络活喜对动脉粥样硬化大鼠血清一氧化氮水平的影响研究
作者：闫中政 贾志萍 李廷富 王井全 何巍 胡健
单位：闫中政 贾志萍 李廷富(中国医科大学第一临床学院老年病教研室，沈阳110001)；王井全 胡 健(中国医科大学第一临床学院循环内科)；何 巍 本院药剂科
关键词：络活喜；一氧化氮；动脉粥样硬化
中国老年学杂志/990126 摘 要 将30只100 g左右雄性Wistar大鼠随机分成3组，每组10只。Ⅰ组：正常组；Ⅱ组：高胆固醇组；Ⅲ组：高胆固醇加络活喜组，分别喂养8 w。测定血清一氧化氮(NO)水平。Ⅰ组最高，Ⅱ组次之，Ⅲ组最低，差异非常显著(P<0.01)。电镜下观察到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组基本一致，细胞形态结构基本正常；Ⅱ组内皮细胞排列不规则，内皮细胞间隙增大，可见泡沫细胞浸入。说明络活喜有独立的抗动脉粥样硬化损伤作用，并可同时影响血清NO水平。
钙离子拮抗剂(CAs)能减少甚至完全消退动脉粥样硬化(As)改变，已被大量临床研究和动物实验所证实；而新近发现的新型信使分子一氧化氮(NO)，作为内皮源性松弛因子，在抗As损伤中的作用已引起极大重视，被认为NO可能中止或防止As斑块的形成和生长。而CAs对As损伤中血清NO水平的影响尚未见报道。本文旨在研究作为CAs一种的络活喜对As大鼠血清NO水平的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 动物模型 选取重约100 g的雄性Wistar大鼠30只(由中国医科大学实验动物部提供)，随机分为3组，每组10只，单组分笼饲养。Ⅰ组：空白对照组，饲以常规鼠料8 w，饮水不限。Ⅱ组：实验对照组，每只饲以常规鼠料加胆固醇粉末0.1 g/d，8 w，饮水不限。Ⅲ组：实验组，每只饲以常规鼠料加胆固醇粉末0.1 g/d，同时每只予络活喜(Amlodipine)0.75 mg/d，灌胃8 w，饮水不限。
1.2 实验药品及仪器 胆固醇：Sigma(美国)沈阳分装；络活喜：大连辉瑞制药有限公司生产；α-奈胺盐酸盐：国防化学院化工厂；对氨基苯磺酸：北京西中化工厂；氢氧化铝凝胶：用1M硫酸铝及6 M氢氧化钠溶液等体积混合，搅拌均匀，800 r/min离心5 min，去上清，沉淀用去离子水洗涤2次制成。260分光光度仪：日本岛津；JME-1200EX透射电镜：日本岛津；光镜及照像装置：日本尼康公司；旋涡混匀器：上海医疗器械厂；超速离心机：上海医疗器械厂。
, 百拇医药
1.3 实验步骤及方法 Wistar大鼠3组分笼饲养8 w后，颈静脉切开取血做血清学测定：血清NO水平测定参照α-奈胺分光光度法〔1〕；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)分别采用上海长征科学有限公司的甘油三酯试剂盒、酶法单瓶胆固醇试剂、高密度脂蛋白试剂。
处死大鼠后取左锁骨下动脉起始部至髂动脉分叉处主动脉作组织学观察。
1.4 统计学处理 所有数据均用
±s表示，组间结果显著性差异比较用t检验。
2 结 果
血清学指标如表1所示。
表1 各组血清TG、TC、HDL及NO水平(±s) 组别
, http://www.100md.com
TG(mg/L)
TC(mg/L)
HDL(mg/L)
NO(μM)
Ⅰ
1.23±0.19
5.32±0.24
2.97±0.21
30.82±4.13
Ⅱ
2.37±0.262)
7.29±0.291)
, 百拇医药
4.68±0.301)
21.64±0.901)
Ⅲ
2.47±0.311)
6.90±0.181)
4.57±0.241)
13.67±4.821)2)
1)与Ⅰ组比较有非常显著性差异(P<0.01)，2)与Ⅱ组比较有非常显著性差异(P<0.01)
