肝细胞生长因子对大鼠急性胃粘膜损伤预防作用的研究
作者：倪金良 邓长生
单位：倪金良 扬州大学医学院附属医院消化内科 扬州 225001;邓长生 湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉 430071
关键词：肝细胞生长因子；急性胃粘膜损伤；预防；肝素；大鼠
990104 摘要 为了探讨内源性肝细胞生长因子(HGF)对大鼠急性胃粘膜损伤(AGML)的预防作用，以粘膜电位(PD)、pH、损伤指数(LI)及组织学观察评价AGML状况。结果显示，大鼠AGML前静注适量肝素可以使胃粘膜中HGF含量增加，且HGF含量增加的大鼠胃PD、pH较对照组增高，LI降低，组织损伤改善。研究表明，大鼠AGML前以肝素诱生的内源性HGF可以预防随后的AGML。
Preventing Effect of HGF on Acute
, 百拇医药 Gastric Mucosal Lesions in Rats
Ni Jinliang1, Deng Changsheng2
1 The Affiliated Hospital, Yang Zhou University, Yang Zhou 225001
2 The 2nd Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071
Abstract The authors are to study about whether endogenous hepatocyte growth factor (HGF) has a preventing effect on acute gastric mucosal lesions (AGML) in rats. Heparin and tetradecanoyl-phorbol-acetate (TPA) are injected together to induce endogenous HGF, and then gastric mucosal pH, potential difference (PD) and lesion index (LI) are used to evaluate the mucosal lesion. The results show that HGF induced before AGML does have the preventing effect.
, 百拇医药
Key words HGF; Acute-Gastric-Mucosal-lesions; Preventing effect; Heparin; Phorbol-Ester; Rats
许多粘膜保护剂可以程度不同地预防急性胃粘膜损伤(AGML)，其作用多局限于某一方面。肝细胞生长因子(HGF)是一种新的胃肠激素、多肽生长因子，有广泛的生理功能[1]，能否预防AGML，国内外报道甚少。现就以上几方面作如下研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 成年雄性 大鼠，体重160～200g，在适宜条件下饲养。实验前禁食24h，可自由饮水。
1.2 主要试剂 0.6mol/L盐酸、肝素钠、3%戊巴比妥钠、4%缓冲福尔马林、苏木素-伊红染液、3H-TdR(国内产品)、DMEM/F-12培养基、胎牛血清(Sigma公司，USA)，Ultrafluor(NationalDiagnostics,USA)。
, 百拇医药
1.3 实验仪器 解剖显微镜、BH-2型光镜(Olympus,Japan)，pH计、数字式毫伏表(湖北省电力试验研究所)，灌胃器(自制)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 30只大鼠随机分为5组，每组6只。各组处理均在灌胃前30min进行。正常组：不作任何处理。对照组：静注(经尾静脉，下同)生理盐水约0.4ml。Ⅰ组：静注肝素钠15u(约0.4ml，下同)。Ⅱ组：静注肝素钠100u。Ⅲ组：静注肝素钠200u。
1.4.2 复制AGML模型[2] 除正常组外，余试验鼠均经口灌胃0.6mol/L盐酸1ml，不吸出。
1.4.3 AGML评价[3，4] 灌胃后25min以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在操作台上将大鼠剖腹，沿胃大弯剪开，即刻测粘膜pH、PD与损伤指数(LI)。测毕，取1/2胃壁制作胃全层HE切片，观察粘膜组织学损伤(包括固有层炎细胞，LPIC)。
, 百拇医药
1.4.4 胃粘膜HGF含量测定[5] 取每只大鼠另1/2的胃粘膜，匀浆、柱层析，得粘膜HGF样品，以生物活性法检测每mg粘膜的HGF活性。此法简要为在大鼠胃上皮细胞原代单层培养后的第2、3d加HGF样品，并在培养的最后6h以脉冲标记法加入终浓度为4μci/ml的3H-TdR孵育，然后吸去上清，游离贴壁细胞成悬液。每孔液体一分为二，一份测总蛋白，另一份加入Ultrafluor闪烁液测液闪计数，以每μg蛋白质每小时液闪计数(dpm/h/μgpr)作为HGF的生物活性。
