胆囊恶性肿瘤的分子生物学研究进展
作者：崔健 余云
单位：中国医科大学第二临床学院肝胆外科(沈阳110003)，崔健现在上海医科大学中山医院肝癌研究所(200032)
关键词：
肝胆胰外科杂志990133 胆道系统恶性肿瘤包括胆囊癌和胆道癌。以往曾认为胆道癌为罕见疾病，但量近年来胆道肿瘤发病率有明显上升趋势。胆道癌出现临床症状多属晚期，疗效差，预后不佳。因而对其发病机制的探讨和早期诊断研究正日益引起人们重视。八十年代后期以来，癌基因和抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热门课题，有希望为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一条全新途径。胆道肿瘤的基因研究也逐渐得到人们的关注。
迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有Ras(K-ras，N-ras)、c-myc、c-erbB-2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有P53、P16/MTS1、APC、DDC等。
, 百拇医药
1 癌基因
Ras基因是一个常见的癌基因家族，由K-ras，N-ras，和N-ras三个成员构成[1]。细胞中正常ras基因编码高度相关的分子量为21000u的蛋白质(P21)。P21是一种鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合蛋白，它由188或189个氨基酸组成，和细胞生长和分化密切相关。正常P21和GTP结合后激活磷脂酶C，产生第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)，之后GTP被P21降解，第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的ras基因发生了突变而变成了癌基因，其所编码的变异P21蛋白仍能同GTP结合但是失去了降解GTP的功能，从而使磷酸脂酶C持续活化，产生大量IP3和DG，引细胞过度增殖，最终发生癌变[1]。
现在已在人类多种肿瘤中检测到了ras基因突变[1]。40%的结肠癌，50%的肺腺癌，30%的急性白血病中均可检测到ras基因的突变。其突变的主要方式上点突变，12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中K-ras基因的突变率高达90%以上，而且突变的位点大多局限于K-ras基因12位点上[2]。但是对于胆系肿瘤，关于ras基因突变研究文献极少，而且结果差异很大，甚至还有完全相反的报道[3-5]。
, 百拇医药
Almoguera应用RNA酶错配切割法和DNA直接测序，分析胆道肿瘤的病理标本时，未见任何ras基因改变[2]。而Tada等应用DNA测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有ras基因突变，在胆囊癌中则不存在ras基因改变[3]。与之相反，Levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛ras基因点突变[4]。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中K-ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在K-ras基因改变，而是检测方法灵敏度不够所致。DNA直接测序时，大约需要20%的细胞发生突变才能得到阳性结果，而RNA酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为，由于胆道肿瘤是多克隆发病，因而发生K-ras基因突变的细胞只是一小部分，用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步PCR-RFLP法(两轮碱基错配PCR+两轮限制性核酸内切酶酶切)配以DNA直接测序，发现肝外胆管癌中K-ras基因突变率为100%。这种方法灵敏度非常高，可以在512个等位基因中检测到一个等位基因的点突变。
, 百拇医药
Watanabe等应用与Levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本[5]。结果发现55%的胆囊癌、100%的肝外胆管癌均存在K-ras基因改变。总的突变率为75%。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是G→A，使GGT变成了GAT，所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生GGT→GTT及GGT→TTT改变，这些都导致了相应氨基酸改变，因而均是有意义突变。更为重要的是，他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中，表面正常的腺瘤已经发生了K-ras基因突变，而且突变方式和癌组织完全一样，从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。
Ajiki等的研究亦表明K-ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象[6]。在他们的研究中，胆囊癌、胆囊上皮不典型增生的K-ras基因12点的点突变率分别为57%、59%、73%。他们的实验也发现了一个很有意义的现象：9例发生在胆囊癌周围的不典型增生，都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素(如：胆石、长期胆汁酸刺激等)的作用下，胆囊粘肠上皮化生→胆囊粘膜不典型增生→胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。
, 百拇医药
Yukama等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展胆囊癌中ras基因和其他癌基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中ras基因产物P21阳性表达率高达95%。胆囊炎为33%。其他癌基因产物如c-myc、c-eerbB2、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子受体(TGF-β)等在胆囊癌都有高表达，平均阳性率在60%左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低，平均在10%以下[7]。Lee等的研究结果也表明，与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比，胆囊癌中P21呈现强表达，阳性率为62%，胆管癌中P21阳性率也达到了50%。P21表达和预后没有明显的关系[8]。以上学者都认为：胆囊癌发病过程中存在着多种基历共同作用，其中，ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的[9]。