Ⅱ、Ⅲ组TG、TC、HDL均显著高于Ⅰ组(P<0.01)，Ⅱ组与Ⅲ组无显著性差异(P>0.05)；提高高胆固醇饲养可使大鼠血TG、TC、HDL升高，络活喜不能降低血脂；血清NO水平3组间均有显著性差异(P<0.01)，其中以Ⅰ组最高，Ⅱ组次之，Ⅲ组最低。
, http://www.100md.com
组织学检查结果：Ⅰ组与Ⅲ组基本一致，光镜下内膜光滑平整，内皮细胞排列整齐、平整，电镜下细胞形态结构基本正常；Ⅱ组光可见明显胆固醇沉积斑块，内皮细胞形成不规则，平滑肌细胞排列紊乱，电镜下见内皮细胞间连接间隙增大，泡沫细胞侵入内皮细胞间隙，平滑肌细胞胞浆可见较多的小脂质空泡及大量溶酶体，提示高胆固醇饲养可诱发大鼠As损伤，络活喜可拮抗这种损伤作用。
3 讨 论
As是一个缓慢的病理过程，其基本特征是脂质、蛋白多糖、钙及血液中有形成份在动脉壁局部累积，从而引起一系列损伤改变。
有关CAs抗As损伤作用已有大量报道，其机制普遍认为CAs不影响血清总胆固醇含量，主要是通过降低LDL在动脉壁的沉积和增加HDL含量来发挥作用；其次是通过脂质过氧化损伤并保护内皮细胞、抑制平滑肌细胞分裂和增殖及血小板聚集粘附〔2〕。络活喜为二氢吡啶类CAs，具有高分布容积特性，能够在组织中达到高浓度，且与钙通道的结合与解离都比较缓慢〔3〕。本实验结果与有关报道基本一致。
, http://www.100md.com
NO作为一个新近发现的信使分子，其生理及病理作用尤其是抗As损伤作用受到极大重视并得到实验证实。有人用动物实验证实长期喂养合成NO的前体物质—L-精氨酸能明显对抗高脂血症诱导的As损伤作用；亦有人发现冠心病患者冠状动脉常发生痉挛、收缩，这与内皮依赖性舒张功能障碍有关，用乙酰胆碱滴入发生As的冠状动脉内反而引起收缩是由于NO释放减少或/和灭活增加的缘故。本实验中Ⅱ组血清NO水平低于Ⅰ组(P<0.01)，且组织学观察As改变严重，说明高脂血症诱发As损伤，使NO释放减少，与有关报道一致。
本实验中一个有趣的现象是Ⅲ组组织学改变与Ⅰ组基本一致，较Ⅱ组轻，而NO水平最低，与Ⅰ、Ⅱ组比较有显著性差异(P<0.01)，其发生机制可能有以下两方面。
首先NO的合成过程中是以L-精氨酸为底物，在一氧化氮合成酶(NOS)作用下，钙调蛋白/Ca2+参与生成L-胍氨酸及NO。NOS有结构型(cNOS)和诱生型(iNOS)两种。cNOS主要存在于血管内皮细胞及中枢等组织中，维持内皮舒张功能及抗As损伤作用主要是通过cNOS途径产生的NO，而iNOS途径多在炎症等病理过程中发挥作用〔4〕，且cNOS氨基酸序列上有钙调蛋白蛋白结合位点〔5〕。Mager等〔6〕实验证实鼠脑突触NOS以Ca2+浓度依赖方式使之激活，使L-精氨酸生成L-胍氨酸和NO，在NOS活化所需的Ca2+浓度则cGMP形成被明显抑制。络活喜阻滞细胞Ca2+通道，影响细胞内Ca2+水平，从而影响作为NO合成限速因子的cNOS活性，使NO合成减少，降低血清NO水平。
, http://www.100md.com
其次，启动cNOS的两种主要因素是血液的脉冲式流动和血流对血管的切应力，其它物质如乙酰胆碱、ATP、Ca2+激动剂、血流加速等刺激都能引起血管内皮细胞的NO短暂释放〔9〕。NO通过细胞内cGMP干扰钙的利用，发挥维持血管张力和调节血压、抑制血小板粘附聚集、抑制白细胞趋化性、抑制平滑肌细胞增殖等作用〔7〕。而络活喜作为二氢吡啶类CAs的一种，亦具有降低血管张力、抑制血小板粘附聚集等作用，可能在其发挥药理作用的同时，通过反馈机制降低cNOS的基因表达，减弱引起NO释放的启动刺激因素，从而减少NO释放，降低血清NO水平。
综上所述，笔者认为高胆固醇饲养可引起大鼠高脂血症，从而诱发大鼠As损伤改变，使血清NO水平降低；络活喜可拮抗大鼠高脂血症诱发的As损伤作用，同时可通过多种途径直接或间接地减少NO的合成、释放，降低血清NO水平。进而推论出络活喜具有独立的抗As损伤作用途径，而不是通过L-精氨酰-一氧化氮途径发挥其药理作用，这一点在As的预防及治疗中应引起足够重视。
