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编号:10213908
用多聚酶链反应检测母乳HBV和CMV在乳源筛选中的意义①
http://www.100md.com 《湖南医科大学学报》 1999年第1期
     作者:杨德娴 李云芝 宋健辉 李清清 杨于嘉

    单位:杨德娴 李云芝 宋健辉 李清清 杨于嘉(附属湘雅医院护理部 长沙 410008)

    关键词:乳;人;保藏;生物学;多聚酶链反应;巨细胞病毒;乙型肝炎病毒

    湖南医科大学学报990114 提要 采用多聚酶链反应(PCR)检测产妇初乳中HBV-DNA和CMV-DNA。结果显示:母血HBV-M阴性者其初乳全呈PCR阴性;母血HBsAg,HBeAg及HBcAb阳性者其初乳排毒率为81.25%;HBsAg,HBeAb及HBcAb阳性者其初乳排毒率为45.24%;仅HBeAb与HBcAb阳性者其初乳排毒率为23.08%。说明产妇体内HBV复制活跃、乳汁排毒率高,传播给婴儿的危险性大。母血CMV-IgM阳性者其初乳CMV-DNA阳性率为42.86%~70.00%,传播给婴儿的可能性较大。提示母乳入库条件应为母血HBV-M及CMV-IgM阴性且HBV-DNA与CMV-DNA阴性者。PCR是筛选乳源特异而敏感的方法。
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    中国图书分类号 R174.4

    Significance of detection of HBV-DNA and CMV-DNA

    by polymerase chain reaction in screening mothers’ milk

    Yang Dexian, Li Yunzhi, Song Jianhui, et al

    (Department of nursing, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)

    Hepatitis B virus(HBV) DNA and cytomegalovirus DNA in the colostrum of lying-in women were detected by polymerase chain reaction for the safety of mothers' milk in the milk bank. The results showed that: ① HBV-DNA was not found in the milk of women with negative serological markers of the virus, while in the milk of women with positive marker of HBsAg, HBeAg and HBcAb, the positive rate of HBV-DNA was 81.25%, in the milk of mothers with positive marker of HBsAg, HBcAb and HBeAb, the positive rate was 45.24%, in the milk of women only with HBcAb and HBeAb positive, the rate was 23.08%. ② The specific amplified products of CMV DNA in the milk were obtained in 42.80%~70.00% women whose CMV IgM antibody was positive. These findings suggest that the excretion of viruses would increase in mothers with active virus replication, and the viruses would be transmitted to newborns by milk. The authors think that only the milk from the mothers with both negative serological markers and negative PCR of the viruses can be collected and stored in the milk bank. PCR is a specific and sensitive technique which can be used to monitor the safety of mothers' milk. In this paper, the authors have presented some suggestions about how to give breast-feeding and protect newborns whose mothers are various status of virus secretion in the milk.
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    Key words milk,human; preservation,biological; hepatitis B virus; cytomegalovirus; polymerase chain reaction

    母乳不仅含有适于婴儿生长发育的各种营养物质,而且 还含多种抗病物质[1]。这种双重价值是其他人工配方食品不可比拟的。因此,目前世界各国均在世界卫生组织(WHO)倡导下,大力推行母乳喂养,有条件的医院还在积极建立人乳库,以便利用母乳资源。由于许多传染病可通过哺乳传播[2],故母乳的安全性是一个不容忽视的问题。我国是乙型病毒性肝炎(乙肝)高发区,人群中巨细胞病毒(CMV)感染也相当普遍。因此,严格筛选乳源、保证哺乳安全对于控制这两种病毒性疾病的发生具有十分重要的意义。作者采用敏感、特异的多聚酶链反应(PCR)检测母乳乙型肝炎病毒(HBV)DNA及CMV-DNA,以探讨PCR在乳源筛选中的价值。

, 百拇医药     1 材料与方法

    1.1 标本收集与分组 选择1996年3月~12月来我院产科分娩的产妇300例(孕前乙肝血清学标志物检测阴性且已接种乙肝疫苗者除外),于产前取其静脉血3ml,分离血清后分别检测乙肝血清标志物(HBV-M)及CMV-IgG与CMV-IgM。将HBV-M阳性者分成3组:A组,即HBsAg+,HBeAg+,HBcAb+,俗称“大三阳”;B组,即HBsAg+,HBcAb+,HBeAb+,俗称“小三阳”;C组,即HBcAb+,HBeAb+,俗称“双抗阳性”。对全部HBV-M 及CMV-IgM为阳性者采集产后初乳1ml,-20℃保存备用。另采集HBV-M阴性产妇初乳30份、CMV免疫学检测阴性产妇初乳30份、单纯CMV-IgG阳性产妇初乳30份作为对照。所采初乳标本为产后平均4天的乳汁。