c-erbB2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体(EGFR)类似物。对于它的研究结果不尽相同。Kamel等的研究结果表明胆囊癌中c-erbB2阳性率大约为10%。胆囊粘膜不典型增生中，其阳性率为0。他们认为c-erbB2表达在胆囊癌中是一较晚事件，只有在细胞癌变后才出现[10]。而Yukama等的研究表明c-erbB2在早期胆囊癌中阳性表达率为69%。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为c-erbB2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一[7]。出现这一不同结果的原因可能是：1.他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。2.所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于c-erbB2在胆囊癌发生中到底起何种作用，仍需进一步研究。
, 百拇医药
2 抑癌基因
关于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色体17P13，全长为16-20Kb，由11个外显子构成。正常P53基因编码野生型P53蛋白，是一种分子量为53KD的核内磷蛋白。人的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53基历突变后所编码的蛋白称为变异型P53。
在人乳腺癌、脑癌、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现P53基因突变，总突变率为50%左右[11-13]。其中83%为错义点突变，10%为插入或缺失突变。P53的突变并非随机发生，大多数的突变发生于133-299氨基酸。应用PCR技术研究后发现密码子132-145、171-179、239-248、272-286为突普热点。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗细胞增殖，抑制细胞生长分裂，使细胞停止于G1期而不进入S期。野生型P53可以阻碍DNA复制起始复合物的装配，抑制DNA复制，并且在转录水平进行调节，防止细胞过度生长分裂。此外野生P53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型P53基因失活的细胞经久处于未成熟状态，持续增生。突变型P53则不具备以上的功能。
, 百拇医药
野生型P53蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型P53则很稳定，可以在核内积聚，这使得可以免疫组织化学方法检测到它的存在[14]。突变型P53的检测可以很好反映P53基因突变情况[15]。这一点不同于Ras基因。Wee等用S-P法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中P53蛋白表达，阳性率分别为73%和64%[16]。他们认为在胆道癌发病过程中，P53基因突变是一个普通发生的事件，是胆道癌发生内在因素之一。Kamel[10]等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着P53基因突变。更为重要的是，在两例胆囊上皮不典型增生的标本中，他们也发现了P53蛋白阳性表达。
Hanada等研究发现，在病理类型为平坦型的胆囊癌中，P53阳性率高于息肉型胆中癌。而平坦型癌多为浸润癌[17]。Roa的研究也表明，在早期胆囊癌中，P53的阳性率为23.5%，在进展期胆囊癌中，P53的阳性率达到48.2%。在高分化胆囊癌中，P53的阳性率为25%，而在低分化的胆囊癌中，P53的阳性率达到50%[18]。以上研究均提示P53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
, 百拇医药
P16是近年发现的比P53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因，又称为多肿瘤抑制基因(MTS1)。P16基因定位于人染色体9P21，由三个外显子构成。总长度为8.5Kb。其编码产物P16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者[19]。它是细胞周期依赖性激酶4(CDK4)抑制因子。因而又称MTS1 P16 CDK4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活化，CDK4和D型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从G1→S期的转变，从而促进细胞增生，这可能是恶性肿瘤发生因素之一。P16蛋白能和CDK4结合，抑制细胞转化。近年来有关P16基因纯合性丢失的研究表明，在人类大部分肿瘤中，均有P16纯合性丢失，与杂合性丢失一起，总的突变率为50%。碱基突变和缺失另占25%，故在肿瘤组织中P16总突变率为75%，比P53的50%的突变率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次报告了P16基因在胆道肿瘤中的突变情况[20]。他们分析了25例胆道瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中P16 MTS1的总突变率64%(其中胆囊癌80%，胆管癌63%)，高于P53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在胆系肿瘤中到底作用如何，具体突变方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一个明确结论。
, 百拇医药