, 百拇医药
参考文献
1 李恩民，许丽艳，李 琳 et al.α-奈胺分光光度法检测血清中一氧化氮含量.分析化学，1995；23(8)：979
2 Henrg PD，Beutley KI.Supperssion of arherogeresis in cholostterelfed rubbit treated with nifedipine.J Clin Invest，1981；68：1366
3 Roger Burges MA，Miched GD.Pharmacologic profile of amlodpine.Am J Cardiel，1989；64：101
4 Hope BT，Micheal GJ,Konigge KM et al.Neuronal NADP diaphorase in a mitric oxide synthase.Proc Natl Acad Sci USA，1991；88：2 811
, http://www.100md.com
5 Bredt DS，Hwang FM，Clatt CE et al.Cloned and expressed nitric oxide synthase stractrually resemble cytochrome P-450 reductase.Natrup，1991；351：714
6 Mager B,Klat P，Bolme E et al.Regalation of neuronal mitric oxide and cychit GMP formation by Ca2+.J Neurochem，1992；59(6)：2 204
7 Radomski MW，Palmer RMJ.Endogenons mitric oxide imhibits human platelet adbesion to vasular endothelium.Lanlet，1987；2：1 057
〔1997-11-12收稿〕, 百拇医药
单位：闫中政 贾志萍 李廷富(中国医科大学第一临床学院老年病教研室，沈阳110001)；王井全 胡 健(中国医科大学第一临床学院循环内科)；何 巍 本院药剂科
关键词：络活喜；一氧化氮；动脉粥样硬化
中国老年学杂志/990126 摘 要 将30只100 g左右雄性Wistar大鼠随机分成3组，每组10只。Ⅰ组：正常组；Ⅱ组：高胆固醇组；Ⅲ组：高胆固醇加络活喜组，分别喂养8 w。测定血清一氧化氮(NO)水平。Ⅰ组最高，Ⅱ组次之，Ⅲ组最低，差异非常显著(P<0.01)。电镜下观察到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组基本一致，细胞形态结构基本正常；Ⅱ组内皮细胞排列不规则，内皮细胞间隙增大，可见泡沫细胞浸入。说明络活喜有独立的抗动脉粥样硬化损伤作用，并可同时影响血清NO水平。
钙离子拮抗剂(CAs)能减少甚至完全消退动脉粥样硬化(As)改变，已被大量临床研究和动物实验所证实；而新近发现的新型信使分子一氧化氮(NO)，作为内皮源性松弛因子，在抗As损伤中的作用已引起极大重视，被认为NO可能中止或防止As斑块的形成和生长。而CAs对As损伤中血清NO水平的影响尚未见报道。本文旨在研究作为CAs一种的络活喜对As大鼠血清NO水平的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 动物模型 选取重约100 g的雄性Wistar大鼠30只(由中国医科大学实验动物部提供)，随机分为3组，每组10只，单组分笼饲养。Ⅰ组：空白对照组，饲以常规鼠料8 w，饮水不限。Ⅱ组：实验对照组，每只饲以常规鼠料加胆固醇粉末0.1 g/d，8 w，饮水不限。Ⅲ组：实验组，每只饲以常规鼠料加胆固醇粉末0.1 g/d，同时每只予络活喜(Amlodipine)0.75 mg/d，灌胃8 w，饮水不限。
