抑肽酶对心内直视手术围术期组织因子途径抑制物的影响①
作者：陈胜喜 李国虎 许廖梅 何争鸣
单位：陈胜喜 李国虎 许廖梅 何争鸣(附属湘雅医院胸心外科 长沙 410008)
关键词：体外循环；组织因子途径抑制物*；肝素；激活凝血时间*；心脏外科学
湖南医科大学学报990109 提要 检测20例体外循环心内直视手术病人围术期血浆组织因子途径抑制物(TFPI)及激活凝血时间(ACT)，结果发现肝素化后及体外循环过程中TFPI与ACT明显升高，二者变化相似，预充液中加入抑肽酶对TFPI的变化无明显影响。提示TFPI在体外循环过程中起抗凝血作用。
中国图书分类号 R654.1
Affection of aprotinin on tissue factor pathway inhibitor in
, 百拇医药
peri-operation of cardiac direct vision operation
Chen Shengxi Li Guohu Xu Liaomei He Zhengmin
(Department of Cardiothoracic Surgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Twenty patients underwent cardiac operation with cardiopulmonary bypass(CPB). We collected their blood samples during peri-operation and measured tissue factor pathway inhibitor(TFPI) and active coagulation time(ACT). The results were that TFPI and ACT were significantly increased after heparin injection and during CPB. The changes of TFPI and ACT were similar and pathophysiological; it was evident that heparin stimulated TFPI release and ACT prolonged during cardiac operation with CPB. Aprotinin did not affect the change of TFPI. The results suggest that TFPI has the effect on anticoagulation during CPB.
, 百拇医药
Key words cardiopulmonary bypass; tissue factor pathway inhibitor*; aprotinin; heparin; active coagulation time*; heart surgery
组织因子途径抑制物(Tissue Factor Pathway Inhibitor; TFPI)又称外源性凝血途径抑制物，是近年确定的一种内源性抗凝蛋白，可在抑制组织因子介导的凝血途径中发挥重要作用[1]。临床上发现TFPI的改变与某些恶性肿瘤、败血症、血栓性疾病、血友病及心脑血管疾病等相关联[2]。体外循环心脏手术过程中，由于使用肝素和体外循环(CPB)，机体凝血系统将产生一系列变化。CPB心脏手术围术期TFPI将如何变化?抑肽酶在CPB中的使用可否影响肝素诱导释放TFPI?目前国内外尚未见此类文献报道。笔者对此进行了初步观察，现将结果报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 选择96年3～5月我院住院的心脏手术病人20例，男13例，女7例，年龄4～37(平均14.2±8.6)岁。其中室间隔缺损11例，房间隔缺损2例，肺动脉狭窄1例，二尖瓣置换3例，主动脉瓣置换3例。20例病人中有14例使用抑肽酶(40?kU.kg-1)。所有病人均无血液系统疾病史。
1.2 方法
1.2.1 标本的采集 本组病人均在气管插管、全麻、体外循环下行心内直视手术。病人在心脏插管前，先行全身肝素化，剂量为3?mg.kg-1，体外循环机器预充液中肝素用量为每100?ml中2?mg。术中根据激活凝血时间(ACT)的长短决定是否追加肝素。如ACT值<480?s，即追加肝素1?mg.kg-1.h-1，停止体外循环，拔除心脏插管后，给予1～1.3倍肝素量的鱼精蛋白以中和肝素。采集标本时间为术前，肝素化后10?min，体外循环30?min,术毕及术后24?h。采集桡动脉血标本作血浆TFPI及全血ACT的测定。
