死去还是生还：凋亡及其在疾病中的作用
作者：陈永亮
单位：
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临床放射学杂志990306To Die or Not to Die
An Overview of Apoptosis and Its Role in Disease
在人体和其他多细胞生物体组织中，细胞的死亡并不总是异常的，亦非总是有害的。虽然死亡可发生于大量细胞损伤的部位，但机体大多数细胞的死亡是通过一种更轻微的、非炎症的、依赖能量的、称之为凋亡的细胞死亡形式进行的。组织中的细胞数量取决于新细胞增殖和衰老细胞死亡之间的平衡。增殖和凋亡的速率在各组织间有很大区别。近来对凋亡的分子机理研究显示，凋亡是一个遗传性的程序性过程。当细胞凋亡的组成成分发生突变或出现数量异常时，此过程可受到干扰。凋亡的失调与很多疾病的发病机理有关，包括癌症、神经变性、自身免疫、心脏疾病和其他一些疾病。涉及凋亡调节和执行的基因产物对于疾病诊断和介入治疗是极具潜力的研究方向，它们使许多疾病的治愈和治疗获得新的希望。
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过去25年来，对组织学、遗传学和分子生物学的辛勤研究显示，事实上所有动物细胞都具有用于自杀的遗传成分。在正常生理情况下，为了整个生物体的更大利益，受伤或衰老的细胞通过被称为凋亡的一种遗传的程序性细胞死亡方式牺牲自己。就象其他生理系统一样，机体的细胞数量服从于内环境稳定的需要，多细胞生物体的细胞数量等于细胞增殖率减去细胞清除率。尽管早已知道细胞的过度增殖导致新生物，而细胞的增殖不足则导致机体发育不全， 但是直到最近才明确遗传的程序性细胞死亡的调节紊乱同样可引起疾病和畸形。
本综述首先明确细胞死亡的两个主要形式(坏死和凋亡)，随后叙述有关已明确的新杆状线虫(Caenorhabditis elegans)的凋亡基因，最后讨论人体细胞分子凋亡调节和执行的现状。开始的部分可为了解凋亡在疾病中越来越明显的作用和将来以凋亡为基础的临床诊断、预后和治疗的潜在作用提供科学背景。
细胞死亡的类型
坏死
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多细胞生物体的细胞一般通过2种特有方式中的1种死亡，这取决于死亡的环境和原因(附表)。坏死发生于急性的、非生理性的损伤(即在发生缺血的梗死组织中心或在毒素作用的部位)。坏死细胞肿胀和溶解，释放其细胞浆和细胞核内容物到细胞间基质中，并发生炎症。虽然在急性炎症和一些严重的炎性反应坏死是重要的，但是它并非细胞死亡的正常机制。在本世纪70年代初以前，坏死一直被认定为细胞死亡的仅有形式，而且使细胞死亡似乎是非生理的和有害的事情。
附表 凋亡和坏死主要特征* 特征
坏死
凋亡
刺激
毒素、严重缺氧、严重损伤
和缺乏ATP的情况
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无ATP缺乏的生理和病理情况
能量需求
不
依赖ATP
组织学
细胞肿胀、细胞器破裂、组织斑片状死亡
染色质浓缩、凋亡体、单一孤立的细胞死亡
DNA断裂类型
随机大小碎片
185个硷基对的多发性核体
内梯状碎片
浆膜
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溶解
完整、泡状，伴有分子变化
死亡细胞的吞噬
游走的吞噬细胞
邻近的细胞
组织反应
炎症
非炎症
*ATP代表5′-三磷酸腺苷
凋亡
1972年，Kerr1等发表了一篇描述凋亡(源于希腊词“凋落”)奇特生理过程的启蒙性文章。细胞经历凋亡的“细胞自杀”很快皱缩并失去它们正常的细胞间接触，继之表现出浓密的染色体凝聚，细胞核碎裂，细胞浆大疱形成，细胞碎裂成凋亡体。这些凋亡体很快被邻近的细胞或巨噬细胞吞噬和消化1-5。凋亡时由于没有细胞的固体内容物释放入细胞间基质中，所以不引发炎症反应。凋亡的发现是组织学上的一个伟大业绩：在由上百万个细胞组成的正常组织切片中，由于凋亡的形态序列改变能在不足一小时内完成，所以在特定的时间里仅有一小部分表现出凋亡结构改变的特点。
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凋亡时组织学改变的固定次序，导致人们认为凋亡是一种部分或全部由凋亡细胞自身引导的程序性细胞死亡。凋亡细胞的死亡是成人组织发育和内环境稳定所必须的。例如发育中的哺乳动物中枢神经系统(CNS)尤其易于凋亡，因为神经元的生成要比存活到成年的多得多，这或许是由于生长和生存因子数量有限(神经营养学说)，或是由于不能起到功能性的连接(活力学说)之故。在成年时，哺乳动物的CNS凋亡大大减少，但凋亡在其他组织却继续进行。例如，成熟粒细胞于周围循环仅存在1～2天就发生凋亡而被清除。凋亡在动物细胞也可被一系列其他引发剂激活，它们包括电离辐射、高温、病毒感染和免疫反应4-6。
线虫的记述：细胞死亡的遗传方式
凋亡的遗传学和分子机制最初是于80年代后期和90年代初期经过对新杆状线虫(C elegans)的研究而明确其特点的。在线虫的发育过程中，程序性细胞死亡是极其精确的和可预知的：特殊的基因被激活以杀灭确切的131个细胞，而在成年线虫留有959个细胞7。发育期间的凋亡被认为是细胞的一种正常归宿，就象最终被分化为肌肉和神经那样。
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线虫的研究揭示凋亡由4个连续步骤组成：(1)通过细胞外或细胞间的引发器约定死亡；(2)通过激活细胞内蛋白酶杀死细胞；(3)细胞的残骸被其他细胞吞噬；(4)细胞残骸在吞噬细胞的溶酶体内降解(图1A)8。这些阶段和控制它们的基因(在C elegans称为ced基因，控制细胞死亡的不正常)在从线虫到人类的整个动物的进化过程中是十分保守的(图1B)8-10。
图1 凋亡程序在进化中是保守的。A. 组织特异信号激活ced-4，后者激活ced-3，导致细胞死亡。如果激活，ced-9可通过抑制ced-4激活(也可能通过直接抑制ced-3)抑制凋亡，平箭头所示。B. 有很多因素约定哺乳动物的细胞死亡，但下游凋亡机制是保守的(线虫基因与哺乳动物凋亡基因的同系物在扩弧中显示)。箭头代表促进作用；平箭头为抑制作用
在C elegans，凋亡的执行需要基因ced-3和ced-4的蛋白产物11，而基因ced-9的产物则通过抑制ced-3和ced-4的活力防止凋亡(图1A)12。CED-3，一种半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(caspase)，是凋亡所必须的：当其被激活时，它裂解多种细胞蛋白，抑制一部分，激活另一部分。这些CED-3 caspase的死亡底物包括象多腺苷二磷酸核糖聚合酶、核膜的成分和负责切开凋亡细胞DNA的细胞核内酶这样的DNA修复酶。在细胞浆内caspases的激活与凋亡的形态改变特点有直接关系。无活力的caspases前体(procaspases)存在于所有细胞内，caspases的激活造成细胞间隔间的正常屏障受损，这样就导致细胞内损害而保留了浆膜的完整。
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CED-4起着CED-3上游的作用：CED-4接受一个死亡约定信号，随后与CED-3前体结合，使其释放活性CED-3。CED-9是一种位于线粒体外膜和其他细胞内膜上的多功能蛋白，它可与CED-4结合防止CED-3前体的激活，这可能是通过使CED-4和细胞浆的CED-3前体分开所致13-15。所以CED-3和CED-4诱导凋亡，而CED-9防止凋亡。
人类凋亡的分子机制
C elegans模式因其在进化中的保守性而与较高等的动物有关。哺乳动物凋亡的几个核心介质就象CED-3、CED-4和CED-9一样具有相似的分子形态和信号作用(图1和图2)。人类和其他哺乳动物比线虫更复杂；所以哺乳动物细胞凋亡的调节也更复杂，尤其是在约定凋亡的早期阶段，它涉及更多的信号分子。
