到了100%。荧光指纹图谱法技术已成为本实验室进行乙型血友病等遗传病和其它疾病相关基因突变分析的主要方法之一。
本课题为北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1 刘敬忠，向华，张纪平，等.筛查基因突变的新技术循环双脱氧指纹图谱法及其应用.高技术通讯，1996，6：37.
(收稿：1998-05-06 修回：1998-07-24), 百拇医药
单位：100020 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院[向华(现在中国科学院微生物学研究所遗传室100080)、刘敬忠、周艳、朱章菱、张晶、肖白]
关键词：
中华医学杂志981115 我们采用一种以DNA自动测序仪为基础的基因突变筛查新技术——荧光指纹图谱法(fluorescent fingerprint，FF)，筛查乙型血友病基因突变。该技术可使DNA自动测序仪的基因突变检出效率提高几倍至十几倍，已应用于乙型血友病等的基因诊断，并首次发现了5种新的突变类型。
一、对象与方法
1.对象：32例已知基因突变及26例wild type均经DNA序列测定证实，10例乙型血友病患者均经临床确诊，其外周血细胞的基因组DNA用常规方法抽提[1]。
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2.方法：F Ⅸ基因分8段进行PCR扩增，经部分沉淀法[1]去除dNTP和引物后，用4种分别带有不同荧光标记的ddNTPs在同一反应管内进行双脱氧末端终止反应，产物在ABI-373A型自动测序仪上进行高压电泳，收集测序数据，运用胶文件(gel file)将电泳彩色图谱展示在计算机屏幕上，每个样品获得一列4色彩色图谱，称之为荧光指纹图谱(图1)。由于荧光指纹图谱中4种碱基由4种不同颜色的色带(G蓝、A绿、T黄、C红)表示，并且各个样品的指纹图谱完全平行，因此，如果某个样品有不同的色带(代表碱基替换)或色带位移(代表缺失或插入)，则可以直观快速地发现。这样一次可以对屏幕上所有样品(多至36个)在该测序范围内有无突变同时做出判断。最后只需对有突变的样品，进一步用计算机序列分析软件对其突变的精确位置和类型进行确证。
二、结果
1.荧光指纹图谱法及筛查已知基因突变的双盲试验：图1为利用胶文件程序在ABI-373A型自动测序仪计算机屏幕上显示出来的20个测序标本的荧光指纹图谱的一部分。图谱中蓝色条带代表G，黄色代表T，红色代表C，绿色代表A。箭头所指的一条带颜色发生了变化，即由蓝变黄，说明发生了G→T的碱基替代。而17中箭头所指之绿色带，发生了由黄变绿，即T→A的突变。利用FF，分2批进行了58个DNA标本的双盲试验。结果32个突变标本全部能检出，而且所得到的突变类型与原来测出的结果完全一致。证明，FF技术筛查基因突变的灵敏度为100%，所检出突变类型的准确度为100%。
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G.蓝色条带；T.黄色条带；C.红色条带；A.绿色条带
9，箭头指处为蓝色变黄色，即G→T.17，箭头指处为黄色变绿色，即T→A
图1 显示出2条色带变化即2个基因突变的荧光指纹图谱
图2 检出3例乙型血友病患者的FⅨ基因突变的荧光指纹图谱
2.10例乙型血友病患者的基因诊断结果：图2显示用荧光指纹图谱法检出3例乙型血友病患者FⅨ基因突变。图2a中箭头指出第3例发生了T(黄)→C(红)的突变。图2b中箭头所指第5例有1个C(红)→T(黄)的突变。在图C中可以发现第3列的上部(箭头处)发生了图谱位移，这是由于缺失了一蓝(G)一黄(T)2条色带引起，即该样品发生了GT 2个碱基的缺失。采用FF法共检出10例重型乙型血友病患者的FⅨ基因的基因突变。其中5例为国内外首次报道的突变类型。即1号17 729缺失AC，Frame shift，肽链截短；3号6452 A→G，26Glu→Gly，Gla区修饰位点突变；7号 30103 T→A，217 Val→Glu，催化区突变；9号在Splicing site， 17667缺失A，无法正常切接，产生异常mRNA；10号在Splicing site，17 798 G→T，无法正常切接，产生异常mRNA。 三、讨论
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荧光指纹图谱法的特点是灵敏、快速、直观。该方法以DNA自动测序技术为基础，确保了其灵敏准确及自动化程度较高的特点。同时，该方法构思新颖，由于采用胶文件软件将一次电泳的所有同类样品展示在计算机屏幕上，每个样品的荧光指纹图谱(由4种颜色分别代表4种碱基)只占一列，因此，不同样品相同位置可互为参照，一次即可将全部样品有无突变同时检出，与常规自动测序法分析突变相比，FF可以大大提高突变检出效率。
58例已知基因型DNA标本双盲试验结果表明，FF技术筛查基因突变的阳性检出灵敏度及准确率均达到了100%。荧光指纹图谱法技术已成为本实验室进行乙型血友病等遗传病和其它疾病相关基因突变分析的主要方法之一。
本课题为北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1 刘敬忠，向华，张纪平，等.筛查基因突变的新技术循环双脱氧指纹图谱法及其应用.高技术通讯，1996，6：37.
(收稿：1998-05-06 修回：1998-07-24), 百拇医药