静脉免疫球蛋白对脐血B细胞免疫球蛋白释放的调节
作者：李庆生 吴圣楣 应大明 林梓
单位：200092 上海市儿科医学研究所
关键词：
中华医学杂志981113 静脉免疫球蛋白(IVIG)能抑制体外成人B细胞免疫球蛋白(Ig)的释放[1]，但对发育不成熟的围产新生儿免疫系统可能产生的影响尚不清楚。本实验旨在观察IVIG对体外脐血B细胞Ig释放的调节及其可能的机制。
一、对象与方法
1.对象：脐血为足月新生儿脐静脉血，成人外周血取自健康成年自愿者。
2.方法：(1)脐血免疫球蛋白释放细胞(IgSCs)数目的检测：E花环沉降法分离T、B细胞。用丝裂霉素C(0.04 g/L)处理T细胞。将T、B细胞接种于抗CD3单克隆抗体(单抗)包被培养板中。4℃过夜，加入T、B细胞悬液。实验组加IVIG 5 mg/ml(美国Baxter Healthcare公司产品)，正常对照组加重组白细胞介素-2(rIL-2)100 U/ml)、r-IL-4 50 U/ml、rIL-10 100 U/ml及上述组合培养6天。用反向酶联免疫斑点法(RELISPOT)检测脐血IgSCs数目[2]。(2)成人外周血单个核细胞(PBMC)IgSCs的检测：常规方法获取PBMC，细胞经美洲商陆(0.001 g/L)刺激6天，用RELISPOT检测IgSCs。(3)CD40染色：将脐血单个核细胞(CBMC)或PBMC与IL-4 50 U/ml共同孵育48小时后，用间接免疫荧光标记法进行染色。第一抗体(一抗)用抗CD40单抗(0.01 g/L)的羊抗鼠IgG-FITC。流式细胞仪检测标本。(4)CD40L染色：CBMC与植物血凝素(PHA，0.02 g/L)培养48小时后，加入rIL-2(100 U/ml)继续培养5天。最后再经氟波酯(PMA，0.02 g/L)、钙离子导入剂(ionomycin, 0.5 g/L)诱导16小时后染色。除一抗用抗CD40L单抗外，余同CD40染色。(5)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-2mRNA、IL-4mRNA的表达：CBMC的培养同CD40L染色，但
, 百拇医药
表1 B细胞及PBMC中阳性IgSCs与3种主要IgSCs之后的百分比(%) 组别
例数
细胞因子
无
IL-2
IL-4
IL-10
IL-2+IL-4
IL-2+IL-10
脐血B细胞
7
IgGSCs/总IgSCs
, 百拇医药
3.2
4.7
4.8
7.2
10.4
9.7
IgASCs/总IgSCs
1.2
4.2
3.4
3.8
5.4
4.2
, http://www.100md.com
IgMSCs/总IgSCs
95.6
91.1
91.8
89.0
84.2
86.1
成人血PBMC
3
IgGSCs/总IgSCs
27.6
31.0
26.7
, http://www.100md.com
29.9
29.3
35.6
IgGSCs/总IgSCs
21.4
14.0
11.8
19.0
18.2
11.6
IgMSCs/总IgSCs
51.0
55.0
, http://www.100md.com
61.5
51.1
52.5
52.8
注：与正常对照组相比* P<0.05，**P<0.001表2 IVIG抑制脐血B细胞IgSCs的产生情况(阳性IgSCs数/104细胞，
±s) 组别
例数
细胞因子
无
IL-2
, 百拇医药
IL-4
IL-10
IL-2+IL-4
IL-2+IL-10
正常对照组
5
IgGSCs
11.2±4.2
30± 9
29± 16
49±17
49± 24
, 百拇医药 101± 40
IgASCs
3.8±2.3
18± 12
16± 11
26±14
25± 14
44± 22
IgMSCs
325.3±108.3
399±128
438±130
, http://www.100md.com
606±67
395±143
917±119
实验组
5
IgGSCs
5.3±3.6*
18± 9*
17± 15*
25±12**
35± 19*
, 百拇医药
56± 20**
IgASCs
2.5±3.0
7± 8*
8± 6*
13±14*
16± 12*
26± 18*
IgMSCs
218.3±113.7*
, 百拇医药
229±112*
370±156
332±43**
292±120*
596± 31
注：免疫球蛋白释放细胞IgSCs=IgGSCs+IgASCs+IgMSCsPMA结合ionomycin再诱导的时间为6小时。PBMC只经PMA及ionomycin刺激6小时即予以收集。一步法抽提总RNA，PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后观察。