1.5 统计学处理 采用成组均数t检验，以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 AGML的大体评价 Ⅱ、Ⅲ两组损伤较对照组减轻(P<0.05)，Ⅰ组则无明显差异(P>0.05)。见表1。
表1 大鼠灌胃后30min粘膜损伤情况(
±s，n=6)
, 百拇医药
分 组
pH
PD(-mV)
LI
LPIC
正常组
5.10±0.28△
34.82±8.02△
9±2.1△
3±0.2△△
对照组
2.57±0.34
, 百拇医药
19.52±5.31
87±8.3
31±5.7
Ⅰ组
2.83±0.40
22.34±4.67
76±5.7
25±4.8
Ⅱ组
4.72±0.18△
26.45±6.33△
31±6.2△
, http://www.100md.com
16±2.4△△
Ⅲ组
4.18±0.35△
39.63±5.74△
35±4.1△
14±1.6△△
与对照组相比：△P<0.05；△△P<0.01。
2.2 组织学观察 与对照组相比，Ⅰ组组织学损伤与之类似，包括LPIC(P>0.05，见表1)；Ⅱ组与Ⅲ组上皮结构破坏轻微，部分仍可见粘液层，LPIC少于对照组(P<0.05)。Ⅱ组与Ⅲ组之间损伤程度接近。
, http://www.100md.com
2.3 胃粘膜HGF含量测定 Ⅱ、Ⅲ两组的粘膜HGF含量较对照组增高，P<0.05；Ⅰ组略高于对照组，但无显著性差异。见表2。
表2 大鼠胃粘膜HGF含量(±s，n=6)
正常组
对照组
Ⅰ组
Ⅱ组
Ⅲ组
HGF(dpm/h/μgpr./mg粘膜)
, 百拇医药 54±11
69±19
89±7
126±27△
147±18△
与对照组相比，△P<0.05。
3 讨论
本研究以0.6mol/L盐酸经口灌胃复制AGML的大鼠模型，灌胃后并不吸出胃内容物，简化了操作。实验显示，灌胃后30min已有明显的粘膜损伤，表明模型成功，并以此时评价损伤程度及粘膜保护剂对AGML的预防效应。
多肽生长因子能否预防AGML，国内外对此有争议，且主要限于研究EGF[6，7]。近来研究发现，胃内及血液中生理浓度的EGF并无抑酸作用，EGF也不能逆转阿斯匹林对粘膜内前列腺素合成的抑制；更有PlayfordRJ等[7]报道，活性EGF在胃酸pH<4时降解为无活性小片断，故正常及AGML时EGF发挥多大作用，值得重新评估。
, 百拇医药
本次实验表明，静注足量肝素可诱导内源性HGF向胃粘膜损伤处趋化，并有生物活性；而足量内源性HGF被诱导后可减轻盐酸灌胃后的AML，如Ⅱ、Ⅲ组所示。以上提示，HGF对0.6mol/L盐酸所致AGML有预防作用。HGF对其它类型AGL有无预防作用，尚需进一步研究。
肝素的诱导效应与其剂量有关。实验表明，500u/kg是一个可选剂量。肝素钠剂量过小，则无明显诱导作用；剂量过大，诱导HGF后产生的预防作用并不相应增加，且副作用增大。
HGF预防AGML的机制如下：
(1)HGF是胃肠激素性质的多肽生长因子，有内分泌和旁分泌作用方式[8]，其效应不易受胃腔内环境影响。AGML时，HGF还可向胃粘膜处趋化。这是HGF发挥胃粘膜保护作用的前提。
(2)HGF可促进胃上皮合成、分泌PG[9]，从而发挥HGF对AGML的预防作用。
, http://www.100md.com
(3)损伤减轻组大鼠的胃粘膜层有部分保留，表明HGF促进了胃上皮粘液分泌，胃粘液屏障可能得以强化。
(4)胃粘膜血流(GMBF)亦是胃粘膜屏障。实验表明，HGF可减少粘膜血管的炎性渗出和出血，维持GMBF，从而减轻AGML。此外，肝素还可能增加GMBF[10]，机制不详。
(5)胃上皮层的破坏只要是表浅的，即使损伤面积广泛，缺损也可通过整复作用很快修复[11]。HGF可以促进胃肠上皮迁移与整复[12]。严格地说，整复不是预防AGML的机制，但在损伤后评价损伤状况，确有整复作用参与，尽管早期不明显。这也是灌胃后较快评价AGML原因之一。
(注：本文在湖北医科大学附属第二医院攻读硕士学位时完成)
参考文献
, 百拇医药
1Bors P, Miller C M. Hepatocyte groweth factor: a multifunctional cytokine.TheLancet,1995, 345(1): 293～295
2 Tsuji S, Kawano S, Tsuji M. Roles of hepatocyte growth factor and its receptor in gastric mucosa. Digestive Diseases and Sicenses. 1995, 40(5):1132～1139
3 许国铭，施雅芳，李兆申等.洛赛克对胃粘膜血流量、粘膜电位、幽门螺杆菌的影响.中华消化杂志，1991，11(5)：255～257
4 Guth P H, Aures D, Paulsen G. Topical aspirin plus HCl gastric lesions in the rat. Gastroenterology, 1979, 76(1):88～93
, 百拇医药