APC基因和DCC基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，编码产物分子量超过300，000调控ras基因表达。后者也位于5q21，在APC附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变[21]，但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q[21-22]缺失，故认为APC和DCC与胆管癌关系不大[22]。
3 前景和展望
虽然对于胆系肿瘤的生物学研究与胃癌、结直肠癌和胰腺癌相比仍不够深入，众多的问题还有待于解决，但是目前的研究结果大大丰富了我们对于胆系肿瘤的认识，这对于寻找早期诊断胆系肿瘤的有效手段具有重要的指导价值。
胆道肿瘤发病率近年明显上升。由于早期诊断困难，故预后极差。寻找一条有效的早期诊断手段是当前研究的重要课题。从胰腺癌的研究中我们可以获得一些启发。1990年Shibata对36例胰腺癌标本作细胞学检查的同时作K-ras基因突变分析，结果25例细胞学检查恶性标本中18例测到了ras基因点突变[23]。3例细胞学检查良性标本无一例发生ras基因突变。8例细胞学检查为不典型增生标本中，有两例发生突变。1991年，Tada等对B超引导下胰腺穿刺所获得的细胞进行基因分析，检测K-ras基因1位点的突变，成功地为2例细胞学检查无法判定病变良恶性的病例作出了诊断[24]。随着研究方法的不断改进，特别是改良的二步PCE-RFLP方法的应用，人们发现胆道肿瘤中也广泛存在着K-ras基因12位点的突变，总突变率在75%-100%之间，接近于胰腺癌突变水平。由于PCR技术灵敏性和特异性极高，可以从几个拷贝的DNA分子中检测到K-ras基因点突变，因而用十二指肠引流或PTCD检查获得胆汁中的脱落细胞，或在B超引导下用细针穿刺胆道肿瘤获得标本，然后用PCR法检测标本中K-ras基因12位点突变，有可能开创一条早期诊断胆道肿瘤的新途径，而且对于常规影像学和细胞学检查有重要补充价值。
, 百拇医药
作者简借：崔健：综述 余云：审校
参考文献
1 Bos，JL.Ras oncogenes in human cancer A review.CancerRes，1989，79(17)∶4682～4689
2 Almoguera C，Shibata，Forrester K，etal.Mosthuman carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes Cell，1988，53(4)∶549～554
3 Tada M，Omata M，Ohto M.Analysis of rasgene mutations in human hepatic malignant tumors by polymeras echain reaction and direct sequencing.Cancer Res，1990，50(4)∶1121～1124
, http://www.100md.com
4 LeviS，Urbano-IspizuaA.GillR，etal.MultipleK-rascodon 12 mutations in cholangiocarcinomas demonstrated with a sensi-tive polymerase chain reaction technique.Cancer Res，1991，51(13)∶3497～3502
5 Watanabe M，Asaka M，Tanaka J，etal.Pointmutations of K-ras gene in biliary tract tumors.Gastroenterology，1994，107(4)∶1147～1153
6 Ajiki T，Fujimori T.Onoyama H，etal.K-ras genemutation in gallbladder carcinoma and dysplsia.Gut，1996，38(3)∶426～429
, 百拇医药
7 Yukawa M，Fujimori T，Hirayawa D，etal.Expression of oncogene products and growth factors in early gallbladder cancer，and vancedgallbladder cancer and chronic cholecysttis.Human Pathol，1993，24(1)∶37～40
8 Lee CS.Ras P21 protein immunoreactivity and its relarionship to P 53 expression and prognosis in gallbladder and extrahepatic Biliray carcinoma.Eur J Surg Oncol，1997，23(3)∶233～237
9 Fearon ER，Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis Cell，1990，61(5)∶759～767
, 百拇医药
10 Kamel D，Paakko P，Nuorva K，etal.P53 and c-erbB-2 protein expressionin adenocarcinoma and epithelial dysplasias of the gallbladder.J of Pathol，1993，170(1)∶67～72
11 Harris AL.Mutant P53 the commonest genetic abnormality in human cancer.J Pathol，1990，162(1)∶5～6
12 Chang F，Syrjanen S，Tervahauta A，etal.Tumorigenesis associated with the P53 tumour suppressor gene.BrJCancer，1993，68(4)∶563～661
13 Finlay CA，Hinds PW，Levine AJ.The P53 prooncogene can act as a suppressor of transformation Cell，1989，57(7)∶1083～1093
, 百拇医药
14 Bartek J，Bartkova J，Lukas J，etal.Immunohistochemical analysis of the P53 oncoprotein on paraffin sections using a series of novel monoclonal antibodies.JPathol，1993，169(1)∶27～34
15 Teh M，Wee A，Path MRC，etal.An immunohistochemical study of P53 protein in gallbladder andextrahepaticbileduct ampullarycarcinomas.Cancer，1994，74(5)∶1542～1545