1.2 实验药品及仪器 胆固醇：Sigma(美国)沈阳分装；络活喜：大连辉瑞制药有限公司生产；α-奈胺盐酸盐：国防化学院化工厂；对氨基苯磺酸：北京西中化工厂；氢氧化铝凝胶：用1M硫酸铝及6 M氢氧化钠溶液等体积混合，搅拌均匀，800 r/min离心5 min，去上清，沉淀用去离子水洗涤2次制成。260分光光度仪：日本岛津；JME-1200EX透射电镜：日本岛津；光镜及照像装置：日本尼康公司；旋涡混匀器：上海医疗器械厂；超速离心机：上海医疗器械厂。
, 百拇医药
1.3 实验步骤及方法 Wistar大鼠3组分笼饲养8 w后，颈静脉切开取血做血清学测定：血清NO水平测定参照α-奈胺分光光度法〔1〕；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)分别采用上海长征科学有限公司的甘油三酯试剂盒、酶法单瓶胆固醇试剂、高密度脂蛋白试剂。
处死大鼠后取左锁骨下动脉起始部至髂动脉分叉处主动脉作组织学观察。
1.4 统计学处理 所有数据均用
±s表示，组间结果显著性差异比较用t检验。2 结 果
血清学指标如表1所示。
表1 各组血清TG、TC、HDL及NO水平(
±s) 组别, http://www.100md.com
TG(mg/L)
TC(mg/L)
HDL(mg/L)
NO(μM)
Ⅰ
1.23±0.19
5.32±0.24
2.97±0.21
30.82±4.13
Ⅱ
2.37±0.262)
7.29±0.291)
, 百拇医药
4.68±0.301)
21.64±0.901)
Ⅲ
2.47±0.311)
6.90±0.181)
4.57±0.241)
13.67±4.821)2)
1)与Ⅰ组比较有非常显著性差异(P<0.01)，2)与Ⅱ组比较有非常显著性差异(P<0.01)
Ⅱ、Ⅲ组TG、TC、HDL均显著高于Ⅰ组(P<0.01)，Ⅱ组与Ⅲ组无显著性差异(P>0.05)；提高高胆固醇饲养可使大鼠血TG、TC、HDL升高，络活喜不能降低血脂；血清NO水平3组间均有显著性差异(P<0.01)，其中以Ⅰ组最高，Ⅱ组次之，Ⅲ组最低。
, http://www.100md.com
组织学检查结果：Ⅰ组与Ⅲ组基本一致，光镜下内膜光滑平整，内皮细胞排列整齐、平整，电镜下细胞形态结构基本正常；Ⅱ组光可见明显胆固醇沉积斑块，内皮细胞形成不规则，平滑肌细胞排列紊乱，电镜下见内皮细胞间连接间隙增大，泡沫细胞侵入内皮细胞间隙，平滑肌细胞胞浆可见较多的小脂质空泡及大量溶酶体，提示高胆固醇饲养可诱发大鼠As损伤，络活喜可拮抗这种损伤作用。
3 讨 论
As是一个缓慢的病理过程，其基本特征是脂质、蛋白多糖、钙及血液中有形成份在动脉壁局部累积，从而引起一系列损伤改变。
有关CAs抗As损伤作用已有大量报道，其机制普遍认为CAs不影响血清总胆固醇含量，主要是通过降低LDL在动脉壁的沉积和增加HDL含量来发挥作用；其次是通过脂质过氧化损伤并保护内皮细胞、抑制平滑肌细胞分裂和增殖及血小板聚集粘附〔2〕。络活喜为二氢吡啶类CAs，具有高分布容积特性，能够在组织中达到高浓度，且与钙通道的结合与解离都比较缓慢〔3〕。本实验结果与有关报道基本一致。
, http://www.100md.com
NO作为一个新近发现的信使分子，其生理及病理作用尤其是抗As损伤作用受到极大重视并得到实验证实。有人用动物实验证实长期喂养合成NO的前体物质—L-精氨酸能明显对抗高脂血症诱导的As损伤作用；亦有人发现冠心病患者冠状动脉常发生痉挛、收缩，这与内皮依赖性舒张功能障碍有关，用乙酰胆碱滴入发生As的冠状动脉内反而引起收缩是由于NO释放减少或/和灭活增加的缘故。本实验中Ⅱ组血清NO水平低于Ⅰ组(P<0.01)，且组织学观察As改变严重，说明高脂血症诱发As损伤，使NO释放减少，与有关报道一致。
本实验中一个有趣的现象是Ⅲ组组织学改变与Ⅰ组基本一致，较Ⅱ组轻，而NO水平最低，与Ⅰ、Ⅱ组比较有显著性差异(P<0.01)，其发生机制可能有以下两方面。
