逆转录聚合酶链反应检测转基因细胞移植治疗帕金森病的基因表达
作者：赵迎春 刘振国 陈生弟 余慧贞 曹蕾 郑仲承 刘新垣 蒋芝华 周长福
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院神经内科[赵迎春(现在山西长治医学院附属医院神内，046000)、刘振国、陈生弟、余慧贞]；中国科学院上海生物化学研究所(曹蕾、郑仲承、刘新垣)；中国科学院上海生理研究所(蒋芝华、周长福)
关键词：
中华医学杂志981129 脑内移植技术和基因转移技术相结合形成了帕金森病(PD)的新疗法——基因治疗。目前已成功地将转酪氨酸羟化酶(TH)基因的成纤维细胞、 工肌细胞等移植于PD大鼠[1]。我们采用逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)方法检测转TH基因的成肌细胞移植于PD鼠的基因表达。
一、材料与方法
1.偏侧PD大鼠模型的建立与评价：雄性SD大鼠100只，体重230～250 g，将12 μg 6-羟多巴胺(6-OHDA)立体定向注射于大鼠右侧黑质。3周后用阿朴吗啡(APO)按0.25 mg/kg诱发大鼠向左侧(未损伤侧)旋转，表明模型制作成功，选7 r/min以上的动物用于实验。
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2.移植：经旋转行为检测驻实成功的34只偏侧PD模型经6个月稳定后，随机分为治疗组(24只)和对照组(10只)，将用电穿孔法转染大鼠TH基因表达质粒LNC-TH的成肌细胞和未转基因的成肌细胞分别悬浮于5%葡萄糖生理盐水中，浓度为2.5×104细胞/μl[2]。将细胞悬液立体定向注射于PD鼠损毁侧纹状体内。治疗组植入转TH基因的成肌细胞，对照组植入未转基因的成肌细胞。
3.RT-PCR检测：移植治疗后1个月，两组各取1只大鼠，分离出双侧黑质及纹状体。首先用TRI zo1试剂提取总RNA，用1～5 μg总RNA，以Oligo dT[Not I-(dt)18]为引物，用逆转录酶合成第1条cDNA链。以第1条cDNA链为模板进行PCR反应。上游引物(5′ATGCCCACCCCCAGCGCCCC3′，互补于鼠THcDNA编码区1～20)，下游引物(5′GACACTTTTCTTGGGAACCA3′，互补于鼠THcDNA编码区494-513)。反应产物电泳鉴定、摄片。
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4.TH免疫组织化学检测：移植治疗后1个月，治疗组及对照组各取1只大鼠，灌注固定后出双侧纹状体，用兔抗TH血清(TH抗体，1∶2 000)浓度，按ABC法进行TH免疫组织化学染色。
二、结果
1.RT-PCR：移植治疗后1个月，在治疗组的右侧纹状体移植部位检测到TH基因的表达，PCR产物经电泳，染色后可见513 bp片段，而对照组的纹状体移植部位未检测到该条带，同时在移植对侧纹状体和未进行逆转录的治疗组移植侧纹状体均未检测到该条带(图1)。
2.TH免疫组织化学检测：移植治疗后1月TH免疫组织化学示：治疗组在损毁侧(移植治疗侧)纹状体内近针道周围可见TH阳性的细胞，呈褐色，同时也可见散在的TH阳性细胞分布在针道较远区域(图2)。而在治疗组的健侧纹状体及对照组的双侧纹状体内均未见到TH阳性细胞。
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1.λ-phage DAN pst I digest; 2. 转TH基因成肌细胞移植侧纹状体;
3. 移植对侧纹状体, 4.未转基因成肌细胞移植侧纹状体；
5.转TH基因成肌细胞移植侧(未进行逆转录)；6. LND-TH
图1 RT-PCR检测移植转基因成肌细胞后PD鼠纹状体区TH基因表达
图2 转TH基因成肌细胞移植后纹状体区可见大量TH阳性细胞 ABC染色×120
三、讨论
本实验将转鼠TH基因的成肌细胞移植于偏侧PD鼠的纹状体，移植治疗后1个月，RT-PCR法在治疗组的移植侧纹状体检测到TH基因的表达，而对照组植入未转基因的成肌细胞后未检测到TH基因的表达。在治疗组损毁侧(移植侧)太体内可见TH阳性染色细胞，因为在正常纹状体内，没有DA能神经胞体，纹状体内的DA神经纤维和末梢来源于黑质的DA细胞群(A9群)，而DA能神经细胞的THmRNA仅存在于其胞体及轴丘部位，而其树突及轴突内均无THmRNA，故在PD鼠的纹状体内不应有TH基因的表达[3]，故本结果在纹状体移植部位检测到的TH基因是植入的转基因成肌细胞所表达的。另外，由于PD鼠的损毁侧纹状体内的DA能神经纤维已被6-OHDA损毁，故上述损毁侧纹状体内所观察到的TH阳性细胞应是植入的转TH基因的成肌细胞。
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本课题为国家科学基金(39470261)、卫生部青年人才基金(94-AQ24)和上海市科委青年科技启明星后计划(94QMH1402)资助项目
参考文献
1 Jiao S, Gureuich V, Wolff JA, et al. Long-term correction of rat model of pakinson′s disease by gene therapy, Nature, 1993, 362:450-453.
2 赵迎春，陈生弟，刘振国，等.酪氨酸羟化酶基因式程细胞植入大鼠纹状体的研究.中华医学杂志，1996，76：52-53.