图2 凋亡信号发放途径。约定死亡：死亡配体FasL与死亡受体Fas结合，开始细胞内信号发放；转接蛋白FADD(Fas相关的死亡结构域蛋白)与Fas和caspase-8(也称为FLICE，一个FADD样的白介素1β-转换酶)结合。执行：caspase-8的激活导致其他caspases的激活；caspases相互分裂无活性的caspase前体成有活性的caspases，扩增死亡信号发放；激活的caspases通过分裂多腺苷二磷酸核糖聚合酶、核片层和其他的细胞蛋白，并通过激活DNA碎片因子介导执行。凋亡信号发放的调整：在某些类型的细胞，细胞色素C由线粒体释放，激活凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)，也导致caspase的激活；Bcl-2家族成员可通过与Apaf-1和/或调节线粒体的渗透性来促进或抑制凋亡。箭头并不一定意味着直接的相互作用；新杆状线虫基因产物的同系物用灰色表示
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约定死亡
一些哺乳动物约定死亡的途径是多种多样的。例如，所有正常细胞对射线引发的DNA损伤的反应均为发放停止细胞周期信号，而一旦损伤被修复，细胞周期随即恢复，或由于损伤太严重而约定凋亡。其他约定死亡的信号途径仅存在于特殊类型的细胞和特定的时间。相对丰富的不同信号发放分子，通过激活凋亡和对抗凋亡途径的相对速度、强度和可能性，确定凋亡的阈值。有大量不同细胞死亡信号的优点是显而易见的：如果细胞死亡仅有一个信号，那么暴露于那个信号的细胞都将死亡。有多种不同的细胞死亡引发器，则可清除特殊部位的细胞而不附带周围其他细胞的清除。
细胞外的死亡配体和受体
在培养液中或机体内，于一个细胞周围的细胞外基质中，加入促死亡配体可特异地引发约定死亡。当细胞外的死亡配体与细胞表面的死亡受体结合时，受体的细胞内部分就改变形状并能结合到细胞浆的转接器蛋白(adaptor proteins)上(图2)16-18。受体-转接器复合物随即结合到下游的转接器蛋白，此蛋白能激活各种不同的caspases—CED-3的同系蛋白酶 ，它在哺乳动物起着死亡执行者的作用19-21。
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在死亡配体和受体如何主动地杀死体内特殊感染的或危险的细胞方面，免疫系统提供了极好的例子。正如图3A所示，当细胞毒T细胞(Tc细胞)上的T-细胞受体与存在于抗原呈递细胞的一类主要组织相容复合物上的外来肽结合时(一个病毒蛋白碎片)，即可诱导Tc细胞表面上的Fas 配体(FasL)蛋白的表达。然后FasL与Fas(一种存在于机体大多数细胞的细胞表面受体)结合，并激活Fas启动细胞内凋亡信号，以杀死受感染的抗原提呈细胞。相同的机制亦可保护机体免受有T-细胞受体缺陷的T淋巴细胞的伤害。这种T淋巴细胞可不适当地与自身抗原结合，就象它们是外来抗原一样(图3，B)22-25。正如所料，不能清除自身反应性T细胞可直接导致自身免疫性疾病。
图3 主动的和被动的杀灭途径。A.细胞毒T细胞(Tc细胞)用三种方法杀灭：Tc细胞上的Fas配体(FasL)与靶细胞上的Fas结合，诱导凋亡；Tc细胞脱颗粒，释放granzyme B和穿孔素，前者进入靶细胞直接激活caspases，后者能在靶细胞膜内形成孔，引起渗透性溶解。B.T细胞能被主动或被动地杀死。(1)周围的自身耐受性：如果一个T细胞的T-细胞受体与周围细胞自身-MHC I(一类主要组织相溶性复合物)上的自身肽密切结合，T细胞可被诱导表达FasL，除了Fas，还引起自身反应性T细胞互相残杀和预防自身免疫(B1经Nagata23同意已被调整)。(2)通过生存因子去除死亡：如果一个激活的T细胞(表达自白介素-2受体[IL-2R]失去白介素-2(IL-2)，它将经历凋亡，因为不履行(Default)死亡信号可被Bcl-2家族的抗凋亡成员抑制
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忽略所致死亡
去除抑制死亡(或促进生存)的配体亦可特异性地引发约定死亡。在这种死亡形式中，细胞由于缺乏来自细胞表面的生存因子受体的细胞浆信号而约定死亡。这种外源性信号的缺乏可使内源性的死亡程序结束细胞自身24-27。例如，激活的T淋巴细胞的生存有赖于可溶性蛋白质白介素2(IL-2)的存在，如去除了IL-2即发生凋亡(图3，B2)。无论凋亡始于死亡配体还是生存因子缺乏，均可激活相同的最后执行过程。
死亡执行：接合器、Caspases和死亡底物
哺乳动物细胞内有各种死亡约定信号可以激活中心执行者：caspase的级联放大(图1，B)。例如，Fas这样的细胞表面死亡受体被激活后，它们的胞浆尾足与FADD(Fas相关的死亡结构域蛋白)这样的接合器蛋白质结合(图2)17。然后，Fas-FADD复合物结合并激活caspase-821，激活的caspase-8则启动执行凋亡的致死性的蛋白分解级联。
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与新杆状线虫仅有一种CED-3 caspase不同，在人类细胞至少已分离出10种不同的caspases。在蛋白分解级联中激活的caspases使各自的前体裂解为成熟的、有活力的酶，这种级联放大与补体激活或血液凝固的过程相似23，28。就象在新杆状线虫一样，人类的死亡底物包括，涉及DNA修复和复制的胞浆和细胞核蛋白，RNA的缝接、细胞支架和细胞分裂23，28。一旦caspases被激活，随即发生凋亡的形态学改变，此消亡过程是不能停止的。
人类的CED-4同系物
就象新杆状线虫一样，人类亦有一个诱导凋亡的CED-4同系物。这种同系物被称为凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1)29。当线粒体的蛋白质细胞色素C与Apaf-1结合时，Apaf-1就能结合并激活caspase-3，进而启动caspase级联放大(图2)30。有趣的是Apaf-1也有一个结合5'-三磷酸腺苷的位置，这就可以解释何以一个受伤的细胞，在决定细胞是有足够能量通过凋亡死亡还是通过不耗能的坏死死亡时，ATP能量水平可能起一个关键的作用。最后，Apaf-1也可以与Bcl-2家族中的抗凋亡的CED-9同系物结合，它可将Apaf-1和caspase-3分离，从而抑制凋亡。
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Bcl-2家族与线粒体在凋亡中的不确定作用
Bcl-2家族是以发现的可通过抑制凋亡而引发肿瘤的B-细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)基因而命名的，它包括促进凋亡成员(即Bax和Bad)和抑制凋亡成员(即，Bcl-2和Bcl-xl)31-33。Bcl-2家族成员促进或抑制某些激发器诱导的凋亡，例如，生长因子可去除诱导的凋亡，但它们并不总是影响其他种类的死亡信号，象某些类型细胞的Fas 通道23-27，34。
Bcl-2家族成员促进或抑制凋亡的确切机制尚未确定。占主导地位的学说是，抗凋亡的类Bcl-2蛋白质可通过直接与Apaf-1接合，或通过防止线粒体释放细胞色素C和其他内容物，抑制caspase的激活，或者同时通过上述两种途径35，36。Bcl-2家族成员位于线粒体的外膜上，它们能以不同类型的配对结合相互连接(即Bcl-2：Bcl-2的同质二聚物或象Bcl-2：Bax的异质二聚物)，从而在线粒体膜上形成离子传导途径。抗凋亡的Bcl-2家族成员可形成使细胞器内电化学内环境稳定的离子孔；与此相反，促凋亡家族成员则可干扰传导途径的形成37，38。线粒体膜电位的改变——通常是一种凋亡的早期警报——可使线粒体的内容物漏入细胞浆，在那里它们激活caspases29，31，32，39，40。如此，Bcl-2家族成员起到一种caspases上游的作用：一旦级联放大启动，抗凋亡Bcl-2家族成员通常不能防止细胞死亡。近期有一个报道指出，Bcl-2本身可能是caspases的一个下游死亡底物，这意味着在Bcl-2家族成员与caspases间存在着更复杂的关系41。
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凋亡的最后步骤：凋亡体的吞噬和降解
凋亡体的吞噬和降解是程序性细胞死亡过程的结束。然而，与凋亡的约定和执行相比，对这些过程的了解更少。细胞表面蛋白质(例如血小板反应素上调)和脂质(磷脂酰丝氨酸的表达)构成的改变，使凋亡体能被其他的吞噬细胞辨认。浆膜完整的凋亡残骸的吞噬是凋亡的一个主要特点，因为没有致炎性细胞成分的漏出。凋亡体的最后降解还不太清楚。凋亡体降解异常可致抗核抗体形成，所以，在人类这一过程的缺陷与某些系统性红斑狼疮有关42。