16 Itoi T，Watanabe H，Yoshida M，etal.Correlation of P53 expression with gene mutation in gallbladder carcinomas.Pathol Int，1997，47(8)∶525～530
, http://www.100md.com
17 Hanada K，Itoh M，Fujii K，etal.P53 mutation in stage I gallbladder carcinoma with special attention to growth patterms.EurJCancer，1997，33(7)∶1136～1140
18 Roa I，Villaseca M，Araya J，etal.P53 tumor suppressor gene protein expression in early and advance dgallbladder carcinoma Histopathology，1997，31(3)∶226～230
19 Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feld-hausJ，etal.A cell cycle regulatior potentially in volved in genesis of many tumor types.Science，1994，264(5157)∶436～440
, 百拇医药
20 Yoshida S，Todoroki T，Ischikawa Y，etal.Mutations of p16ink4/CDKN2 and p15ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers.Cancer Res，1995，55(13)∶2756～2760
21 Storto PD，Saidman SL，Demetris AJ，etal.Chromosomal breakpoints in cholangiocarcinoma cell lines.Genes Chromosomes Cancer，1990，2(4)∶300～310
22 Ding SF，Delhanty JD，BowlesL，etal.Infrequent chromosome allele loss in fibrolamellar carcinoma.Br J Cancer，1993，67(2)∶244～246
23 Shibata D，Almoguera C，Forrester K，etal.Dection of c-Ki-ras mutations in fine needle aspirate form human panceras adenocarcinoma.CancerRes，1990，50(4)∶1279～1283
24 Tada M，Omata M，Ohto M.Clinical application of ras gene mutation for diagnosis for pancreas adenocarcinoma.Gastroenterology.1991，100(1)∶233～238, 百拇医药
单位：中国医科大学第二临床学院肝胆外科(沈阳110003)，崔健现在上海医科大学中山医院肝癌研究所(200032)
关键词：
肝胆胰外科杂志990133 胆道系统恶性肿瘤包括胆囊癌和胆道癌。以往曾认为胆道癌为罕见疾病，但量近年来胆道肿瘤发病率有明显上升趋势。胆道癌出现临床症状多属晚期，疗效差，预后不佳。因而对其发病机制的探讨和早期诊断研究正日益引起人们重视。八十年代后期以来，癌基因和抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热门课题，有希望为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一条全新途径。胆道肿瘤的基因研究也逐渐得到人们的关注。
迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有Ras(K-ras，N-ras)、c-myc、c-erbB-2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有P53、P16/MTS1、APC、DDC等。
, 百拇医药
1 癌基因
Ras基因是一个常见的癌基因家族，由K-ras，N-ras，和N-ras三个成员构成[1]。细胞中正常ras基因编码高度相关的分子量为21000u的蛋白质(P21)。P21是一种鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合蛋白，它由188或189个氨基酸组成，和细胞生长和分化密切相关。正常P21和GTP结合后激活磷脂酶C，产生第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)，之后GTP被P21降解，第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的ras基因发生了突变而变成了癌基因，其所编码的变异P21蛋白仍能同GTP结合但是失去了降解GTP的功能，从而使磷酸脂酶C持续活化，产生大量IP3和DG，引细胞过度增殖，最终发生癌变[1]。
现在已在人类多种肿瘤中检测到了ras基因突变[1]。40%的结肠癌，50%的肺腺癌，30%的急性白血病中均可检测到ras基因的突变。其突变的主要方式上点突变，12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中K-ras基因的突变率高达90%以上，而且突变的位点大多局限于K-ras基因12位点上[2]。但是对于胆系肿瘤，关于ras基因突变研究文献极少，而且结果差异很大，甚至还有完全相反的报道[3-5]。
, 百拇医药
