膀胱癌PCNA的表达及意义
作者：陈志文 熊恩庆 孙光 马腾骧 张淑敏
单位：陈志文 熊恩庆 孙光 第三军医大学西南医院泌尿外科 400038； 马腾骧 张淑敏 天津泌尿外科研究所 300211
关键词：增型细胞核抗原；膀胱癌；免疫组织化学；预后
重庆医学990109
摘要 用免疫组化方法检测60例膀胱移行细胞癌增殖细胞核抗原(PCNA)，在肿瘤G1，G2，G3级细胞中的指数分别为：2.4±3.9%；9.5±13.0%；54.8±29.3%。G3级显著高于G1与G3级(P<0.01)。浸润性肿瘤(T2-T4)52.1±35.1%显著高于表浅性肿瘤(Ta-T1)18±23.4%(P<0.01)。将所有肿瘤平均指数30.4±32.3%分为PCNA<30.4和>30.4两组，通过生存分析表明：PCNA指数较高组与较低组相比有不良的预后，提示PCNA指数为TCC侵袭性生物学行为和预后提供了量化的参数。
, http://www.100md.com
Significan of Expression of PCNA in Transitional Cell Carcinoma of Bladder
Chen ZhiWen et al,Chongqing 400038
Abstruct Immunohistochemical expression of PCNA was assessed in 60 patients with TCC followed for,5 years.The PCNA indexes in G1,G2 and G3 tumors were 2.4±13.9%；9.5±13.0%and54.8±29.3% respectively. The index in G3 was higher than that in G1 and in G2 (P<0.01),The index in invasive tumors(T2-T4) was higher than that in superficial tumors(Ta-T1)(P<0.01).TCCB could be divided into the group with lower proliferated activity and the group with higher proliferated activity according to the average PCNA index.The survival analysis indicated that the group with higher PCNA index had a poor clinical outcome (P<0.01) and suggested that the PCNA index could be regarded as an useful prognostic parameter in TCCB.
, 百拇医药
Keyword proliferating cell nuclear antigen, bladder cancer,immuno chemistry, prognosis.
增殖细胞核抗原是一种非组蛋白性核蛋白，在静止期细胞中增殖细胞核抗原PCNA含量极少，在正常增殖细胞和转化细胞中表达增加，该蛋白与细胞增殖和DNA合成有关，可反映肿瘤细胞增殖程度，近年来被用于临床肿瘤的生物学行为与预后的评估。
材料与方法
1 标本来源与临床资料
将我院泌尿外科1975～1994年经手术证实，随访资料较为完整的60例膀胱移行细胞癌患者作为研究对象，男51例，女9例，年龄27～74岁，平均52岁，标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。手术前未经放化疗，临床分期按UICC.TNM标准，表浅肿瘤Ta-T1期38例；浸润性肿瘤T2-T4期22例。病理分级按WHO分级法。G1∶5例，G2∶19例，G3∶36例。随访情况：2例随访时间为2年，均死亡，其余病例随访均超过5年，34例存活，26例死亡，所有死亡均发生不同部位癌转移，每份标本切5um厚切片2份，一份行H.E染色，由一名经验丰富病理医师随机盲法观察，核定分级分期。
, 百拇医药
2 试剂与免疫组化方法
抗PCNA抗体(Santa Cruz公司产品)S-P试剂盒购自北京中山生物技术公司。具体步骤：常规二甲苯脱蜡、水化，0.3%甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化酶30分钟，10%正常兔血清封闭非特异性抗原室温20分钟，依次加入一抗(PCNA 1∶100)4度过液，二抗(1∶100)37度10分钟，三抗(1∶100)37度10分钟，以上各步骤间均用TBS振洗3次，每次5分钟，DAB显色3分钟，苏木素复染，氨水返蓝，常规二甲苯，丙酮透明，树酯封片，用TBS替代一抗作空白阴性对照，已知膀胱腺癌阳性片作阳性对照：400倍显微镜随机选择视野(膀胱癌组织)，观察1000个癌细胞，计数阳性染色数量，计算出每张切片PCNA指数。
3 统计学方法
PCNA在各级期中的平均指数用t检验，作Kaplan-Meier生存曲线；累积生存率比较用log-rank时序检验；P<0.05为显著性差异。