凋亡在疾病中的作用
多细胞生物的生存需要细胞增殖与死亡的平衡。凋亡调节异常与很多疾病的发生及进展有关。许多疾病可根据它们与凋亡联系的多少进行分型6。在发病机理方面，大多数凋亡性疾病以一类细胞凋亡太多而另一类细胞清除太少为特征。凋亡疾病可根据它们最初的功能障碍来分型。这种功能障碍可导致其他的(和相对的)功能障碍。本文仅讨论一些与凋亡失调有关的疾病。有关凋亡在急性创伤、心肌梗死、卒中和感染性疾病(例如病毒性肝炎和获得性免疫缺陷综合征)中作用的讨论从略。上述疾病和其他一些疾病已在其他地方被广泛叙述。MEDLINE列出了数百篇与凋亡有关疾病的文章。
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原发性凋亡缺陷
移植排斥。——身体各部在免疫学上并不完全相同：某些部位和组织由于免疫特惠(不发生炎症以及与强烈免疫反应有关的其他副损伤)而得到保护43。通常由宿主反应破坏的异体移植物和异种移植物能够在角膜和睾丸这样的免疫特惠部位生存。介导免疫特惠的一个潜在机制有赖于Fas-FasL凋亡通道(图2)44。在不同类型的细胞上，Fas或为结构性表达(象在肝细胞)或诱导性表达(象在淋巴细胞)，而在免疫特惠部位通常只有激活的T淋巴细胞和躯体细胞才表达FasL25，44。淋巴样细胞能浸润到免疫特惠部位，但当它们的Fas受体结合FasL时，它们随即被诱导而凋亡。因而，非特惠的移植物在非特惠部位的排斥(通过Fas-FasL模型)可视为(在宿主的淋巴样细胞)原发性凋亡不足：宿主的反应性T细胞不被移植物细胞(不表达FasL)杀死。这些浸润的T细胞可持续诱导移植物细胞凋亡或用其他方法杀死移植物细胞，从而在移植物排斥反应期间导致继发性凋亡增高(在移植物细胞内)。然而，从严格意义上讲，移植物排斥不是原发的病理性凋亡缺损，而是一个完整的免疫系统消灭异体细胞的生理过程。
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自身免疫性糖尿病。——就象T淋巴细胞通过Fas-FasL的相互作用杀死细胞的描述那样，由于自身反应性淋巴细胞(周围的自身耐受性)的清除有赖于凋亡，因此，所有的自身免疫性疾病均可视为凋亡的原发性缺陷。对Fas和FasL作用的研究使我们对自身免疫性糖尿病的发病原理及治疗有了新的认识45。在非肥胖性糖尿病老鼠模型，疾病的发展在2个位点被调节：白细胞在胰岛的非反应性浸润以及由T细胞启动的对胰腺β细胞的积极破坏，这是一个导致胰岛素依赖性糖尿病的过程。Fas和FasL似乎作用于第二个位点。虽然胰岛的异体移植通常受到排斥，但在某些种系的老鼠，则可通过联合移植操纵表达FasL的成肌细胞预防这种排斥46。然而，人工表达的FasL并不总能保护胰岛免受致糖尿病的T细胞的伤害。例如，在另一组研究中，FasL在胰腺β细胞的结构性表达，导致通过T细胞对β细胞上的Fas的诱导，这样使β细胞甚至更易于被T细胞(或通过相互作用，由于它们现在表达Fas和FasL)杀死47，48。在自身免疫性糖尿病的发生过程中，原发性凋亡调节缺陷是周围自身耐受性的衰竭，这引起自身反应性T细胞很少经凋亡清除。随着这些危险的淋巴细胞的出现，就会破坏胰腺细胞。
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局部自身反应性疾病。——感染后Fas和FasL表达失调可使组织细胞诱导其周围细胞以局部自身免疫的形式发生凋亡。最近提出的有关桥本氏病的机制就是基于Fas和FasL系统49。正常和桥本氏病甲状腺细胞都表达FasL，而且似乎象免疫特惠细胞。例如，当感染或其他炎症时，通过IL-1β刺激甲状腺细胞，使甲状腺细胞上的Fas随着FasL表达。这个不幸的状况可造成甲状腺细胞的互相残杀，这就解释了桥本氏病的高凋亡率。另外最近还有一些实验显示，Fas介导的肝细胞死亡(在肝炎)可被特异的caspases抑制剂阻断50，51。
淋巴增殖和自身免疫。——周围T淋巴细胞自身耐受性的衰竭(通过能量或Fas介导的凋亡的缺损)，也可成为淋巴增殖疾病的病因学基础23-25。如果自身反应性淋巴细胞被激活，而且不能适时地将其去除或耐受，这些淋巴细胞就可增加自身免疫反应的可能性。Fas或FasL基因突变的老鼠患有自身免疫性疾病和淋巴细胞过高症。有淋巴增殖性(lpr)突变的老鼠存在Fas突变；有广泛的淋巴增殖性疾病(gld)突变的老鼠，FasL是有缺陷的。这些种系的老鼠对检查Fas和FasL在周围忍耐性和自身免疫性方面的作用是极其有用的22，23。
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最近，至少在12例自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)患儿(包括Canale-Smith综合征)发现了可防止凋亡信号转导的Fas基因的非显性和阴性突变52-54。这些患儿的症状和体征，使人联想在无Fas(淋巴增殖[lpr]突变)老鼠看到的症状和体征：在外周淋巴器官有非恶性未成熟的T淋巴细胞聚积(引起明显的腺病)，有多系血丙球蛋白过多症、自身抗体产物、血小板减少症、中性白细胞减少症和肾小球肾炎。对50例正常个体进行Fas基因检查，未发现Fas突变53；这支持Fas突变对ALPS的病因作用。其他基因的突变和等位基因差异可影响有Fas突变的人和老鼠表型的严重程度，这或许意味着凋亡通道不同部位的突变可改变Fas缺陷的严重性。因此，对患者的凋亡基因进行遗传学分析在诊断和预后方面可能是有用的。
癌症。——癌症是一种迷乱的聚积着非典型细胞网络的疾病，它可由增殖过剩、凋亡不足或两者共同引起。直到近来，癌症的病因学和抗肿瘤治疗研究才集中到增殖在癌症中的作用上。由于研究优先靶向快速分裂的肿瘤细胞而不是分裂较慢的正常体细胞，因此涉及细胞周期和分裂的对DNA和细胞支架成分有损伤作用的高毒性化疗和放疗将得到发展。理想的情况是，当正常的体细胞停止它们的细胞周期并修复DNA和细胞支架损伤时，变性的癌细胞仍继续分裂并聚积突变，直至其死于基因组或代谢障碍。然而，临床观察表明许多生长缓慢的癌症是可以治愈的，而许多快速分裂的癌症则是难以治疗的，这说明对癌症增殖模式的了解还有欠缺55。深入研究凋亡为了解和治疗癌症开辟了新的领域。
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凋亡在癌症的发病机理以及癌症对常规抗肿瘤治疗的抵抗性方面均是至关重要的。p53基因及其调节者(即mdm2)的突变是极其常见的，在人类癌症患者的发生率约为55%～70%56。在DNA损伤时p53蛋白反应性地诱导细胞周期停止，并在某些情况下诱导凋亡。p53缺失的细胞由于不能停止细胞周期和正常地激活DNA的修复功能，所以不能有效地修复DNA。这种细胞一般比含有功能性p53蛋白的细胞对放疗更具抵抗力55。功能性p53的缺失与各种肿瘤的侵袭力密切相关，2对p53基因中有1对遗传缺失(Li-Fraumeni综合征)的人，癌症发生率很高55。
p53蛋白起到转录因子的作用，可通过激活大量介导凋亡的基因诱导凋亡。有趣的是，有几个p53诱导基因携有调节细胞氧化还原状态的蛋白质密码57。目前的研究提出，DNA损伤可使p53蛋白启动产物能产生自由基的基因，反过来，这些自由基可损伤细胞的线粒体，使其内容物(如细胞色素C)漏出并激活凋亡的caspases57。
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p53蛋白还可通过上调Bax的表达诱导凋亡。Bax是促凋亡的Bcl-2家族成员。肿瘤显示各种不同数量的凋亡细胞；凋亡细胞比例大与肿瘤生长缓慢相关。与此相反，缺少Bax基因的老鼠，肿瘤生长速度快，这种肿瘤凋亡细胞的数量要比正常Bax基因老鼠肿瘤的凋亡细胞少50%58。在微卫星突变型结肠癌的发生机制方面，Bax显然也在独立于p53的途径上起作用59。因此，即使在癌细胞也可能有几种不同的发生凋亡的途径。正如预料的那样，当Bcl-2家族的抗凋亡成员过度表达时，肿瘤形成的可能性大大增强：Bcl-2最先是从B-细胞滤泡样淋巴瘤分离出来的，在发现凋亡中的作用以前它被归类为肿瘤抑制物33。