Almoguera应用RNA酶错配切割法和DNA直接测序，分析胆道肿瘤的病理标本时，未见任何ras基因改变[2]。而Tada等应用DNA测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有ras基因突变，在胆囊癌中则不存在ras基因改变[3]。与之相反，Levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛ras基因点突变[4]。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中K-ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在K-ras基因改变，而是检测方法灵敏度不够所致。DNA直接测序时，大约需要20%的细胞发生突变才能得到阳性结果，而RNA酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为，由于胆道肿瘤是多克隆发病，因而发生K-ras基因突变的细胞只是一小部分，用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步PCR-RFLP法(两轮碱基错配PCR+两轮限制性核酸内切酶酶切)配以DNA直接测序，发现肝外胆管癌中K-ras基因突变率为100%。这种方法灵敏度非常高，可以在512个等位基因中检测到一个等位基因的点突变。
, 百拇医药
Watanabe等应用与Levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本[5]。结果发现55%的胆囊癌、100%的肝外胆管癌均存在K-ras基因改变。总的突变率为75%。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是G→A，使GGT变成了GAT，所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生GGT→GTT及GGT→TTT改变，这些都导致了相应氨基酸改变，因而均是有意义突变。更为重要的是，他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中，表面正常的腺瘤已经发生了K-ras基因突变，而且突变方式和癌组织完全一样，从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。
Ajiki等的研究亦表明K-ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象[6]。在他们的研究中，胆囊癌、胆囊上皮不典型增生的K-ras基因12点的点突变率分别为57%、59%、73%。他们的实验也发现了一个很有意义的现象：9例发生在胆囊癌周围的不典型增生，都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素(如：胆石、长期胆汁酸刺激等)的作用下，胆囊粘肠上皮化生→胆囊粘膜不典型增生→胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。
, 百拇医药
Yukama等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展胆囊癌中ras基因和其他癌基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中ras基因产物P21阳性表达率高达95%。胆囊炎为33%。其他癌基因产物如c-myc、c-eerbB2、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子受体(TGF-β)等在胆囊癌都有高表达，平均阳性率在60%左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低，平均在10%以下[7]。Lee等的研究结果也表明，与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比，胆囊癌中P21呈现强表达，阳性率为62%，胆管癌中P21阳性率也达到了50%。P21表达和预后没有明显的关系[8]。以上学者都认为：胆囊癌发病过程中存在着多种基历共同作用，其中，ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的[9]。
c-erbB2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体(EGFR)类似物。对于它的研究结果不尽相同。Kamel等的研究结果表明胆囊癌中c-erbB2阳性率大约为10%。胆囊粘膜不典型增生中，其阳性率为0。他们认为c-erbB2表达在胆囊癌中是一较晚事件，只有在细胞癌变后才出现[10]。而Yukama等的研究表明c-erbB2在早期胆囊癌中阳性表达率为69%。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为c-erbB2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一[7]。出现这一不同结果的原因可能是：1.他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。2.所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于c-erbB2在胆囊癌发生中到底起何种作用，仍需进一步研究。
, 百拇医药
2 抑癌基因
关于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色体17P13，全长为16-20Kb，由11个外显子构成。正常P53基因编码野生型P53蛋白，是一种分子量为53KD的核内磷蛋白。人的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53基历突变后所编码的蛋白称为变异型P53。
在人乳腺癌、脑癌、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现P53基因突变，总突变率为50%左右[11-13]。其中83%为错义点突变，10%为插入或缺失突变。P53的突变并非随机发生，大多数的突变发生于133-299氨基酸。应用PCR技术研究后发现密码子132-145、171-179、239-248、272-286为突普热点。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗细胞增殖，抑制细胞生长分裂，使细胞停止于G1期而不进入S期。野生型P53可以阻碍DNA复制起始复合物的装配，抑制DNA复制，并且在转录水平进行调节，防止细胞过度生长分裂。此外野生P53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型P53基因失活的细胞经久处于未成熟状态，持续增生。突变型P53则不具备以上的功能。
, 百拇医药