3.统计学处理：数据以±s表示，采用t检验。
, 百拇医药
二、结果
1.IVIG抑制体外新生儿B细胞IgSCs的产生：适当刺激条件下的脐血B细胞出现了IgM向IgG及IgA的同种型转换，但由IgM向IgG及IgA转换的百分比低于成人(表1)。IVIG明显抑制了脐血B细胞IgSCs的产生(表2)。
2.IVIG不改变CD40在CBMC中的表达：用流式细胞仪检测IVIG作用后CD40表达的变化。含及不含IVIG CBMC标本中CD40阳性细胞百分比分别为(18±9)%及(18±8)%。两组比较t=0.977 2，P>0.05。IVIG也不能改变PBMC标本中CD40表达，实验组与对照组比较t=-1.123 5，P>0.05。
3.IVIG促进CD40L在CBMC中的表达：含及不含IVIG的CBMC标本中CD40L阳性细胞百分比分别为(13±4)%及(28±11)%。两组比较t=-4.1047，P<0.01。含有IVIG的PBMC组及不含IVIG的对照组CD40L阳性细胞百分比分别为(28±20)%及(12±8)%，两组比较t=-1.490 0，P>0.05。
, http://www.100md.com
4.IVIG抑制CBMC表达IL-2、IL-4mRNA：经PMA结合ionomycin诱导6小时后，PBMC可表达IL-2mRNA及IL-4mRNA，CBMC仅表达IL-2mRNA。PHA刺激48小时的CBMC，加入IL-2继续培养5天，再经PMA及ionomycin诱导6小时，则表达了IL-2mRNA及IL-4mRNA。对电泳后的PCR产物进行吸光度扫描，将IL-2mRNA(或IL-4mRNA)表达量与相应磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA表达量的比值进行比较后得出一相对单位。实验组与对照组的IL-2mRNA分别为0.86±0.20[吸光度值(A)]及0.70±0.24(A)，两组比较t=4.689，P<0.01。实验组与对照组的IL-4mRNA分别为0.76±0.14(A)及0.69±0.21(A)，两组比较t=0.017，P<0.05。IVIG的加入明显抑制了IL-2、IL-4mRNA的表达。
三、讨论
本结果表明，新生儿B细胞Ig类别转换功能低下与新生儿T、B细胞的功能不成熟有关，体外新生儿B细胞在适当的T细胞辅助并补充某些细胞因子的条件下，可以活化增殖并分化成更多IgSCs细胞。IVIG的加入使脐血B细胞中IgSCs明显减少。IVIG同时抑制了3种主要的Ig同种型的释放，并不是只抑制IgGSCs及IgASCs的出现。因此，IVIG虽能抑制脐血B细胞Ig的分泌，但并未阻断脐血B细胞Ig的同种型转移。另一方面，IVIG的加入并不影响CD40在CBMC活化后的表达，却提高了CBMC膜表面CD40L的表达。结合实验中外源性重组细胞因子部分拮抗了IVIG对脐血B细胞的抑制，提示，IVIG抑制B细胞Ig释放的同时，可能产生了针对T细胞的反馈信号，刺激了CD40L表达的增加，但在B细胞上的CD40或其它共刺激信号及有关的细胞因子缺乏配合的情况下，CD40L表达的增加并无实际的意义。本研究运用RT-PCR法显示了IVIG对IL-2、IL-4mRNA的表达有明显的抑制作用。说明IVIG对蛋白质水平的两种细胞因子产生的抑制可以是由于IVIG对从转录到分泌至胞外整个阶段任一时相上的抑制。
, http://www.100md.com
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Stohl W, Elliot JE. In vitro inhibition by intravenous immunoglobulin of human T cell-dependant B cell differentiation induced by staphylococcal superantigens. Clin Immunol Immunopath, 1996,79：122-133.
2 Lee FK, Nahmias AJ, Spiza T, et al. Enumeration of human peripheral blood lymphocytes secreting immunoglobulins of major classes and subclasses in healthy children and adults. J Clin Immunol, 1991,11：213-218.