对免疫特惠的认识有助于我们了解为什么肿瘤能逃避免疫系统诱导的凋亡作用。转移的恶性黑色素瘤细胞系已被发现表达FasL，因此能使肿瘤细胞杀死敢于靠近的T淋巴细胞60。表达FasL的鼠黑色素瘤细胞，在缺乏Fas的老鼠体内的生长速度要比在正常老鼠慢得多，这些观察支持了FasL在肿瘤免疫逃避中的作用。在22例肝细胞癌患者进行的研究发现，所有肿瘤Fas的表达均下调并出现了FasL的新奇表达61。如此，这些肿瘤细胞不仅表达一个杀死淋巴细胞的配体，而且也去除它们自己的Fas受体，使它们本身不受那种凋亡诱导的影响。
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总之，直接或间接导致凋亡减少的基因突变通常与各种不同类型肿瘤的不良预后有关，常规化疗和放疗的治疗效果主要依赖于其对癌细胞凋亡的诱导6，52。旨在特异地诱导癌细胞凋亡的新的抗癌治疗是非常令人兴奋的，它们为癌症的治愈提供了新的希望。
原发性凋亡过度
神经变性疾病。——CNS不同部位特殊类型神经元的逐渐丧失是各种神经退变性疾病的病理特点。在发育期间CNS是一个强烈的凋亡部位(估计50%～80%的CNS神经元在发育期间死亡)，在成年时其存活似乎有赖于Bcl-xL这样的促生存基因的表达。CNS可能特别容易受凋亡途径紊乱的损害，特别是涉及钙62和自由基生成的途径63。凋亡细胞的死亡及其辅助分子介质可能在许多神经退变性疾病均有作用，例如早老性痴呆、帕金森氏病、脊柱肌肉萎缩和肌萎缩性侧索硬化6，38，64，65。
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近来发现早老2(presenilin 2)基因的突变与家族性早老性痴呆有关66。推测presenilin 2在凋亡途径中起Fas下游的作用。Presenilin 2的鼠同系物可防止T淋巴细胞上的FasL上调，正常情况下这种现象发生于T细胞与家族性异体肽结合被激活时66。在PC12神经元细胞系中，正常的presenilin 2的过度表达导致凋亡；从家族性早老性痴呆患者分离出的突变型presenilin 2诱导凋亡的能力甚至更大67。早老性痴呆的主要特征之一是在脑中形成淀粉样蛋白β斑，此外，神经元凋亡的阈值亦发生改变。在原代培养的人类神经元，淀粉样蛋白β的肽碎片能下调抗凋亡的Bcl-2的表达，并上调凋亡的Bax的表达，从而使神经元更易死亡，尤其是在氧化应激反应时68。
帕金森氏病以纹状体多巴胺能的神经元变性为特点，考虑系在对氧化损伤的反应中，通过凋亡和坏死死亡69，70。虽然造成帕金森氏病的基因比造成早老性痴呆的基因更难捉摸，但帕金森氏病的治疗证明其发生与抑制凋亡密切相关。在历史上，盐酸selegiline药物曾用于治疗帕金森氏病，因其能不可逆转地抑制单胺氧化酶B，因此可增强多巴胺的信号。近来发现，selegiline能特异地改变细胞死亡和生存基因的转录，包括过氧化物歧化酶、Bcl-2和Bcl-xL、二氧化氮合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶。与此相比，selegiline对单胺氧化酶B的作用可能是次要的71。Selegiline可防止线粒体膜电位的进行性还原，因而可抑制线粒体释放促凋亡物质。
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心脏疾病。——近来有几项实验对人心脏功能不全时凋亡的程度和凋亡的分子媒体水平进行了研究。有一项研究对外科移植时7例切除的心脏进行了凋亡测定72。采用终端脱氧尿核苷酸末端标记(TUNEL)法对破碎DNA进行特异性标记测定显示73，全部4个患特发性扩张型心肌病(IDCM)的心脏以及1个患缺血性心肌病的心脏都有凋亡核。此外，对IDCM心脏的DNA进行阿加罗耳(酚酞琼脂矿物油乳)胶电泳检查，出现一个核小体间(internucleosomal)的DNA凋亡特征的梯形图像。另外2个患缺血性心肌病的心脏不论用TUNEL还是电泳测定均未显示凋亡征象。
在一个相似但较大的实验中74，其他研究人员对IDCM、缺血性心肌病以及瓣膜病患者的心脏进行了凋亡测定。对照组心脏平均每百万个核中有10个(SD为9)TUNEL阳性，IDCM每百万个核中平均有2 366个(2033)，缺血性心肌病为2 436个(1964)，而1例瓣膜性心脏病在每百万个核中有1015个TUNEL阳性。显然，在这个研究，凋亡在患病心脏是提高的(高出对照组232倍)，但发生凋亡细胞的百分比远比前面的研究少。这种不同可能反映了TUNEL测定的易变性，理论上它在表现核固缩(因为DNA碎裂开始于固缩改变前)前能标记凋亡核。TUNEL的特异度和敏感度仍不确切；所以，还不能从TUNEL结果得出定量结论75。该研究也检查了患病心脏的Bcl-2和Bax蛋白质水平：虽然Bax的表达保持恒定，但Bcl-2的表达平均为对照组的1.8倍。因此，在患病心脏，Bcl-2的正常抗凋亡作用不足以克服存在的促进死亡的刺激(例如机械性拉长、炎性细胞因子或活性氧族)。
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第三个研究76则在心律失常性右室发育不良引起的衰竭心脏中发现了凋亡的证据。这是一种危险的疾病，其特点是由脂肪和纤维变性组织进行性替换心肌。研究发现caspase-3高水平表达，从而提供了一个细胞死亡的机制。这些早期相关研究显示，在不同原因所致心功能不全，凋亡是增加的。凋亡的增加是细胞死亡的初始原因还是继发于一个未知的过程尚有待观察。
基于凋亡的诊断、预后和治疗
了解凋亡在分子水平的生理过程，不仅能明确疾病的发病机制，而且也为发展诊断、预后和治疗工具开辟了一个新的途径。TUNEL以及某些在组织切片形态学改变尚不明显时就能测定凋亡早期阶段的检测方法，将使有关凋亡状况的诊断更为容易。鉴于仅在最后大约1小时凋亡过程在形态上才能被观察到，所以涉及不适当凋亡水平疾病的比例要比目前描述的高的多。在进一步阐明凋亡信号发放途径并建立了这些特异信号分子的测定方法后，凋亡过剩和不足的原因将会明确。例如，对一例特发性肝变性活检标本可筛检下述新的诊断参数：生长或生存因子和抗凋亡的细胞内蛋白质的缺乏、促凋亡分子的增高、caspases的异常激活以及线粒体的氧化损伤。凋亡相关基因突变的测定，已开始用于各种癌症预后的估计；将来的测定法不仅可测定基因突变，而且可测定癌症基因表达异常的水平，从而使我们能更好地选择对肿瘤特别敏感的治疗方法。
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对凋亡机制的了解已在寻找治疗退行性、肿瘤性和自身免疫性疾病方面掀起研究热潮。合理的药物设计为具有较少副作用的高特异性治疗方法开辟了途径。有潜力的治疗方法集中在3个方面：(1)基因治疗(即p53替换)；(2)靶向凋亡上游调节体的可注射性分子(即生长因子或可溶性FasL )；(3)设计用于调节凋亡相关基因(即Bcl-2)表达的小分子药物。为使以凋亡为基础的治疗能够可行，药物分子必须被传送到特殊的靶细胞并仅在特殊的靶细胞内有活力：凋亡的无选择性抑制可致广泛增生，而异常地促进凋亡可致不希望的组织退变。需要进一步指出的是，从死亡中救活一个细胞与保存它的功能完全不是一回事。通过注射神经营养因子或其他抗凋亡分子预防帕金森氏病患者黑质中神经元的死亡，并不肯定意味着他们仍有充分的有区别并持续分泌多巴胺。
由于凋亡信号发放很复杂，旨在激活或灭活多种细胞死亡分子的联合治疗在药物调节凋亡上可能是最有希望的。如果要想抑制caspase的激活，通常必须用几种抑制剂：虽然多数caspase-3的上游caspases 能被牛痘蛋白以及杆状病毒p35抑制，但合成的三肽和四肽亦可特异地抑制caspase-3和其他caspases23，77。了解分子凋亡途径还使我们有可能开发出奇特的非药物治疗。例如，一种只能在p53缺失的细胞复制并杀死此种细胞的腺病毒，作为一种可能的抗肿瘤试剂正在进行一期临床试验，这种试剂仅杀死p53缺失的肿瘤细胞，对正常细胞无作用78。
结论
分子凋亡研究的进展极快，但有几个主题是永恒的。第一，凋亡在多细胞动物是一个很保守的机制。第二，有许多约定死亡的途径和多个中心执行器组成成分。第三，一个细胞的凋亡阈值主要取决于各种阳性和阴性调节器间的比例和相对含量。第四，凋亡对许多病理情况和疾病均具有原发或继发作用。最后，凋亡提供了一个新的令人振奋的生理过程，藉助此过程我们能为古老的疾病作出更确切的诊断、更精确的预后估计并产生奇特的治疗方法。