野生型P53蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型P53则很稳定，可以在核内积聚，这使得可以免疫组织化学方法检测到它的存在[14]。突变型P53的检测可以很好反映P53基因突变情况[15]。这一点不同于Ras基因。Wee等用S-P法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中P53蛋白表达，阳性率分别为73%和64%[16]。他们认为在胆道癌发病过程中，P53基因突变是一个普通发生的事件，是胆道癌发生内在因素之一。Kamel[10]等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着P53基因突变。更为重要的是，在两例胆囊上皮不典型增生的标本中，他们也发现了P53蛋白阳性表达。
Hanada等研究发现，在病理类型为平坦型的胆囊癌中，P53阳性率高于息肉型胆中癌。而平坦型癌多为浸润癌[17]。Roa的研究也表明，在早期胆囊癌中，P53的阳性率为23.5%，在进展期胆囊癌中，P53的阳性率达到48.2%。在高分化胆囊癌中，P53的阳性率为25%，而在低分化的胆囊癌中，P53的阳性率达到50%[18]。以上研究均提示P53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
, 百拇医药
P16是近年发现的比P53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因，又称为多肿瘤抑制基因(MTS1)。P16基因定位于人染色体9P21，由三个外显子构成。总长度为8.5Kb。其编码产物P16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者[19]。它是细胞周期依赖性激酶4(CDK4)抑制因子。因而又称MTS1 P16 CDK4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活化，CDK4和D型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从G1→S期的转变，从而促进细胞增生，这可能是恶性肿瘤发生因素之一。P16蛋白能和CDK4结合，抑制细胞转化。近年来有关P16基因纯合性丢失的研究表明，在人类大部分肿瘤中，均有P16纯合性丢失，与杂合性丢失一起，总的突变率为50%。碱基突变和缺失另占25%，故在肿瘤组织中P16总突变率为75%，比P53的50%的突变率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次报告了P16基因在胆道肿瘤中的突变情况[20]。他们分析了25例胆道瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中P16 MTS1的总突变率64%(其中胆囊癌80%，胆管癌63%)，高于P53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在胆系肿瘤中到底作用如何，具体突变方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一个明确结论。
, 百拇医药
APC基因和DCC基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，编码产物分子量超过300，000调控ras基因表达。后者也位于5q21，在APC附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变[21]，但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q[21-22]缺失，故认为APC和DCC与胆管癌关系不大[22]。
3 前景和展望
虽然对于胆系肿瘤的生物学研究与胃癌、结直肠癌和胰腺癌相比仍不够深入，众多的问题还有待于解决，但是目前的研究结果大大丰富了我们对于胆系肿瘤的认识，这对于寻找早期诊断胆系肿瘤的有效手段具有重要的指导价值。
胆道肿瘤发病率近年明显上升。由于早期诊断困难，故预后极差。寻找一条有效的早期诊断手段是当前研究的重要课题。从胰腺癌的研究中我们可以获得一些启发。1990年Shibata对36例胰腺癌标本作细胞学检查的同时作K-ras基因突变分析，结果25例细胞学检查恶性标本中18例测到了ras基因点突变[23]。3例细胞学检查良性标本无一例发生ras基因突变。8例细胞学检查为不典型增生标本中，有两例发生突变。1991年，Tada等对B超引导下胰腺穿刺所获得的细胞进行基因分析，检测K-ras基因1位点的突变，成功地为2例细胞学检查无法判定病变良恶性的病例作出了诊断[24]。随着研究方法的不断改进，特别是改良的二步PCE-RFLP方法的应用，人们发现胆道肿瘤中也广泛存在着K-ras基因12位点的突变，总突变率在75%-100%之间，接近于胰腺癌突变水平。由于PCR技术灵敏性和特异性极高，可以从几个拷贝的DNA分子中检测到K-ras基因点突变，因而用十二指肠引流或PTCD检查获得胆汁中的脱落细胞，或在B超引导下用细针穿刺胆道肿瘤获得标本，然后用PCR法检测标本中K-ras基因12位点突变，有可能开创一条早期诊断胆道肿瘤的新途径，而且对于常规影像学和细胞学检查有重要补充价值。
, 百拇医药
作者简借：崔健：综述 余云：审校
参考文献
1 Bos，JL.Ras oncogenes in human cancer A review.CancerRes，1989，79(17)∶4682～4689
2 Almoguera C，Shibata，Forrester K，etal.Mosthuman carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes Cell，1988，53(4)∶549～554
3 Tada M，Omata M，Ohto M.Analysis of rasgene mutations in human hepatic malignant tumors by polymeras echain reaction and direct sequencing.Cancer Res，1990，50(4)∶1121～1124
, http://www.100md.com
4 LeviS，Urbano-IspizuaA.GillR，etal.MultipleK-rascodon 12 mutations in cholangiocarcinomas demonstrated with a sensi-tive polymerase chain reaction technique.Cancer Res，1991，51(13)∶3497～3502
5 Watanabe M，Asaka M，Tanaka J，etal.Pointmutations of K-ras gene in biliary tract tumors.Gastroenterology，1994，107(4)∶1147～1153