, 百拇医药
结果
PCNA阳性染色为细胞核内染成棕红色，与胞浆界限清晰，在G1，G2，G3级肿瘤及不同临床分期中的分布见表1，G1与G2级PCNA指数无显著差异(P>0.05)；而G3级肿瘤指数显著高于G1与G2级肿瘤(P<0.01)，浸润性癌的PCNA指数高于表浅性癌(P<0.01)。
表1 PCNA在不同期级中的表达指数 分类
病例数
PCNA指数(%)
P值
分级
G1
5
, http://www.100md.com
2.40±3.28
>0.05
G2
19
9.50±13.40
G3
36
54.75±29.30
<0.01
分期
Ta-T1
38
, http://www.100md.com
18.00±23.40
T2-T4
22
52.08±35.12
<0.01
将所有病例平均指数30.4±32.3%分为A组：<30.4；B组：>30.4。A组33例，B组27例，用Kaplan-Meier方法作5年生存率比较，见图1，A组生存率明显高于B组(P<0.01)。
图1 高增殖活性组与低增殖活性组的5年生存率比较
讨论
, 百拇医药
增殖细胞核抗原PCNA在人类基因组中属高保守基因，定位于第20对染色体。由6个外显子和5个内含子构成，mRNA长度1.3kb，其编码的蛋白为酸性核蛋白，分子量36KD，半衰期20小时。在细胞增殖周期中，PCNA在G1晚期表达幅度增加，至S期表达到达高峰，G2及M期表达下降。Celis[2]等人发现PCNA表达量的变化与DNA合成同步；双向蛋白电泳表明PCNA与细胞周期素Cyclin属同一蛋白，与P21蛋白共同参与构成CyclinD-CDK四聚体复合物，从而参与细胞周期的调控。已经证实PCNA是DNA聚合酶delta的辅助蛋白，具有促进该酶延伸的DNA先导链的能力[1]。因此PCNA/Cyclin在DNA合成与细胞增殖的始动过程中充当重要角色，PCNA直接反映着细胞的增殖活性。
人类膀胱移行细胞癌具有人类恶性肿瘤分化受阻，增殖无限的共性，而且具有生物学行为差异大的特点，因此对于肿瘤进展的判定预测具有重要的临床意义。我们用抗PCNA抗体检测60例移行细胞癌石蜡组织切片，发现随着病理分级的增高，PCNA依次增高；分化差的肿瘤组织G3级显著高于分化较高的G1与G2级肿瘤；浸润性肿瘤(T2-T4)高于表浅性肿瘤(Ta-T1)与Lipponen[3]和Hattori[4]的报告基本一致，而且随着期级的增高，各指数的变异也呈增高趋势。这不能排除不同视野差异的影响，但是同一肿瘤组织不同部位也存在不同的亚克隆瘤细胞，产生不同级别的分化，随着不同期级PCNA指数标准差的递增，从细胞增殖活力方面反映了肿瘤的异质性(heterogeneity)的增加，将所有病例按平均PCNA指数分为高增殖活性与低增殖活性两组，5年累计生存率高增殖活性组低于低增殖活性组(P<0.01)。表明PCNA指数增高的肿瘤具有恶性的生物学行为和不良的临床预后。
, http://www.100md.com
作为细胞增殖活力学信息的参数之一，PCNA与其它增殖信息如Ki67，AgNORs核形态学参数有很好的相关性[5]，Ki67仅限于检测新鲜组织；核形态学能测出DNA含量，却不能反映具体细胞周期；FCM虽能大量快速分析细胞，却由于实体瘤分离困难，细胞成分复杂，影响数据的准确性，PCNA与S期DNA复制位点形成稳定复合物，具有较长的半衰期，PCNA阳性直接反映了增殖活性的S期，敏感，直观；且在石蜡切片上操作，便于大量，快速回顾性分析。此外，Hiroaki[6]发现在TCC中PCNA与P53的表达具有显著相关性，不仅随着肿瘤遗传不稳定性(genetic instability)的增加而表达增强，而且在P53低表达而PCNA高表达的TCC中表现出不良的临床结局。因此在高遗传不稳定肿瘤中，细胞增殖活性增加在TCC进展中起重要作用。
PCNA标志着细胞的增殖状态，在良性的增殖细胞中也有量的变化[7]，而且受其它生长因子及其受体的调控[8]。但对于已确诊的TCC，PCNA的变化具有重要的临床价值，高增殖活性细胞一般对放化疗较为敏感，因而疗效明显；高增殖活性肿瘤具有不良的预后，通过观察治疗前后PCNA指数的变化，不仅能指导治疗策略，而且对肿瘤的进展起到监测作用。
, http://www.100md.com
参考文献：
1 Mathews MB.et al Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin.Nature.1984;303:374-6
2 Celis J E.Celis.A.Cell cycle-dependent variations in the distribution of the nuclear protein cyclin proliferating cell nuclear antigen in cultured cells: subdivison of S-phase.Pro Natl Acad Sc:USA 1985;82:362-6
3 Lipponen PK.Eskelinen MJ.Cell Proliferation of transitonal cell bladder tumors determined by PCNA/cyclin immunostaining and its prognostic value.Br J Cancer 1992;66:171-6