    1.2 检测试剂及方法

    1.2.1 酶联免疫法 HBV-M检测试剂盒系华美生物工程公司产品;CMV-IgG与IgM试剂盒系深圳晶美生物工程有限公司产品。操作方法与结果判断均按说明书进行。
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    1.2.2 PCR方法 (1)母乳HBV-DNA检测:PCR药盒由上海第二医科大学提供。将冰冻乳汁置室温解冻,5000r.min-1离心10min,去上层脂肪,取中层乳清5μl加入反应管内,总反应体积30μl。每管滴加10μl消毒石蜡油后置入PCR仪中,先94℃变性2min,再按94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 60s程序扩增35个循环,然后从每管取15μl进行琼脂糖电泳,并设标准DNA分子量作参照,紫外透射仪上观察结果。350bp处出现条带判为阳性。(2)母乳CMV-DNA检测:试剂盒来源、标本处理及扩增程序同上。经琼脂糖电泳后,于420bp处出现条带判为阳性。

    1.3 统计学处理 采用卡方检验比较样本率之间的显著性。

    2 结 果

    2.1 母血及母乳HBV感染情况 300份血清标本中,呈HBV-M阳性者67例,阳性率为22.33%。其中,A组14例,占20.89%;B组42例,占62.69%;C组11例,占16.42%。用PCR检测上述67例产妇初乳中HBV-DNA,有33例发现特异性扩增产物,检出率为49.25%。30例HBV-M阴性产妇的乳汁全为PCR阴性。母血HBV-M阳性不同组合形式与初乳排毒的关系见表1。
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    表1 母血HBV-M阳性与初乳中HBV-DNA阳性的关系 母血HBV-M

    分 组

    母血

    例数

    初乳HBV-DNA阳性

    P

    例数

    阳性率(%)

    A

    14

    12

    81.25
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    <0.01(A与B)

    B

    42

    19

    45.24

    <0.01(B与C)

    C

    11

    2

    23.08

    <0.01(C与A)

    表1显示,母血HBsAg和HBeAg同时阳性者,其初乳HBV-DNA阳性率达81.25%,说明乳汁排毒频率高;11例双抗阳性者,也有2例初乳呈HBV-DNA阳性,提示部分处于HBV感染恢复期的产妇,其乳汁中仍有HBV存在;HBV-M呈“小三阳”反应者乳汁HBV-DNA阳性率较“大三阳”者为低,但较“双抗阳”者高。三者间比较,差异具有高度显著性。说明乳汁排毒频率高低各异。
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    2.2 母血及母乳CMV感染情况 300例母血的CMV-IgM,IgG抗体阳性率分别为2.67%和57.67%,两种抗体均为阳性者其阳性率为1.67%,总检出率为62.00%。13例IgM阳性(包括合并IgG阳性者)产妇初乳中,有8例呈CMV-DNA阳性,并且有2名产妇的HBV-DNA也是阳性。30例免疫学检测阴性及30例单纯CMV-IgG阳性产妇乳汁均为PCR阴性。母血CMV-IgM阳性与母乳排毒的关系列于表2。表2所示两种情况下的母乳PCR阳性率无显著性差异。 表2 母血CMV-IgM阳性与母乳CMV-DNA阳性的关系 母血CMV

    抗体反应

    母血

    例数

    母乳CMV-DNA阳性

    P
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    例数

    阳性率(%)