陈永亮 译 黄志强 校
JAMA 1998;279:300～307, 百拇医药
单位：
关键词：
临床放射学杂志990306To Die or Not to Die
An Overview of Apoptosis and Its Role in Disease
在人体和其他多细胞生物体组织中，细胞的死亡并不总是异常的，亦非总是有害的。虽然死亡可发生于大量细胞损伤的部位，但机体大多数细胞的死亡是通过一种更轻微的、非炎症的、依赖能量的、称之为凋亡的细胞死亡形式进行的。组织中的细胞数量取决于新细胞增殖和衰老细胞死亡之间的平衡。增殖和凋亡的速率在各组织间有很大区别。近来对凋亡的分子机理研究显示，凋亡是一个遗传性的程序性过程。当细胞凋亡的组成成分发生突变或出现数量异常时，此过程可受到干扰。凋亡的失调与很多疾病的发病机理有关，包括癌症、神经变性、自身免疫、心脏疾病和其他一些疾病。涉及凋亡调节和执行的基因产物对于疾病诊断和介入治疗是极具潜力的研究方向，它们使许多疾病的治愈和治疗获得新的希望。
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过去25年来，对组织学、遗传学和分子生物学的辛勤研究显示，事实上所有动物细胞都具有用于自杀的遗传成分。在正常生理情况下，为了整个生物体的更大利益，受伤或衰老的细胞通过被称为凋亡的一种遗传的程序性细胞死亡方式牺牲自己。就象其他生理系统一样，机体的细胞数量服从于内环境稳定的需要，多细胞生物体的细胞数量等于细胞增殖率减去细胞清除率。尽管早已知道细胞的过度增殖导致新生物，而细胞的增殖不足则导致机体发育不全， 但是直到最近才明确遗传的程序性细胞死亡的调节紊乱同样可引起疾病和畸形。
本综述首先明确细胞死亡的两个主要形式(坏死和凋亡)，随后叙述有关已明确的新杆状线虫(Caenorhabditis elegans)的凋亡基因，最后讨论人体细胞分子凋亡调节和执行的现状。开始的部分可为了解凋亡在疾病中越来越明显的作用和将来以凋亡为基础的临床诊断、预后和治疗的潜在作用提供科学背景。
细胞死亡的类型
坏死
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多细胞生物体的细胞一般通过2种特有方式中的1种死亡，这取决于死亡的环境和原因(附表)。坏死发生于急性的、非生理性的损伤(即在发生缺血的梗死组织中心或在毒素作用的部位)。坏死细胞肿胀和溶解，释放其细胞浆和细胞核内容物到细胞间基质中，并发生炎症。虽然在急性炎症和一些严重的炎性反应坏死是重要的，但是它并非细胞死亡的正常机制。在本世纪70年代初以前，坏死一直被认定为细胞死亡的仅有形式，而且使细胞死亡似乎是非生理的和有害的事情。
附表 凋亡和坏死主要特征* 特征
坏死
凋亡
刺激
毒素、严重缺氧、严重损伤
和缺乏ATP的情况
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无ATP缺乏的生理和病理情况
能量需求
不
依赖ATP
组织学
细胞肿胀、细胞器破裂、组织斑片状死亡
染色质浓缩、凋亡体、单一孤立的细胞死亡
DNA断裂类型
随机大小碎片
185个硷基对的多发性核体
内梯状碎片
浆膜
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溶解
完整、泡状，伴有分子变化
死亡细胞的吞噬
游走的吞噬细胞
邻近的细胞
组织反应
炎症
非炎症
*ATP代表5′-三磷酸腺苷
凋亡
1972年，Kerr1等发表了一篇描述凋亡(源于希腊词“凋落”)奇特生理过程的启蒙性文章。细胞经历凋亡的“细胞自杀”很快皱缩并失去它们正常的细胞间接触，继之表现出浓密的染色体凝聚，细胞核碎裂，细胞浆大疱形成，细胞碎裂成凋亡体。这些凋亡体很快被邻近的细胞或巨噬细胞吞噬和消化1-5。凋亡时由于没有细胞的固体内容物释放入细胞间基质中，所以不引发炎症反应。凋亡的发现是组织学上的一个伟大业绩：在由上百万个细胞组成的正常组织切片中，由于凋亡的形态序列改变能在不足一小时内完成，所以在特定的时间里仅有一小部分表现出凋亡结构改变的特点。
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凋亡时组织学改变的固定次序，导致人们认为凋亡是一种部分或全部由凋亡细胞自身引导的程序性细胞死亡。凋亡细胞的死亡是成人组织发育和内环境稳定所必须的。例如发育中的哺乳动物中枢神经系统(CNS)尤其易于凋亡，因为神经元的生成要比存活到成年的多得多，这或许是由于生长和生存因子数量有限(神经营养学说)，或是由于不能起到功能性的连接(活力学说)之故。在成年时，哺乳动物的CNS凋亡大大减少，但凋亡在其他组织却继续进行。例如，成熟粒细胞于周围循环仅存在1～2天就发生凋亡而被清除。凋亡在动物细胞也可被一系列其他引发剂激活，它们包括电离辐射、高温、病毒感染和免疫反应4-6。
线虫的记述：细胞死亡的遗传方式
凋亡的遗传学和分子机制最初是于80年代后期和90年代初期经过对新杆状线虫(C elegans)的研究而明确其特点的。在线虫的发育过程中，程序性细胞死亡是极其精确的和可预知的：特殊的基因被激活以杀灭确切的131个细胞，而在成年线虫留有959个细胞7。发育期间的凋亡被认为是细胞的一种正常归宿，就象最终被分化为肌肉和神经那样。
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线虫的研究揭示凋亡由4个连续步骤组成：(1)通过细胞外或细胞间的引发器约定死亡；(2)通过激活细胞内蛋白酶杀死细胞；(3)细胞的残骸被其他细胞吞噬；(4)细胞残骸在吞噬细胞的溶酶体内降解(图1A)8。这些阶段和控制它们的基因(在C elegans称为ced基因，控制细胞死亡的不正常)在从线虫到人类的整个动物的进化过程中是十分保守的(图1B)8-10。
图1 凋亡程序在进化中是保守的。A. 组织特异信号激活ced-4，后者激活ced-3，导致细胞死亡。如果激活，ced-9可通过抑制ced-4激活(也可能通过直接抑制ced-3)抑制凋亡，平箭头所示。B. 有很多因素约定哺乳动物的细胞死亡，但下游凋亡机制是保守的(线虫基因与哺乳动物凋亡基因的同系物在扩弧中显示)。箭头代表促进作用；平箭头为抑制作用
在C elegans，凋亡的执行需要基因ced-3和ced-4的蛋白产物11，而基因ced-9的产物则通过抑制ced-3和ced-4的活力防止凋亡(图1A)12。CED-3，一种半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(caspase)，是凋亡所必须的：当其被激活时，它裂解多种细胞蛋白，抑制一部分，激活另一部分。这些CED-3 caspase的死亡底物包括象多腺苷二磷酸核糖聚合酶、核膜的成分和负责切开凋亡细胞DNA的细胞核内酶这样的DNA修复酶。在细胞浆内caspases的激活与凋亡的形态改变特点有直接关系。无活力的caspases前体(procaspases)存在于所有细胞内，caspases的激活造成细胞间隔间的正常屏障受损，这样就导致细胞内损害而保留了浆膜的完整。
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CED-4起着CED-3上游的作用：CED-4接受一个死亡约定信号，随后与CED-3前体结合，使其释放活性CED-3。CED-9是一种位于线粒体外膜和其他细胞内膜上的多功能蛋白，它可与CED-4结合防止CED-3前体的激活，这可能是通过使CED-4和细胞浆的CED-3前体分开所致13-15。所以CED-3和CED-4诱导凋亡，而CED-9防止凋亡。
人类凋亡的分子机制
C elegans模式因其在进化中的保守性而与较高等的动物有关。哺乳动物凋亡的几个核心介质就象CED-3、CED-4和CED-9一样具有相似的分子形态和信号作用(图1和图2)。人类和其他哺乳动物比线虫更复杂；所以哺乳动物细胞凋亡的调节也更复杂，尤其是在约定凋亡的早期阶段，它涉及更多的信号分子。