5 Tsubouchi H, Niitani Y, Hirono S. Levels of the human hepatocyte growth factor in serum of patients with various liver diseases determined by an enzyme-linked immunosorbent assay. Hepatology, 1991, 13(1):1～5
6 Konterek S J. Role of growth factors in gastroduadenal protection and healing of peptic ulcer. Gastroenterology Clinics North America, 1990, 19(1): 41
7 Playford R J, MarchbankT, Calnan D P. Epidermal growth factor is digested to smaller, less active forms in acidic gastric juice. Gastroenterology, 1995, 108(1): 92～101
, 百拇医药
8 Matsumoto K, Tajima H, Okazaki H, et al. Heparin as an inducer of hepatocyte growth factor. Journal f Biochemistry, 1993, 114(6): 320～326
9 Hori T, Shibamoto S, Hayakawa M. Stimulation of prostaglandin production by hepatocyte growth factor. FEBS Lett, 1993, 334(3):331～334
10 Waheed M, Rann A. Protective effects of preheparinization on the microvasculature during and after hemorrhagic shock. Journal of Trauma, 1992, 32(4):420～424
, 百拇医药
11 Silen W, Ito S. Mechanism for rapid re-epithilialization of the gastric mucosal surface. Annual Review of Physiology, 1985, 47: 217
12 Nuarat A, Parkos C A, Barcarra AE, et al. Hepatocyte growth factor/sactter factor effects on epithilia. Journal of Clinical Investigations, 1994, 93(5): 2056～2065
(1997-07-22 收稿), 百拇医药
单位：倪金良 扬州大学医学院附属医院消化内科 扬州 225001;邓长生 湖北医科大学附属第二医院消化内科 武汉 430071
关键词：肝细胞生长因子；急性胃粘膜损伤；预防；肝素；大鼠
990104 摘要 为了探讨内源性肝细胞生长因子(HGF)对大鼠急性胃粘膜损伤(AGML)的预防作用，以粘膜电位(PD)、pH、损伤指数(LI)及组织学观察评价AGML状况。结果显示，大鼠AGML前静注适量肝素可以使胃粘膜中HGF含量增加，且HGF含量增加的大鼠胃PD、pH较对照组增高，LI降低，组织损伤改善。研究表明，大鼠AGML前以肝素诱生的内源性HGF可以预防随后的AGML。
Preventing Effect of HGF on Acute
, 百拇医药 Gastric Mucosal Lesions in Rats
Ni Jinliang1, Deng Changsheng2
1 The Affiliated Hospital, Yang Zhou University, Yang Zhou 225001
2 The 2nd Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071
Abstract The authors are to study about whether endogenous hepatocyte growth factor (HGF) has a preventing effect on acute gastric mucosal lesions (AGML) in rats. Heparin and tetradecanoyl-phorbol-acetate (TPA) are injected together to induce endogenous HGF, and then gastric mucosal pH, potential difference (PD) and lesion index (LI) are used to evaluate the mucosal lesion. The results show that HGF induced before AGML does have the preventing effect.