    IgM+

    8

    6

    70.00

    >0.05

    IgM+ IgG+

    5

    2

    42.86

    3 讨 论

    推行母乳喂养是解决儿童健康问题的重要措施。WHO要求在2000年时母乳喂养率达到80%。在推行母乳喂养时,要特别注意母乳的安全性。我国是乙肝高发区,人群HBV总感染率为45%~60%,其中近半数由母婴传播引起。湖南省80年代中期调查发现,HBV总感染率高达80.77%[3]。在育龄妇女中,CMV感染率也很高;据报道,血清CMV抗体阳性率达60%~90%[4]。因此,在筛选乳源、库存人乳时应对这两种病毒进行检测,以阻止带病毒乳汁入库。
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    检测HBV与CMV感染常用免疫学方法。虽然此等方法较为稳定,结果较为可信,但所获证据是间接的,不能确定标本中是否存在病毒颗粒。PCR检测是一种分子水平的病原学检查方法,它是目前用于乳源筛选的最理想的检测手段之一。本文采用该方法对300例产妇初乳分别进行HBV-DNA和CMV-DNA检测,结果表明,67例HBV-M阳性产妇乳汁中有49.25%的乳汁带病毒,HBeAg阳性者其乳汁排毒率高达81.25%。此结果与国内外的报道基本一致[5,6]。值得指出的是,仅HBcAb与HBeAb阳性者仍有23.08%的产妇乳汁排毒。Quint等报道恢复期HBsAb(保护性抗体)出现者仍有18.20% HBV-DNA阳性[7]。提示处于HBV感染恢复期的产妇,其乳汁也不一定是安全的。近年国内学者研究发现,初乳CMV阳性率在5%以下,乳汁排CMV高峰在产后2~12周。本文对300例产妇血清标本行CMV免疫学检测,发现IgM阳性包括合并IgG阳性者共13例,其中8例的初乳呈CMV-DNA阳性,校正阳性率为60%。表明这些产妇体内存在CMV活动感染,母乳排毒,有传播给婴儿的危险性。仅有CMV-IgG阳性的产妇乳汁30份,无一份出现CMV-DNA阳性。说明这些产妇系既往感染,乳汁中不带此种病毒。
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    根据本文结果与以往文献报道,作者认为:①凡母血HBV-M阳性者的乳汁均不可作为乳源入库与使用,只有母血HBV-M及乳汁HBV-DNA均为阴性者,方可采其乳汁。②乙肝疫苗接种前血清HBV标志物阴性,接种后已产生保护性抗体(HBsAb),且抗体的出现在时间上符合免疫应答规律者,其乳汁可被采用。③产妇乙肝免疫学检测呈“大三阳”应禁止哺乳;呈“小三阳”但乳汁HBV-DNA阴性者宜谨慎哺乳,且应定期作PCR检查,以监测乳汁排毒情况。因为病毒复制有动态变化,一次检测阴性不能保证整个哺乳期为阴性。此外,对新生儿在24h内宜用高效价抗乙肝免疫球蛋白(HBIG)进行预防,并适时行乙肝疫苗接种;仅HBcAb或HBeAb阳性而HBV-DNA阴性者,可以哺乳,但为安全起见,也应及时注射HBIG和接种乙肝疫苗。④CMV-IgM阳性者的乳汁不可作为乳源,单纯CMV-IgG阳性且乳汁CMV-DNA阴性者,其乳汁可作乳源采用。

    作者:杨德娴 女 53岁 副主任护师 ①湖南省科委课题(编号02-963-30) ②湘雅医院儿科
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    参考文献

    [1]乐杰,冯丽华.母乳与免疫.中国实用妇科与产科杂志,1997,13(2):79-81

    [2]姚天.哪些疾病的产妇不宜母乳喂养.中国实用妇科与产科杂志,1997,13(2):74-76

    [3]张铮,郑宣鹤主编.病毒性肝炎的基础与临床.长沙:湖南科学技术出版社,1994:305-307

    [4]罗丽玲.新生儿巨细胞病毒感染的临床表现与防治.实用儿科杂志,1992,7(2):70-72

    [5]杨晓,崔敏娴,刘宝根,等.乙型肝炎血清学指标阳性母亲哺乳问题的研究.中华妇产科杂志,1994,29(10):586-588

    [6]Baker BL, Bisceglie AM, Kaneko S, et al. Determination of hepatitis B virus DNA in serum using the polymerase chain reaction: clinical significance and correlation with serological and biochemical markers. Hepatology, 1991,13(4):632-636

    [7]Quint WG, Bruijin ID, Kruining H, et al. HBV-DNA detection by gene amplification in acute hepatitis B. Hepatology, 1990,12(4):653-656

    1998-07-01 收稿, 百拇医药(杨德娴 李云芝 宋健辉 李清清 杨于嘉②)