图2 凋亡信号发放途径。约定死亡：死亡配体FasL与死亡受体Fas结合，开始细胞内信号发放；转接蛋白FADD(Fas相关的死亡结构域蛋白)与Fas和caspase-8(也称为FLICE，一个FADD样的白介素1β-转换酶)结合。执行：caspase-8的激活导致其他caspases的激活；caspases相互分裂无活性的caspase前体成有活性的caspases，扩增死亡信号发放；激活的caspases通过分裂多腺苷二磷酸核糖聚合酶、核片层和其他的细胞蛋白，并通过激活DNA碎片因子介导执行。凋亡信号发放的调整：在某些类型的细胞，细胞色素C由线粒体释放，激活凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)，也导致caspase的激活；Bcl-2家族成员可通过与Apaf-1和/或调节线粒体的渗透性来促进或抑制凋亡。箭头并不一定意味着直接的相互作用；新杆状线虫基因产物的同系物用灰色表示
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约定死亡
一些哺乳动物约定死亡的途径是多种多样的。例如，所有正常细胞对射线引发的DNA损伤的反应均为发放停止细胞周期信号，而一旦损伤被修复，细胞周期随即恢复，或由于损伤太严重而约定凋亡。其他约定死亡的信号途径仅存在于特殊类型的细胞和特定的时间。相对丰富的不同信号发放分子，通过激活凋亡和对抗凋亡途径的相对速度、强度和可能性，确定凋亡的阈值。有大量不同细胞死亡信号的优点是显而易见的：如果细胞死亡仅有一个信号，那么暴露于那个信号的细胞都将死亡。有多种不同的细胞死亡引发器，则可清除特殊部位的细胞而不附带周围其他细胞的清除。
细胞外的死亡配体和受体
在培养液中或机体内，于一个细胞周围的细胞外基质中，加入促死亡配体可特异地引发约定死亡。当细胞外的死亡配体与细胞表面的死亡受体结合时，受体的细胞内部分就改变形状并能结合到细胞浆的转接器蛋白(adaptor proteins)上(图2)16-18。受体-转接器复合物随即结合到下游的转接器蛋白，此蛋白能激活各种不同的caspases—CED-3的同系蛋白酶 ，它在哺乳动物起着死亡执行者的作用19-21。
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在死亡配体和受体如何主动地杀死体内特殊感染的或危险的细胞方面，免疫系统提供了极好的例子。正如图3A所示，当细胞毒T细胞(Tc细胞)上的T-细胞受体与存在于抗原呈递细胞的一类主要组织相容复合物上的外来肽结合时(一个病毒蛋白碎片)，即可诱导Tc细胞表面上的Fas 配体(FasL)蛋白的表达。然后FasL与Fas(一种存在于机体大多数细胞的细胞表面受体)结合，并激活Fas启动细胞内凋亡信号，以杀死受感染的抗原提呈细胞。相同的机制亦可保护机体免受有T-细胞受体缺陷的T淋巴细胞的伤害。这种T淋巴细胞可不适当地与自身抗原结合，就象它们是外来抗原一样(图3，B)22-25。正如所料，不能清除自身反应性T细胞可直接导致自身免疫性疾病。
图3 主动的和被动的杀灭途径。A.细胞毒T细胞(Tc细胞)用三种方法杀灭：Tc细胞上的Fas配体(FasL)与靶细胞上的Fas结合，诱导凋亡；Tc细胞脱颗粒，释放granzyme B和穿孔素，前者进入靶细胞直接激活caspases，后者能在靶细胞膜内形成孔，引起渗透性溶解。B.T细胞能被主动或被动地杀死。(1)周围的自身耐受性：如果一个T细胞的T-细胞受体与周围细胞自身-MHC I(一类主要组织相溶性复合物)上的自身肽密切结合，T细胞可被诱导表达FasL，除了Fas，还引起自身反应性T细胞互相残杀和预防自身免疫(B1经Nagata23同意已被调整)。(2)通过生存因子去除死亡：如果一个激活的T细胞(表达自白介素-2受体[IL-2R]失去白介素-2(IL-2)，它将经历凋亡，因为不履行(Default)死亡信号可被Bcl-2家族的抗凋亡成员抑制
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忽略所致死亡
去除抑制死亡(或促进生存)的配体亦可特异性地引发约定死亡。在这种死亡形式中，细胞由于缺乏来自细胞表面的生存因子受体的细胞浆信号而约定死亡。这种外源性信号的缺乏可使内源性的死亡程序结束细胞自身24-27。例如，激活的T淋巴细胞的生存有赖于可溶性蛋白质白介素2(IL-2)的存在，如去除了IL-2即发生凋亡(图3，B2)。无论凋亡始于死亡配体还是生存因子缺乏，均可激活相同的最后执行过程。
死亡执行：接合器、Caspases和死亡底物
哺乳动物细胞内有各种死亡约定信号可以激活中心执行者：caspase的级联放大(图1，B)。例如，Fas这样的细胞表面死亡受体被激活后，它们的胞浆尾足与FADD(Fas相关的死亡结构域蛋白)这样的接合器蛋白质结合(图2)17。然后，Fas-FADD复合物结合并激活caspase-821，激活的caspase-8则启动执行凋亡的致死性的蛋白分解级联。
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与新杆状线虫仅有一种CED-3 caspase不同，在人类细胞至少已分离出10种不同的caspases。在蛋白分解级联中激活的caspases使各自的前体裂解为成熟的、有活力的酶，这种级联放大与补体激活或血液凝固的过程相似23，28。就象在新杆状线虫一样，人类的死亡底物包括，涉及DNA修复和复制的胞浆和细胞核蛋白，RNA的缝接、细胞支架和细胞分裂23，28。一旦caspases被激活，随即发生凋亡的形态学改变，此消亡过程是不能停止的。
人类的CED-4同系物
就象新杆状线虫一样，人类亦有一个诱导凋亡的CED-4同系物。这种同系物被称为凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1)29。当线粒体的蛋白质细胞色素C与Apaf-1结合时，Apaf-1就能结合并激活caspase-3，进而启动caspase级联放大(图2)30。有趣的是Apaf-1也有一个结合5'-三磷酸腺苷的位置，这就可以解释何以一个受伤的细胞，在决定细胞是有足够能量通过凋亡死亡还是通过不耗能的坏死死亡时，ATP能量水平可能起一个关键的作用。最后，Apaf-1也可以与Bcl-2家族中的抗凋亡的CED-9同系物结合，它可将Apaf-1和caspase-3分离，从而抑制凋亡。
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Bcl-2家族与线粒体在凋亡中的不确定作用
Bcl-2家族是以发现的可通过抑制凋亡而引发肿瘤的B-细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)基因而命名的，它包括促进凋亡成员(即Bax和Bad)和抑制凋亡成员(即，Bcl-2和Bcl-xl)31-33。Bcl-2家族成员促进或抑制某些激发器诱导的凋亡，例如，生长因子可去除诱导的凋亡，但它们并不总是影响其他种类的死亡信号，象某些类型细胞的Fas 通道23-27，34。
Bcl-2家族成员促进或抑制凋亡的确切机制尚未确定。占主导地位的学说是，抗凋亡的类Bcl-2蛋白质可通过直接与Apaf-1接合，或通过防止线粒体释放细胞色素C和其他内容物，抑制caspase的激活，或者同时通过上述两种途径35，36。Bcl-2家族成员位于线粒体的外膜上，它们能以不同类型的配对结合相互连接(即Bcl-2：Bcl-2的同质二聚物或象Bcl-2：Bax的异质二聚物)，从而在线粒体膜上形成离子传导途径。抗凋亡的Bcl-2家族成员可形成使细胞器内电化学内环境稳定的离子孔；与此相反，促凋亡家族成员则可干扰传导途径的形成37，38。线粒体膜电位的改变——通常是一种凋亡的早期警报——可使线粒体的内容物漏入细胞浆，在那里它们激活caspases29，31，32，39，40。如此，Bcl-2家族成员起到一种caspases上游的作用：一旦级联放大启动，抗凋亡Bcl-2家族成员通常不能防止细胞死亡。近期有一个报道指出，Bcl-2本身可能是caspases的一个下游死亡底物，这意味着在Bcl-2家族成员与caspases间存在着更复杂的关系41。
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凋亡的最后步骤：凋亡体的吞噬和降解
凋亡体的吞噬和降解是程序性细胞死亡过程的结束。然而，与凋亡的约定和执行相比，对这些过程的了解更少。细胞表面蛋白质(例如血小板反应素上调)和脂质(磷脂酰丝氨酸的表达)构成的改变，使凋亡体能被其他的吞噬细胞辨认。浆膜完整的凋亡残骸的吞噬是凋亡的一个主要特点，因为没有致炎性细胞成分的漏出。凋亡体的最后降解还不太清楚。凋亡体降解异常可致抗核抗体形成，所以，在人类这一过程的缺陷与某些系统性红斑狼疮有关42。