, 百拇医药
4 K.Hattori.K et al Proliferating cell nucear antigen cyclin in human tansitional cell carcinoma.Br J Uol.1995;75:162-166
5 S.Kruger h.Muller Correlation of morphomerty,nuclear organizer regions,proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen exprellion with grading and staging in urinary bladder carciomas Br J Urol.1995;75:480-484
6 Hiroaki Shiina et al Relationship of genetic instability with immunoreactivities for P53 protein and proliferating cell nuclear antigen in transitional cell carcinoma of the bladder.Eur Urol.1996;30:80-88
7 H.Tanaka.M.et al Assesment of germ cell kinetics in the testes of patients with varicocele using image analysis of immunostained prloiferating cell nuclear antigen.Br J Urol 1996;78:769-771
8 Mccornick d,Hall PA.The complexities of proliferating cell nuclear antigen.Histopatholgy 1992;21:591-4., 百拇医药
单位：陈志文 熊恩庆 孙光 第三军医大学西南医院泌尿外科 400038； 马腾骧 张淑敏 天津泌尿外科研究所 300211
关键词：增型细胞核抗原；膀胱癌；免疫组织化学；预后
重庆医学990109
摘要 用免疫组化方法检测60例膀胱移行细胞癌增殖细胞核抗原(PCNA)，在肿瘤G1，G2，G3级细胞中的指数分别为：2.4±3.9%；9.5±13.0%；54.8±29.3%。G3级显著高于G1与G3级(P<0.01)。浸润性肿瘤(T2-T4)52.1±35.1%显著高于表浅性肿瘤(Ta-T1)18±23.4%(P<0.01)。将所有肿瘤平均指数30.4±32.3%分为PCNA<30.4和>30.4两组，通过生存分析表明：PCNA指数较高组与较低组相比有不良的预后，提示PCNA指数为TCC侵袭性生物学行为和预后提供了量化的参数。
, http://www.100md.com
Significan of Expression of PCNA in Transitional Cell Carcinoma of Bladder
Chen ZhiWen et al,Chongqing 400038
Abstruct Immunohistochemical expression of PCNA was assessed in 60 patients with TCC followed for,5 years.The PCNA indexes in G1,G2 and G3 tumors were 2.4±13.9%；9.5±13.0%and54.8±29.3% respectively. The index in G3 was higher than that in G1 and in G2 (P<0.01),The index in invasive tumors(T2-T4) was higher than that in superficial tumors(Ta-T1)(P<0.01).TCCB could be divided into the group with lower proliferated activity and the group with higher proliferated activity according to the average PCNA index.The survival analysis indicated that the group with higher PCNA index had a poor clinical outcome (P<0.01) and suggested that the PCNA index could be regarded as an useful prognostic parameter in TCCB.
, 百拇医药
Keyword proliferating cell nuclear antigen, bladder cancer,immuno chemistry, prognosis.