3 Kastner A, Hirsch EC, Agid Y, et al. Tyrosine hydroxylase protein and messenger RNA in the dopaminergic nigral neuron of patient with parkinson′s disease. Brain Res, 1993, 606, 341-345.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-08-04), http://www.100md.com
单位：200025 上海第二医科大学瑞金医院神经内科[赵迎春(现在山西长治医学院附属医院神内，046000)、刘振国、陈生弟、余慧贞]；中国科学院上海生物化学研究所(曹蕾、郑仲承、刘新垣)；中国科学院上海生理研究所(蒋芝华、周长福)
关键词：
中华医学杂志981129 脑内移植技术和基因转移技术相结合形成了帕金森病(PD)的新疗法——基因治疗。目前已成功地将转酪氨酸羟化酶(TH)基因的成纤维细胞、 工肌细胞等移植于PD大鼠[1]。我们采用逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)方法检测转TH基因的成肌细胞移植于PD鼠的基因表达。
一、材料与方法
1.偏侧PD大鼠模型的建立与评价：雄性SD大鼠100只，体重230～250 g，将12 μg 6-羟多巴胺(6-OHDA)立体定向注射于大鼠右侧黑质。3周后用阿朴吗啡(APO)按0.25 mg/kg诱发大鼠向左侧(未损伤侧)旋转，表明模型制作成功，选7 r/min以上的动物用于实验。
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2.移植：经旋转行为检测驻实成功的34只偏侧PD模型经6个月稳定后，随机分为治疗组(24只)和对照组(10只)，将用电穿孔法转染大鼠TH基因表达质粒LNC-TH的成肌细胞和未转基因的成肌细胞分别悬浮于5%葡萄糖生理盐水中，浓度为2.5×104细胞/μl[2]。将细胞悬液立体定向注射于PD鼠损毁侧纹状体内。治疗组植入转TH基因的成肌细胞，对照组植入未转基因的成肌细胞。
3.RT-PCR检测：移植治疗后1个月，两组各取1只大鼠，分离出双侧黑质及纹状体。首先用TRI zo1试剂提取总RNA，用1～5 μg总RNA，以Oligo dT[Not I-(dt)18]为引物，用逆转录酶合成第1条cDNA链。以第1条cDNA链为模板进行PCR反应。上游引物(5′ATGCCCACCCCCAGCGCCCC3′，互补于鼠THcDNA编码区1～20)，下游引物(5′GACACTTTTCTTGGGAACCA3′，互补于鼠THcDNA编码区494-513)。反应产物电泳鉴定、摄片。
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4.TH免疫组织化学检测：移植治疗后1个月，治疗组及对照组各取1只大鼠，灌注固定后出双侧纹状体，用兔抗TH血清(TH抗体，1∶2 000)浓度，按ABC法进行TH免疫组织化学染色。
二、结果
1.RT-PCR：移植治疗后1个月，在治疗组的右侧纹状体移植部位检测到TH基因的表达，PCR产物经电泳，染色后可见513 bp片段，而对照组的纹状体移植部位未检测到该条带，同时在移植对侧纹状体和未进行逆转录的治疗组移植侧纹状体均未检测到该条带(图1)。
2.TH免疫组织化学检测：移植治疗后1月TH免疫组织化学示：治疗组在损毁侧(移植治疗侧)纹状体内近针道周围可见TH阳性的细胞，呈褐色，同时也可见散在的TH阳性细胞分布在针道较远区域(图2)。而在治疗组的健侧纹状体及对照组的双侧纹状体内均未见到TH阳性细胞。
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1.λ-phage DAN pst I digest; 2. 转TH基因成肌细胞移植侧纹状体;
3. 移植对侧纹状体, 4.未转基因成肌细胞移植侧纹状体；
5.转TH基因成肌细胞移植侧(未进行逆转录)；6. LND-TH
图1 RT-PCR检测移植转基因成肌细胞后PD鼠纹状体区TH基因表达
图2 转TH基因成肌细胞移植后纹状体区可见大量TH阳性细胞 ABC染色×120
三、讨论
本实验将转鼠TH基因的成肌细胞移植于偏侧PD鼠的纹状体，移植治疗后1个月，RT-PCR法在治疗组的移植侧纹状体检测到TH基因的表达，而对照组植入未转基因的成肌细胞后未检测到TH基因的表达。在治疗组损毁侧(移植侧)太体内可见TH阳性染色细胞，因为在正常纹状体内，没有DA能神经胞体，纹状体内的DA神经纤维和末梢来源于黑质的DA细胞群(A9群)，而DA能神经细胞的THmRNA仅存在于其胞体及轴丘部位，而其树突及轴突内均无THmRNA，故在PD鼠的纹状体内不应有TH基因的表达[3]，故本结果在纹状体移植部位检测到的TH基因是植入的转基因成肌细胞所表达的。另外，由于PD鼠的损毁侧纹状体内的DA能神经纤维已被6-OHDA损毁，故上述损毁侧纹状体内所观察到的TH阳性细胞应是植入的转TH基因的成肌细胞。
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本课题为国家科学基金(39470261)、卫生部青年人才基金(94-AQ24)和上海市科委青年科技启明星后计划(94QMH1402)资助项目
参考文献
1 Jiao S, Gureuich V, Wolff JA, et al. Long-term correction of rat model of pakinson′s disease by gene therapy, Nature, 1993, 362:450-453.
2 赵迎春，陈生弟，刘振国，等.酪氨酸羟化酶基因式程细胞植入大鼠纹状体的研究.中华医学杂志，1996，76：52-53.
3 Kastner A, Hirsch EC, Agid Y, et al. Tyrosine hydroxylase protein and messenger RNA in the dopaminergic nigral neuron of patient with parkinson′s disease. Brain Res, 1993, 606, 341-345.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-08-04), http://www.100md.com