凋亡在疾病中的作用
多细胞生物的生存需要细胞增殖与死亡的平衡。凋亡调节异常与很多疾病的发生及进展有关。许多疾病可根据它们与凋亡联系的多少进行分型6。在发病机理方面，大多数凋亡性疾病以一类细胞凋亡太多而另一类细胞清除太少为特征。凋亡疾病可根据它们最初的功能障碍来分型。这种功能障碍可导致其他的(和相对的)功能障碍。本文仅讨论一些与凋亡失调有关的疾病。有关凋亡在急性创伤、心肌梗死、卒中和感染性疾病(例如病毒性肝炎和获得性免疫缺陷综合征)中作用的讨论从略。上述疾病和其他一些疾病已在其他地方被广泛叙述。MEDLINE列出了数百篇与凋亡有关疾病的文章。
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原发性凋亡缺陷
移植排斥。——身体各部在免疫学上并不完全相同：某些部位和组织由于免疫特惠(不发生炎症以及与强烈免疫反应有关的其他副损伤)而得到保护43。通常由宿主反应破坏的异体移植物和异种移植物能够在角膜和睾丸这样的免疫特惠部位生存。介导免疫特惠的一个潜在机制有赖于Fas-FasL凋亡通道(图2)44。在不同类型的细胞上，Fas或为结构性表达(象在肝细胞)或诱导性表达(象在淋巴细胞)，而在免疫特惠部位通常只有激活的T淋巴细胞和躯体细胞才表达FasL25，44。淋巴样细胞能浸润到免疫特惠部位，但当它们的Fas受体结合FasL时，它们随即被诱导而凋亡。因而，非特惠的移植物在非特惠部位的排斥(通过Fas-FasL模型)可视为(在宿主的淋巴样细胞)原发性凋亡不足：宿主的反应性T细胞不被移植物细胞(不表达FasL)杀死。这些浸润的T细胞可持续诱导移植物细胞凋亡或用其他方法杀死移植物细胞，从而在移植物排斥反应期间导致继发性凋亡增高(在移植物细胞内)。然而，从严格意义上讲，移植物排斥不是原发的病理性凋亡缺损，而是一个完整的免疫系统消灭异体细胞的生理过程。
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自身免疫性糖尿病。——就象T淋巴细胞通过Fas-FasL的相互作用杀死细胞的描述那样，由于自身反应性淋巴细胞(周围的自身耐受性)的清除有赖于凋亡，因此，所有的自身免疫性疾病均可视为凋亡的原发性缺陷。对Fas和FasL作用的研究使我们对自身免疫性糖尿病的发病原理及治疗有了新的认识45。在非肥胖性糖尿病老鼠模型，疾病的发展在2个位点被调节：白细胞在胰岛的非反应性浸润以及由T细胞启动的对胰腺β细胞的积极破坏，这是一个导致胰岛素依赖性糖尿病的过程。Fas和FasL似乎作用于第二个位点。虽然胰岛的异体移植通常受到排斥，但在某些种系的老鼠，则可通过联合移植操纵表达FasL的成肌细胞预防这种排斥46。然而，人工表达的FasL并不总能保护胰岛免受致糖尿病的T细胞的伤害。例如，在另一组研究中，FasL在胰腺β细胞的结构性表达，导致通过T细胞对β细胞上的Fas的诱导，这样使β细胞甚至更易于被T细胞(或通过相互作用，由于它们现在表达Fas和FasL)杀死47，48。在自身免疫性糖尿病的发生过程中，原发性凋亡调节缺陷是周围自身耐受性的衰竭，这引起自身反应性T细胞很少经凋亡清除。随着这些危险的淋巴细胞的出现，就会破坏胰腺细胞。
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局部自身反应性疾病。——感染后Fas和FasL表达失调可使组织细胞诱导其周围细胞以局部自身免疫的形式发生凋亡。最近提出的有关桥本氏病的机制就是基于Fas和FasL系统49。正常和桥本氏病甲状腺细胞都表达FasL，而且似乎象免疫特惠细胞。例如，当感染或其他炎症时，通过IL-1β刺激甲状腺细胞，使甲状腺细胞上的Fas随着FasL表达。这个不幸的状况可造成甲状腺细胞的互相残杀，这就解释了桥本氏病的高凋亡率。另外最近还有一些实验显示，Fas介导的肝细胞死亡(在肝炎)可被特异的caspases抑制剂阻断50，51。
淋巴增殖和自身免疫。——周围T淋巴细胞自身耐受性的衰竭(通过能量或Fas介导的凋亡的缺损)，也可成为淋巴增殖疾病的病因学基础23-25。如果自身反应性淋巴细胞被激活，而且不能适时地将其去除或耐受，这些淋巴细胞就可增加自身免疫反应的可能性。Fas或FasL基因突变的老鼠患有自身免疫性疾病和淋巴细胞过高症。有淋巴增殖性(lpr)突变的老鼠存在Fas突变；有广泛的淋巴增殖性疾病(gld)突变的老鼠，FasL是有缺陷的。这些种系的老鼠对检查Fas和FasL在周围忍耐性和自身免疫性方面的作用是极其有用的22，23。
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最近，至少在12例自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)患儿(包括Canale-Smith综合征)发现了可防止凋亡信号转导的Fas基因的非显性和阴性突变52-54。这些患儿的症状和体征，使人联想在无Fas(淋巴增殖[lpr]突变)老鼠看到的症状和体征：在外周淋巴器官有非恶性未成熟的T淋巴细胞聚积(引起明显的腺病)，有多系血丙球蛋白过多症、自身抗体产物、血小板减少症、中性白细胞减少症和肾小球肾炎。对50例正常个体进行Fas基因检查，未发现Fas突变53；这支持Fas突变对ALPS的病因作用。其他基因的突变和等位基因差异可影响有Fas突变的人和老鼠表型的严重程度，这或许意味着凋亡通道不同部位的突变可改变Fas缺陷的严重性。因此，对患者的凋亡基因进行遗传学分析在诊断和预后方面可能是有用的。
癌症。——癌症是一种迷乱的聚积着非典型细胞网络的疾病，它可由增殖过剩、凋亡不足或两者共同引起。直到近来，癌症的病因学和抗肿瘤治疗研究才集中到增殖在癌症中的作用上。由于研究优先靶向快速分裂的肿瘤细胞而不是分裂较慢的正常体细胞，因此涉及细胞周期和分裂的对DNA和细胞支架成分有损伤作用的高毒性化疗和放疗将得到发展。理想的情况是，当正常的体细胞停止它们的细胞周期并修复DNA和细胞支架损伤时，变性的癌细胞仍继续分裂并聚积突变，直至其死于基因组或代谢障碍。然而，临床观察表明许多生长缓慢的癌症是可以治愈的，而许多快速分裂的癌症则是难以治疗的，这说明对癌症增殖模式的了解还有欠缺55。深入研究凋亡为了解和治疗癌症开辟了新的领域。
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凋亡在癌症的发病机理以及癌症对常规抗肿瘤治疗的抵抗性方面均是至关重要的。p53基因及其调节者(即mdm2)的突变是极其常见的，在人类癌症患者的发生率约为55%～70%56。在DNA损伤时p53蛋白反应性地诱导细胞周期停止，并在某些情况下诱导凋亡。p53缺失的细胞由于不能停止细胞周期和正常地激活DNA的修复功能，所以不能有效地修复DNA。这种细胞一般比含有功能性p53蛋白的细胞对放疗更具抵抗力55。功能性p53的缺失与各种肿瘤的侵袭力密切相关，2对p53基因中有1对遗传缺失(Li-Fraumeni综合征)的人，癌症发生率很高55。
p53蛋白起到转录因子的作用，可通过激活大量介导凋亡的基因诱导凋亡。有趣的是，有几个p53诱导基因携有调节细胞氧化还原状态的蛋白质密码57。目前的研究提出，DNA损伤可使p53蛋白启动产物能产生自由基的基因，反过来，这些自由基可损伤细胞的线粒体，使其内容物(如细胞色素C)漏出并激活凋亡的caspases57。
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p53蛋白还可通过上调Bax的表达诱导凋亡。Bax是促凋亡的Bcl-2家族成员。肿瘤显示各种不同数量的凋亡细胞；凋亡细胞比例大与肿瘤生长缓慢相关。与此相反，缺少Bax基因的老鼠，肿瘤生长速度快，这种肿瘤凋亡细胞的数量要比正常Bax基因老鼠肿瘤的凋亡细胞少50%58。在微卫星突变型结肠癌的发生机制方面，Bax显然也在独立于p53的途径上起作用59。因此，即使在癌细胞也可能有几种不同的发生凋亡的途径。正如预料的那样，当Bcl-2家族的抗凋亡成员过度表达时，肿瘤形成的可能性大大增强：Bcl-2最先是从B-细胞滤泡样淋巴瘤分离出来的，在发现凋亡中的作用以前它被归类为肿瘤抑制物33。