增殖细胞核抗原是一种非组蛋白性核蛋白，在静止期细胞中增殖细胞核抗原PCNA含量极少，在正常增殖细胞和转化细胞中表达增加，该蛋白与细胞增殖和DNA合成有关，可反映肿瘤细胞增殖程度，近年来被用于临床肿瘤的生物学行为与预后的评估。
材料与方法
1 标本来源与临床资料
将我院泌尿外科1975～1994年经手术证实，随访资料较为完整的60例膀胱移行细胞癌患者作为研究对象，男51例，女9例，年龄27～74岁，平均52岁，标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。手术前未经放化疗，临床分期按UICC.TNM标准，表浅肿瘤Ta-T1期38例；浸润性肿瘤T2-T4期22例。病理分级按WHO分级法。G1∶5例，G2∶19例，G3∶36例。随访情况：2例随访时间为2年，均死亡，其余病例随访均超过5年，34例存活，26例死亡，所有死亡均发生不同部位癌转移，每份标本切5um厚切片2份，一份行H.E染色，由一名经验丰富病理医师随机盲法观察，核定分级分期。
, 百拇医药
2 试剂与免疫组化方法
抗PCNA抗体(Santa Cruz公司产品)S-P试剂盒购自北京中山生物技术公司。具体步骤：常规二甲苯脱蜡、水化，0.3%甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化酶30分钟，10%正常兔血清封闭非特异性抗原室温20分钟，依次加入一抗(PCNA 1∶100)4度过液，二抗(1∶100)37度10分钟，三抗(1∶100)37度10分钟，以上各步骤间均用TBS振洗3次，每次5分钟，DAB显色3分钟，苏木素复染，氨水返蓝，常规二甲苯，丙酮透明，树酯封片，用TBS替代一抗作空白阴性对照，已知膀胱腺癌阳性片作阳性对照：400倍显微镜随机选择视野(膀胱癌组织)，观察1000个癌细胞，计数阳性染色数量，计算出每张切片PCNA指数。
3 统计学方法
PCNA在各级期中的平均指数用t检验，作Kaplan-Meier生存曲线；累积生存率比较用log-rank时序检验；P<0.05为显著性差异。
, 百拇医药
结果
PCNA阳性染色为细胞核内染成棕红色，与胞浆界限清晰，在G1，G2，G3级肿瘤及不同临床分期中的分布见表1，G1与G2级PCNA指数无显著差异(P>0.05)；而G3级肿瘤指数显著高于G1与G2级肿瘤(P<0.01)，浸润性癌的PCNA指数高于表浅性癌(P<0.01)。
表1 PCNA在不同期级中的表达指数 分类
病例数
PCNA指数(%)
P值
分级
G1
5
, http://www.100md.com
2.40±3.28
>0.05
G2
19
9.50±13.40
G3
36
54.75±29.30
<0.01
分期
Ta-T1
38
, http://www.100md.com
18.00±23.40
T2-T4
22
52.08±35.12
<0.01
将所有病例平均指数30.4±32.3%分为A组：<30.4；B组：>30.4。A组33例，B组27例，用Kaplan-Meier方法作5年生存率比较，见图1，A组生存率明显高于B组(P<0.01)。
图1 高增殖活性组与低增殖活性组的5年生存率比较
讨论
, 百拇医药
增殖细胞核抗原PCNA在人类基因组中属高保守基因，定位于第20对染色体。由6个外显子和5个内含子构成，mRNA长度1.3kb，其编码的蛋白为酸性核蛋白，分子量36KD，半衰期20小时。在细胞增殖周期中，PCNA在G1晚期表达幅度增加，至S期表达到达高峰，G2及M期表达下降。Celis[2]等人发现PCNA表达量的变化与DNA合成同步；双向蛋白电泳表明PCNA与细胞周期素Cyclin属同一蛋白，与P21蛋白共同参与构成CyclinD-CDK四聚体复合物，从而参与细胞周期的调控。已经证实PCNA是DNA聚合酶delta的辅助蛋白，具有促进该酶延伸的DNA先导链的能力[1]。因此PCNA/Cyclin在DNA合成与细胞增殖的始动过程中充当重要角色，PCNA直接反映着细胞的增殖活性。
人类膀胱移行细胞癌具有人类恶性肿瘤分化受阻，增殖无限的共性，而且具有生物学行为差异大的特点，因此对于肿瘤进展的判定预测具有重要的临床意义。我们用抗PCNA抗体检测60例移行细胞癌石蜡组织切片，发现随着病理分级的增高，PCNA依次增高；分化差的肿瘤组织G3级显著高于分化较高的G1与G2级肿瘤；浸润性肿瘤(T2-T4)高于表浅性肿瘤(Ta-T1)与Lipponen[3]和Hattori[4]的报告基本一致，而且随着期级的增高，各指数的变异也呈增高趋势。这不能排除不同视野差异的影响，但是同一肿瘤组织不同部位也存在不同的亚克隆瘤细胞，产生不同级别的分化，随着不同期级PCNA指数标准差的递增，从细胞增殖活力方面反映了肿瘤的异质性(heterogeneity)的增加，将所有病例按平均PCNA指数分为高增殖活性与低增殖活性两组，5年累计生存率高增殖活性组低于低增殖活性组(P<0.01)。表明PCNA指数增高的肿瘤具有恶性的生物学行为和不良的临床预后。