(收稿：1997-09-16 修回：1998-06-20), http://www.100md.com
单位：200092 上海市儿科医学研究所
关键词：
中华医学杂志981113 静脉免疫球蛋白(IVIG)能抑制体外成人B细胞免疫球蛋白(Ig)的释放[1]，但对发育不成熟的围产新生儿免疫系统可能产生的影响尚不清楚。本实验旨在观察IVIG对体外脐血B细胞Ig释放的调节及其可能的机制。
一、对象与方法
1.对象：脐血为足月新生儿脐静脉血，成人外周血取自健康成年自愿者。
2.方法：(1)脐血免疫球蛋白释放细胞(IgSCs)数目的检测：E花环沉降法分离T、B细胞。用丝裂霉素C(0.04 g/L)处理T细胞。将T、B细胞接种于抗CD3单克隆抗体(单抗)包被培养板中。4℃过夜，加入T、B细胞悬液。实验组加IVIG 5 mg/ml(美国Baxter Healthcare公司产品)，正常对照组加重组白细胞介素-2(rIL-2)100 U/ml)、r-IL-4 50 U/ml、rIL-10 100 U/ml及上述组合培养6天。用反向酶联免疫斑点法(RELISPOT)检测脐血IgSCs数目[2]。(2)成人外周血单个核细胞(PBMC)IgSCs的检测：常规方法获取PBMC，细胞经美洲商陆(0.001 g/L)刺激6天，用RELISPOT检测IgSCs。(3)CD40染色：将脐血单个核细胞(CBMC)或PBMC与IL-4 50 U/ml共同孵育48小时后，用间接免疫荧光标记法进行染色。第一抗体(一抗)用抗CD40单抗(0.01 g/L)的羊抗鼠IgG-FITC。流式细胞仪检测标本。(4)CD40L染色：CBMC与植物血凝素(PHA，0.02 g/L)培养48小时后，加入rIL-2(100 U/ml)继续培养5天。最后再经氟波酯(PMA，0.02 g/L)、钙离子导入剂(ionomycin, 0.5 g/L)诱导16小时后染色。除一抗用抗CD40L单抗外，余同CD40染色。(5)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-2mRNA、IL-4mRNA的表达：CBMC的培养同CD40L染色，但
, 百拇医药
表1 B细胞及PBMC中阳性IgSCs与3种主要IgSCs之后的百分比(%) 组别
例数
细胞因子
无
IL-2
IL-4
IL-10
IL-2+IL-4
IL-2+IL-10
脐血B细胞
7
IgGSCs/总IgSCs
, 百拇医药
3.2
4.7
4.8
7.2
10.4
9.7
IgASCs/总IgSCs
1.2
4.2
3.4
3.8
5.4
4.2
, http://www.100md.com
IgMSCs/总IgSCs
95.6
91.1
91.8
89.0
84.2
86.1
成人血PBMC
3
IgGSCs/总IgSCs
27.6
31.0
26.7
, http://www.100md.com
29.9
29.3
35.6
IgGSCs/总IgSCs
21.4
14.0
11.8
19.0
18.2
11.6
IgMSCs/总IgSCs
51.0
55.0
, http://www.100md.com
61.5
51.1
52.5
52.8
注：与正常对照组相比* P<0.05，**P<0.001表2 IVIG抑制脐血B细胞IgSCs的产生情况(阳性IgSCs数/104细胞，
±s) 组别例数
细胞因子
无
IL-2
, 百拇医药
IL-4
IL-10
IL-2+IL-4
IL-2+IL-10
正常对照组
5
IgGSCs
11.2±4.2
30± 9
29± 16
49±17
49± 24
, 百拇医药 101± 40
IgASCs
3.8±2.3
18± 12
16± 11
26±14
25± 14
44± 22
IgMSCs
325.3±108.3
399±128
438±130
, http://www.100md.com
606±67
395±143
917±119
实验组
5
IgGSCs
5.3±3.6*
18± 9*
17± 15*
25±12**
35± 19*
, 百拇医药
56± 20**
IgASCs
2.5±3.0
7± 8*
8± 6*
13±14*
16± 12*
26± 18*
IgMSCs
218.3±113.7*
, 百拇医药
229±112*
370±156
332±43**
292±120*
596± 31
注：免疫球蛋白释放细胞IgSCs=IgGSCs+IgASCs+IgMSCsPMA结合ionomycin再诱导的时间为6小时。PBMC只经PMA及ionomycin刺激6小时即予以收集。一步法抽提总RNA，PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后观察。