对免疫特惠的认识有助于我们了解为什么肿瘤能逃避免疫系统诱导的凋亡作用。转移的恶性黑色素瘤细胞系已被发现表达FasL，因此能使肿瘤细胞杀死敢于靠近的T淋巴细胞60。表达FasL的鼠黑色素瘤细胞，在缺乏Fas的老鼠体内的生长速度要比在正常老鼠慢得多，这些观察支持了FasL在肿瘤免疫逃避中的作用。在22例肝细胞癌患者进行的研究发现，所有肿瘤Fas的表达均下调并出现了FasL的新奇表达61。如此，这些肿瘤细胞不仅表达一个杀死淋巴细胞的配体，而且也去除它们自己的Fas受体，使它们本身不受那种凋亡诱导的影响。
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总之，直接或间接导致凋亡减少的基因突变通常与各种不同类型肿瘤的不良预后有关，常规化疗和放疗的治疗效果主要依赖于其对癌细胞凋亡的诱导6，52。旨在特异地诱导癌细胞凋亡的新的抗癌治疗是非常令人兴奋的，它们为癌症的治愈提供了新的希望。
原发性凋亡过度
神经变性疾病。——CNS不同部位特殊类型神经元的逐渐丧失是各种神经退变性疾病的病理特点。在发育期间CNS是一个强烈的凋亡部位(估计50%～80%的CNS神经元在发育期间死亡)，在成年时其存活似乎有赖于Bcl-xL这样的促生存基因的表达。CNS可能特别容易受凋亡途径紊乱的损害，特别是涉及钙62和自由基生成的途径63。凋亡细胞的死亡及其辅助分子介质可能在许多神经退变性疾病均有作用，例如早老性痴呆、帕金森氏病、脊柱肌肉萎缩和肌萎缩性侧索硬化6，38，64，65。
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近来发现早老2(presenilin 2)基因的突变与家族性早老性痴呆有关66。推测presenilin 2在凋亡途径中起Fas下游的作用。Presenilin 2的鼠同系物可防止T淋巴细胞上的FasL上调，正常情况下这种现象发生于T细胞与家族性异体肽结合被激活时66。在PC12神经元细胞系中，正常的presenilin 2的过度表达导致凋亡；从家族性早老性痴呆患者分离出的突变型presenilin 2诱导凋亡的能力甚至更大67。早老性痴呆的主要特征之一是在脑中形成淀粉样蛋白β斑，此外，神经元凋亡的阈值亦发生改变。在原代培养的人类神经元，淀粉样蛋白β的肽碎片能下调抗凋亡的Bcl-2的表达，并上调凋亡的Bax的表达，从而使神经元更易死亡，尤其是在氧化应激反应时68。
帕金森氏病以纹状体多巴胺能的神经元变性为特点，考虑系在对氧化损伤的反应中，通过凋亡和坏死死亡69，70。虽然造成帕金森氏病的基因比造成早老性痴呆的基因更难捉摸，但帕金森氏病的治疗证明其发生与抑制凋亡密切相关。在历史上，盐酸selegiline药物曾用于治疗帕金森氏病，因其能不可逆转地抑制单胺氧化酶B，因此可增强多巴胺的信号。近来发现，selegiline能特异地改变细胞死亡和生存基因的转录，包括过氧化物歧化酶、Bcl-2和Bcl-xL、二氧化氮合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶。与此相比，selegiline对单胺氧化酶B的作用可能是次要的71。Selegiline可防止线粒体膜电位的进行性还原，因而可抑制线粒体释放促凋亡物质。
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心脏疾病。——近来有几项实验对人心脏功能不全时凋亡的程度和凋亡的分子媒体水平进行了研究。有一项研究对外科移植时7例切除的心脏进行了凋亡测定72。采用终端脱氧尿核苷酸末端标记(TUNEL)法对破碎DNA进行特异性标记测定显示73，全部4个患特发性扩张型心肌病(IDCM)的心脏以及1个患缺血性心肌病的心脏都有凋亡核。此外，对IDCM心脏的DNA进行阿加罗耳(酚酞琼脂矿物油乳)胶电泳检查，出现一个核小体间(internucleosomal)的DNA凋亡特征的梯形图像。另外2个患缺血性心肌病的心脏不论用TUNEL还是电泳测定均未显示凋亡征象。
在一个相似但较大的实验中74，其他研究人员对IDCM、缺血性心肌病以及瓣膜病患者的心脏进行了凋亡测定。对照组心脏平均每百万个核中有10个(SD为9)TUNEL阳性，IDCM每百万个核中平均有2 366个(2033)，缺血性心肌病为2 436个(1964)，而1例瓣膜性心脏病在每百万个核中有1015个TUNEL阳性。显然，在这个研究，凋亡在患病心脏是提高的(高出对照组232倍)，但发生凋亡细胞的百分比远比前面的研究少。这种不同可能反映了TUNEL测定的易变性，理论上它在表现核固缩(因为DNA碎裂开始于固缩改变前)前能标记凋亡核。TUNEL的特异度和敏感度仍不确切；所以，还不能从TUNEL结果得出定量结论75。该研究也检查了患病心脏的Bcl-2和Bax蛋白质水平：虽然Bax的表达保持恒定，但Bcl-2的表达平均为对照组的1.8倍。因此，在患病心脏，Bcl-2的正常抗凋亡作用不足以克服存在的促进死亡的刺激(例如机械性拉长、炎性细胞因子或活性氧族)。
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第三个研究76则在心律失常性右室发育不良引起的衰竭心脏中发现了凋亡的证据。这是一种危险的疾病，其特点是由脂肪和纤维变性组织进行性替换心肌。研究发现caspase-3高水平表达，从而提供了一个细胞死亡的机制。这些早期相关研究显示，在不同原因所致心功能不全，凋亡是增加的。凋亡的增加是细胞死亡的初始原因还是继发于一个未知的过程尚有待观察。
基于凋亡的诊断、预后和治疗
了解凋亡在分子水平的生理过程，不仅能明确疾病的发病机制，而且也为发展诊断、预后和治疗工具开辟了一个新的途径。TUNEL以及某些在组织切片形态学改变尚不明显时就能测定凋亡早期阶段的检测方法，将使有关凋亡状况的诊断更为容易。鉴于仅在最后大约1小时凋亡过程在形态上才能被观察到，所以涉及不适当凋亡水平疾病的比例要比目前描述的高的多。在进一步阐明凋亡信号发放途径并建立了这些特异信号分子的测定方法后，凋亡过剩和不足的原因将会明确。例如，对一例特发性肝变性活检标本可筛检下述新的诊断参数：生长或生存因子和抗凋亡的细胞内蛋白质的缺乏、促凋亡分子的增高、caspases的异常激活以及线粒体的氧化损伤。凋亡相关基因突变的测定，已开始用于各种癌症预后的估计；将来的测定法不仅可测定基因突变，而且可测定癌症基因表达异常的水平，从而使我们能更好地选择对肿瘤特别敏感的治疗方法。
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对凋亡机制的了解已在寻找治疗退行性、肿瘤性和自身免疫性疾病方面掀起研究热潮。合理的药物设计为具有较少副作用的高特异性治疗方法开辟了途径。有潜力的治疗方法集中在3个方面：(1)基因治疗(即p53替换)；(2)靶向凋亡上游调节体的可注射性分子(即生长因子或可溶性FasL )；(3)设计用于调节凋亡相关基因(即Bcl-2)表达的小分子药物。为使以凋亡为基础的治疗能够可行，药物分子必须被传送到特殊的靶细胞并仅在特殊的靶细胞内有活力：凋亡的无选择性抑制可致广泛增生，而异常地促进凋亡可致不希望的组织退变。需要进一步指出的是，从死亡中救活一个细胞与保存它的功能完全不是一回事。通过注射神经营养因子或其他抗凋亡分子预防帕金森氏病患者黑质中神经元的死亡，并不肯定意味着他们仍有充分的有区别并持续分泌多巴胺。
由于凋亡信号发放很复杂，旨在激活或灭活多种细胞死亡分子的联合治疗在药物调节凋亡上可能是最有希望的。如果要想抑制caspase的激活，通常必须用几种抑制剂：虽然多数caspase-3的上游caspases 能被牛痘蛋白以及杆状病毒p35抑制，但合成的三肽和四肽亦可特异地抑制caspase-3和其他caspases23，77。了解分子凋亡途径还使我们有可能开发出奇特的非药物治疗。例如，一种只能在p53缺失的细胞复制并杀死此种细胞的腺病毒，作为一种可能的抗肿瘤试剂正在进行一期临床试验，这种试剂仅杀死p53缺失的肿瘤细胞，对正常细胞无作用78。
结论
分子凋亡研究的进展极快，但有几个主题是永恒的。第一，凋亡在多细胞动物是一个很保守的机制。第二，有许多约定死亡的途径和多个中心执行器组成成分。第三，一个细胞的凋亡阈值主要取决于各种阳性和阴性调节器间的比例和相对含量。第四，凋亡对许多病理情况和疾病均具有原发或继发作用。最后，凋亡提供了一个新的令人振奋的生理过程，藉助此过程我们能为古老的疾病作出更确切的诊断、更精确的预后估计并产生奇特的治疗方法。
陈永亮 译 黄志强 校
JAMA 1998;279:300～307, 百拇医药