, http://www.100md.com
作为细胞增殖活力学信息的参数之一，PCNA与其它增殖信息如Ki67，AgNORs核形态学参数有很好的相关性[5]，Ki67仅限于检测新鲜组织；核形态学能测出DNA含量，却不能反映具体细胞周期；FCM虽能大量快速分析细胞，却由于实体瘤分离困难，细胞成分复杂，影响数据的准确性，PCNA与S期DNA复制位点形成稳定复合物，具有较长的半衰期，PCNA阳性直接反映了增殖活性的S期，敏感，直观；且在石蜡切片上操作，便于大量，快速回顾性分析。此外，Hiroaki[6]发现在TCC中PCNA与P53的表达具有显著相关性，不仅随着肿瘤遗传不稳定性(genetic instability)的增加而表达增强，而且在P53低表达而PCNA高表达的TCC中表现出不良的临床结局。因此在高遗传不稳定肿瘤中，细胞增殖活性增加在TCC进展中起重要作用。
PCNA标志着细胞的增殖状态，在良性的增殖细胞中也有量的变化[7]，而且受其它生长因子及其受体的调控[8]。但对于已确诊的TCC，PCNA的变化具有重要的临床价值，高增殖活性细胞一般对放化疗较为敏感，因而疗效明显；高增殖活性肿瘤具有不良的预后，通过观察治疗前后PCNA指数的变化，不仅能指导治疗策略，而且对肿瘤的进展起到监测作用。
, http://www.100md.com
参考文献：
1 Mathews MB.et al Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin.Nature.1984;303:374-6
2 Celis J E.Celis.A.Cell cycle-dependent variations in the distribution of the nuclear protein cyclin proliferating cell nuclear antigen in cultured cells: subdivison of S-phase.Pro Natl Acad Sc:USA 1985;82:362-6
3 Lipponen PK.Eskelinen MJ.Cell Proliferation of transitonal cell bladder tumors determined by PCNA/cyclin immunostaining and its prognostic value.Br J Cancer 1992;66:171-6
, 百拇医药
4 K.Hattori.K et al Proliferating cell nucear antigen cyclin in human tansitional cell carcinoma.Br J Uol.1995;75:162-166
5 S.Kruger h.Muller Correlation of morphomerty,nuclear organizer regions,proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen exprellion with grading and staging in urinary bladder carciomas Br J Urol.1995;75:480-484
6 Hiroaki Shiina et al Relationship of genetic instability with immunoreactivities for P53 protein and proliferating cell nuclear antigen in transitional cell carcinoma of the bladder.Eur Urol.1996;30:80-88
7 H.Tanaka.M.et al Assesment of germ cell kinetics in the testes of patients with varicocele using image analysis of immunostained prloiferating cell nuclear antigen.Br J Urol 1996;78:769-771
8 Mccornick d,Hall PA.The complexities of proliferating cell nuclear antigen.Histopatholgy 1992;21:591-4., 百拇医药