, 百拇医药
Key words HGF; Acute-Gastric-Mucosal-lesions; Preventing effect; Heparin; Phorbol-Ester; Rats
许多粘膜保护剂可以程度不同地预防急性胃粘膜损伤(AGML)，其作用多局限于某一方面。肝细胞生长因子(HGF)是一种新的胃肠激素、多肽生长因子，有广泛的生理功能[1]，能否预防AGML，国内外报道甚少。现就以上几方面作如下研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 成年雄性 大鼠，体重160～200g，在适宜条件下饲养。实验前禁食24h，可自由饮水。
1.2 主要试剂 0.6mol/L盐酸、肝素钠、3%戊巴比妥钠、4%缓冲福尔马林、苏木素-伊红染液、3H-TdR(国内产品)、DMEM/F-12培养基、胎牛血清(Sigma公司，USA)，Ultrafluor(NationalDiagnostics,USA)。
, 百拇医药
1.3 实验仪器 解剖显微镜、BH-2型光镜(Olympus,Japan)，pH计、数字式毫伏表(湖北省电力试验研究所)，灌胃器(自制)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 30只大鼠随机分为5组，每组6只。各组处理均在灌胃前30min进行。正常组：不作任何处理。对照组：静注(经尾静脉，下同)生理盐水约0.4ml。Ⅰ组：静注肝素钠15u(约0.4ml，下同)。Ⅱ组：静注肝素钠100u。Ⅲ组：静注肝素钠200u。
1.4.2 复制AGML模型[2] 除正常组外，余试验鼠均经口灌胃0.6mol/L盐酸1ml，不吸出。
1.4.3 AGML评价[3，4] 灌胃后25min以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在操作台上将大鼠剖腹，沿胃大弯剪开，即刻测粘膜pH、PD与损伤指数(LI)。测毕，取1/2胃壁制作胃全层HE切片，观察粘膜组织学损伤(包括固有层炎细胞，LPIC)。
, 百拇医药
1.4.4 胃粘膜HGF含量测定[5] 取每只大鼠另1/2的胃粘膜，匀浆、柱层析，得粘膜HGF样品，以生物活性法检测每mg粘膜的HGF活性。此法简要为在大鼠胃上皮细胞原代单层培养后的第2、3d加HGF样品，并在培养的最后6h以脉冲标记法加入终浓度为4μci/ml的3H-TdR孵育，然后吸去上清，游离贴壁细胞成悬液。每孔液体一分为二，一份测总蛋白，另一份加入Ultrafluor闪烁液测液闪计数，以每μg蛋白质每小时液闪计数(dpm/h/μgpr)作为HGF的生物活性。
1.5 统计学处理 采用成组均数t检验，以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 AGML的大体评价 Ⅱ、Ⅲ两组损伤较对照组减轻(P<0.05)，Ⅰ组则无明显差异(P>0.05)。见表1。
表1 大鼠灌胃后30min粘膜损伤情况(
±s，n=6), 百拇医药
分 组
pH
PD(-mV)
LI
LPIC
正常组
5.10±0.28△
34.82±8.02△
9±2.1△
3±0.2△△
对照组
2.57±0.34
, 百拇医药
19.52±5.31
87±8.3
31±5.7
Ⅰ组
2.83±0.40
22.34±4.67
76±5.7
25±4.8
Ⅱ组
4.72±0.18△
26.45±6.33△
31±6.2△
, http://www.100md.com
16±2.4△△
Ⅲ组
4.18±0.35△
39.63±5.74△
35±4.1△
14±1.6△△
与对照组相比：△P<0.05；△△P<0.01。
2.2 组织学观察 与对照组相比，Ⅰ组组织学损伤与之类似，包括LPIC(P>0.05，见表1)；Ⅱ组与Ⅲ组上皮结构破坏轻微，部分仍可见粘液层，LPIC少于对照组(P<0.05)。Ⅱ组与Ⅲ组之间损伤程度接近。
, http://www.100md.com
2.3 胃粘膜HGF含量测定 Ⅱ、Ⅲ两组的粘膜HGF含量较对照组增高，P<0.05；Ⅰ组略高于对照组，但无显著性差异。见表2。
表2 大鼠胃粘膜HGF含量(
±s，n=6)正常组
对照组
Ⅰ组
Ⅱ组
Ⅲ组
HGF(dpm/h/μgpr./mg粘膜)
, 百拇医药 54±11
69±19
89±7
126±27△
147±18△
与对照组相比，△P<0.05。
3 讨论
本研究以0.6mol/L盐酸经口灌胃复制AGML的大鼠模型，灌胃后并不吸出胃内容物，简化了操作。实验显示，灌胃后30min已有明显的粘膜损伤，表明模型成功，并以此时评价损伤程度及粘膜保护剂对AGML的预防效应。
多肽生长因子能否预防AGML，国内外对此有争议，且主要限于研究EGF[6，7]。近来研究发现，胃内及血液中生理浓度的EGF并无抑酸作用，EGF也不能逆转阿斯匹林对粘膜内前列腺素合成的抑制；更有PlayfordRJ等[7]报道，活性EGF在胃酸pH<4时降解为无活性小片断，故正常及AGML时EGF发挥多大作用，值得重新评估。
, 百拇医药