6 Ajiki T，Fujimori T.Onoyama H，etal.K-ras genemutation in gallbladder carcinoma and dysplsia.Gut，1996，38(3)∶426～429
, 百拇医药
7 Yukawa M，Fujimori T，Hirayawa D，etal.Expression of oncogene products and growth factors in early gallbladder cancer，and vancedgallbladder cancer and chronic cholecysttis.Human Pathol，1993，24(1)∶37～40
8 Lee CS.Ras P21 protein immunoreactivity and its relarionship to P 53 expression and prognosis in gallbladder and extrahepatic Biliray carcinoma.Eur J Surg Oncol，1997，23(3)∶233～237
9 Fearon ER，Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis Cell，1990，61(5)∶759～767
, 百拇医药
10 Kamel D，Paakko P，Nuorva K，etal.P53 and c-erbB-2 protein expressionin adenocarcinoma and epithelial dysplasias of the gallbladder.J of Pathol，1993，170(1)∶67～72
11 Harris AL.Mutant P53 the commonest genetic abnormality in human cancer.J Pathol，1990，162(1)∶5～6
12 Chang F，Syrjanen S，Tervahauta A，etal.Tumorigenesis associated with the P53 tumour suppressor gene.BrJCancer，1993，68(4)∶563～661
13 Finlay CA，Hinds PW，Levine AJ.The P53 prooncogene can act as a suppressor of transformation Cell，1989，57(7)∶1083～1093
, 百拇医药
14 Bartek J，Bartkova J，Lukas J，etal.Immunohistochemical analysis of the P53 oncoprotein on paraffin sections using a series of novel monoclonal antibodies.JPathol，1993，169(1)∶27～34
15 Teh M，Wee A，Path MRC，etal.An immunohistochemical study of P53 protein in gallbladder andextrahepaticbileduct ampullarycarcinomas.Cancer，1994，74(5)∶1542～1545
16 Itoi T，Watanabe H，Yoshida M，etal.Correlation of P53 expression with gene mutation in gallbladder carcinomas.Pathol Int，1997，47(8)∶525～530
, http://www.100md.com
17 Hanada K，Itoh M，Fujii K，etal.P53 mutation in stage I gallbladder carcinoma with special attention to growth patterms.EurJCancer，1997，33(7)∶1136～1140
18 Roa I，Villaseca M，Araya J，etal.P53 tumor suppressor gene protein expression in early and advance dgallbladder carcinoma Histopathology，1997，31(3)∶226～230
19 Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feld-hausJ，etal.A cell cycle regulatior potentially in volved in genesis of many tumor types.Science，1994，264(5157)∶436～440
, 百拇医药
20 Yoshida S，Todoroki T，Ischikawa Y，etal.Mutations of p16ink4/CDKN2 and p15ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers.Cancer Res，1995，55(13)∶2756～2760
21 Storto PD，Saidman SL，Demetris AJ，etal.Chromosomal breakpoints in cholangiocarcinoma cell lines.Genes Chromosomes Cancer，1990，2(4)∶300～310
22 Ding SF，Delhanty JD，BowlesL，etal.Infrequent chromosome allele loss in fibrolamellar carcinoma.Br J Cancer，1993，67(2)∶244～246
23 Shibata D，Almoguera C，Forrester K，etal.Dection of c-Ki-ras mutations in fine needle aspirate form human panceras adenocarcinoma.CancerRes，1990，50(4)∶1279～1283
24 Tada M，Omata M，Ohto M.Clinical application of ras gene mutation for diagnosis for pancreas adenocarcinoma.Gastroenterology.1991，100(1)∶233～238, 百拇医药