3.统计学处理：数据以
±s表示，采用t检验。, 百拇医药
二、结果
1.IVIG抑制体外新生儿B细胞IgSCs的产生：适当刺激条件下的脐血B细胞出现了IgM向IgG及IgA的同种型转换，但由IgM向IgG及IgA转换的百分比低于成人(表1)。IVIG明显抑制了脐血B细胞IgSCs的产生(表2)。
2.IVIG不改变CD40在CBMC中的表达：用流式细胞仪检测IVIG作用后CD40表达的变化。含及不含IVIG CBMC标本中CD40阳性细胞百分比分别为(18±9)%及(18±8)%。两组比较t=0.977 2，P>0.05。IVIG也不能改变PBMC标本中CD40表达，实验组与对照组比较t=-1.123 5，P>0.05。
3.IVIG促进CD40L在CBMC中的表达：含及不含IVIG的CBMC标本中CD40L阳性细胞百分比分别为(13±4)%及(28±11)%。两组比较t=-4.1047，P<0.01。含有IVIG的PBMC组及不含IVIG的对照组CD40L阳性细胞百分比分别为(28±20)%及(12±8)%，两组比较t=-1.490 0，P>0.05。
, http://www.100md.com
4.IVIG抑制CBMC表达IL-2、IL-4mRNA：经PMA结合ionomycin诱导6小时后，PBMC可表达IL-2mRNA及IL-4mRNA，CBMC仅表达IL-2mRNA。PHA刺激48小时的CBMC，加入IL-2继续培养5天，再经PMA及ionomycin诱导6小时，则表达了IL-2mRNA及IL-4mRNA。对电泳后的PCR产物进行吸光度扫描，将IL-2mRNA(或IL-4mRNA)表达量与相应磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA表达量的比值进行比较后得出一相对单位。实验组与对照组的IL-2mRNA分别为0.86±0.20[吸光度值(A)]及0.70±0.24(A)，两组比较t=4.689，P<0.01。实验组与对照组的IL-4mRNA分别为0.76±0.14(A)及0.69±0.21(A)，两组比较t=0.017，P<0.05。IVIG的加入明显抑制了IL-2、IL-4mRNA的表达。
三、讨论
本结果表明，新生儿B细胞Ig类别转换功能低下与新生儿T、B细胞的功能不成熟有关，体外新生儿B细胞在适当的T细胞辅助并补充某些细胞因子的条件下，可以活化增殖并分化成更多IgSCs细胞。IVIG的加入使脐血B细胞中IgSCs明显减少。IVIG同时抑制了3种主要的Ig同种型的释放，并不是只抑制IgGSCs及IgASCs的出现。因此，IVIG虽能抑制脐血B细胞Ig的分泌，但并未阻断脐血B细胞Ig的同种型转移。另一方面，IVIG的加入并不影响CD40在CBMC活化后的表达，却提高了CBMC膜表面CD40L的表达。结合实验中外源性重组细胞因子部分拮抗了IVIG对脐血B细胞的抑制，提示，IVIG抑制B细胞Ig释放的同时，可能产生了针对T细胞的反馈信号，刺激了CD40L表达的增加，但在B细胞上的CD40或其它共刺激信号及有关的细胞因子缺乏配合的情况下，CD40L表达的增加并无实际的意义。本研究运用RT-PCR法显示了IVIG对IL-2、IL-4mRNA的表达有明显的抑制作用。说明IVIG对蛋白质水平的两种细胞因子产生的抑制可以是由于IVIG对从转录到分泌至胞外整个阶段任一时相上的抑制。
, http://www.100md.com
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Stohl W, Elliot JE. In vitro inhibition by intravenous immunoglobulin of human T cell-dependant B cell differentiation induced by staphylococcal superantigens. Clin Immunol Immunopath, 1996,79：122-133.
2 Lee FK, Nahmias AJ, Spiza T, et al. Enumeration of human peripheral blood lymphocytes secreting immunoglobulins of major classes and subclasses in healthy children and adults. J Clin Immunol, 1991,11：213-218.
(收稿：1997-09-16 修回：1998-06-20), http://www.100md.com