首先NO的合成过程中是以L-精氨酸为底物，在一氧化氮合成酶(NOS)作用下，钙调蛋白/Ca2+参与生成L-胍氨酸及NO。NOS有结构型(cNOS)和诱生型(iNOS)两种。cNOS主要存在于血管内皮细胞及中枢等组织中，维持内皮舒张功能及抗As损伤作用主要是通过cNOS途径产生的NO，而iNOS途径多在炎症等病理过程中发挥作用〔4〕，且cNOS氨基酸序列上有钙调蛋白蛋白结合位点〔5〕。Mager等〔6〕实验证实鼠脑突触NOS以Ca2+浓度依赖方式使之激活，使L-精氨酸生成L-胍氨酸和NO，在NOS活化所需的Ca2+浓度则cGMP形成被明显抑制。络活喜阻滞细胞Ca2+通道，影响细胞内Ca2+水平，从而影响作为NO合成限速因子的cNOS活性，使NO合成减少，降低血清NO水平。
, http://www.100md.com
其次，启动cNOS的两种主要因素是血液的脉冲式流动和血流对血管的切应力，其它物质如乙酰胆碱、ATP、Ca2+激动剂、血流加速等刺激都能引起血管内皮细胞的NO短暂释放〔9〕。NO通过细胞内cGMP干扰钙的利用，发挥维持血管张力和调节血压、抑制血小板粘附聚集、抑制白细胞趋化性、抑制平滑肌细胞增殖等作用〔7〕。而络活喜作为二氢吡啶类CAs的一种，亦具有降低血管张力、抑制血小板粘附聚集等作用，可能在其发挥药理作用的同时，通过反馈机制降低cNOS的基因表达，减弱引起NO释放的启动刺激因素，从而减少NO释放，降低血清NO水平。
综上所述，笔者认为高胆固醇饲养可引起大鼠高脂血症，从而诱发大鼠As损伤改变，使血清NO水平降低；络活喜可拮抗大鼠高脂血症诱发的As损伤作用，同时可通过多种途径直接或间接地减少NO的合成、释放，降低血清NO水平。进而推论出络活喜具有独立的抗As损伤作用途径，而不是通过L-精氨酰-一氧化氮途径发挥其药理作用，这一点在As的预防及治疗中应引起足够重视。
, 百拇医药
参考文献
1 李恩民，许丽艳，李 琳 et al.α-奈胺分光光度法检测血清中一氧化氮含量.分析化学，1995；23(8)：979
2 Henrg PD，Beutley KI.Supperssion of arherogeresis in cholostterelfed rubbit treated with nifedipine.J Clin Invest，1981；68：1366
3 Roger Burges MA，Miched GD.Pharmacologic profile of amlodpine.Am J Cardiel，1989；64：101
4 Hope BT，Micheal GJ,Konigge KM et al.Neuronal NADP diaphorase in a mitric oxide synthase.Proc Natl Acad Sci USA，1991；88：2 811
, http://www.100md.com
5 Bredt DS，Hwang FM，Clatt CE et al.Cloned and expressed nitric oxide synthase stractrually resemble cytochrome P-450 reductase.Natrup，1991；351：714
6 Mager B,Klat P，Bolme E et al.Regalation of neuronal mitric oxide and cychit GMP formation by Ca2+.J Neurochem，1992；59(6)：2 204
7 Radomski MW，Palmer RMJ.Endogenons mitric oxide imhibits human platelet adbesion to vasular endothelium.Lanlet，1987；2：1 057
〔1997-11-12收稿〕, 百拇医药