本次实验表明，静注足量肝素可诱导内源性HGF向胃粘膜损伤处趋化，并有生物活性；而足量内源性HGF被诱导后可减轻盐酸灌胃后的AML，如Ⅱ、Ⅲ组所示。以上提示，HGF对0.6mol/L盐酸所致AGML有预防作用。HGF对其它类型AGL有无预防作用，尚需进一步研究。
肝素的诱导效应与其剂量有关。实验表明，500u/kg是一个可选剂量。肝素钠剂量过小，则无明显诱导作用；剂量过大，诱导HGF后产生的预防作用并不相应增加，且副作用增大。
HGF预防AGML的机制如下：
(1)HGF是胃肠激素性质的多肽生长因子，有内分泌和旁分泌作用方式[8]，其效应不易受胃腔内环境影响。AGML时，HGF还可向胃粘膜处趋化。这是HGF发挥胃粘膜保护作用的前提。
(2)HGF可促进胃上皮合成、分泌PG[9]，从而发挥HGF对AGML的预防作用。
, http://www.100md.com
(3)损伤减轻组大鼠的胃粘膜层有部分保留，表明HGF促进了胃上皮粘液分泌，胃粘液屏障可能得以强化。
(4)胃粘膜血流(GMBF)亦是胃粘膜屏障。实验表明，HGF可减少粘膜血管的炎性渗出和出血，维持GMBF，从而减轻AGML。此外，肝素还可能增加GMBF[10]，机制不详。
(5)胃上皮层的破坏只要是表浅的，即使损伤面积广泛，缺损也可通过整复作用很快修复[11]。HGF可以促进胃肠上皮迁移与整复[12]。严格地说，整复不是预防AGML的机制，但在损伤后评价损伤状况，确有整复作用参与，尽管早期不明显。这也是灌胃后较快评价AGML原因之一。
(注：本文在湖北医科大学附属第二医院攻读硕士学位时完成)
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, 百拇医药
1Bors P, Miller C M. Hepatocyte groweth factor: a multifunctional cytokine.TheLancet,1995, 345(1): 293～295
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5 Tsubouchi H, Niitani Y, Hirono S. Levels of the human hepatocyte growth factor in serum of patients with various liver diseases determined by an enzyme-linked immunosorbent assay. Hepatology, 1991, 13(1):1～5
6 Konterek S J. Role of growth factors in gastroduadenal protection and healing of peptic ulcer. Gastroenterology Clinics North America, 1990, 19(1): 41
7 Playford R J, MarchbankT, Calnan D P. Epidermal growth factor is digested to smaller, less active forms in acidic gastric juice. Gastroenterology, 1995, 108(1): 92～101
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8 Matsumoto K, Tajima H, Okazaki H, et al. Heparin as an inducer of hepatocyte growth factor. Journal f Biochemistry, 1993, 114(6): 320～326
9 Hori T, Shibamoto S, Hayakawa M. Stimulation of prostaglandin production by hepatocyte growth factor. FEBS Lett, 1993, 334(3):331～334
10 Waheed M, Rann A. Protective effects of preheparinization on the microvasculature during and after hemorrhagic shock. Journal of Trauma, 1992, 32(4):420～424
, 百拇医药
11 Silen W, Ito S. Mechanism for rapid re-epithilialization of the gastric mucosal surface. Annual Review of Physiology, 1985, 47: 217
12 Nuarat A, Parkos C A, Barcarra AE, et al. Hepatocyte growth factor/sactter factor effects on epithilia. Journal of Clinical Investigations, 1994, 93(5): 2056～2065
(1997-07-22 收稿), 百拇医药