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1.2.2 TFPI抗原的测定 采用双夹心酶联免疫法[3]。血标本用3.8%枸椽酸三钠按1∶9(V/V)抗凝，6?000?r.min-1离心10?min，取血浆于-70℃保存。将冻存血浆在37℃下温育15?min，用20倍缓冲液稀释，取0.1?ml稀释血浆或TFPI标准液(美国ADI公司生产)至已复被包被抗体的酶标孔，37℃孵育1h，用缓冲液缓冲洗4次。加入0.1?ml鼠抗人TFPI单克隆抗体(4F8)作为检测抗体，37℃孵育1h，以缓冲液冲洗4次。加入0.1?ml酶标羊抗鼠IgG(Southern Biotechnology Associates公司产品)，37℃作用1h，以缓冲液冲洗4次，加入0.1?ml发色底物，37℃孵育30?min，每孔加2?mol H2SO4 50?μl终止反应。在酶标仪上测得492?nm吸光度，绘成标准曲线上计算得TFPI抗原的含量。检测药盒由湖南医科大学止血生理实验室提供。
1.2.3 激活凝血时间的测定 取全血0.5?ml，立即放入双道测试药筒中，起始ACT测生仪，从显示器上读取ACT值。检测仪器及测试药筒为美国Metronic公司产品。
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1.3 统计学处理 计量资料用
±s表示，组间及组内比较用t检验。
2 结 果
2.1 体外循环的时间 本组病人体外循环时间平均为71.6±44.5?min。其中<55?min者11例，平均时间为39.8±10.3?min；>80?min者9例，平均时间为110.6±38.4?min。所有病人术后均顺利恢复，未发生大出血等血液系统的并发症。
2.2 TFPI值的测定 体外循环心脏手术围术期，TFPI值在肝素化后较术前明显升高(P<0.01)，CPB过程中亦明显升高(P<0.01)，鱼精蛋白中和肝素后即下降至术前水平(图1)。
, http://www.100md.com 图1 体外循环围术期TFPI的变化
Fig.1 Changes of TFPI in peri-operation of CPB
2.3 ACT值的测定 肝素化后和CPB中ACT值均较术前明显延长(均P<0.01)；鱼精蛋白中和肝素后ACT下降至术前水平，其变化与TFPI的变化相似(图2)。
图2 体外循环围术期ACT的变化
Fig.2 Changes of ACT in peri-operation of CPB
2.4 体外循环时间长短与TFPI的关系 CPB时间39.8±10.3?min与CPB时间110.6±38.4?min二者的TFPI的变化说明TFPI的变化可能与体外循环时间长短无明显关系(图3)。
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图3 不同体外循环时间TFPI的变化
Fig.3 Changes of TFPI in the different CPB time
2.5 不同性别病人TFPI的变化 体外循环心脏手术围术期男性病人与女性病人TFPI的变化相似(图4)。
图4 不同性别病人体外循环围术期TFPI的变化
Fig. 4 Changes of TFPI in patients with different sexes
2.6 抑肽酶对TFPI的影响 体外循环机制预充液中加入抑肽酶组与未加入抑肽酶组的TFPI 变化相似，两组比较差异无显著性 (P>0.05)(图5)。
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图5 抑肽酶对体外循环围术期TFPI的影响
Fig.5 Affection of aprotinin of TFPI in peri-operation of CPB
3 讨 论
TFPI是一个具有276个氨基酸残基的单肽链蛋白质，整个肽链分为5个不同区域，即带高度负电荷的N端，带高度正电荷的C端，以及中间3个Kunitz功能域。TFPI主要以3种方式存在于血液中：①部分游离存在，大多以与脂蛋白结合的方式存在于血浆，血管内皮是产生血浆TFPI的主要部位；②存在于血小板的一种不同于α颗粒和溶酶体的新型颗粒中，由血小板本身产生；③血管内皮细胞合成的TFPI在正常条件下大部分以与血管内皮腔面的糖胺聚糖相结合的形式存在，这种TFPI与肝素有很强的亲和力。在TFPI的C端以及第三个Kunitz抑制区均有肝素的结合点[4]。在肝素的作用下，与血管内皮糖胺聚糖结合的TFPI可大量释放入血液循环。这类完整的TFPI较血浆中与脂蛋白结合的TFPI对xa与Ⅶa/TF有更大的催化抑制活性。TFPI与因子xa(Fxa)结合，直接抑制Fxa的催化活性，在Ca2+存在的条件下，再以Fxa依赖方式与FⅦa/TF结合，形成Fxa-TFPI-FⅦa/TF四合体，从而抑制FⅦa/TF对Fxa和Fx的催化活性，发挥抗凝作用[5]。因此，肝素在体内的强抗凝作用，除通过增强抗凝血酶Ⅲ的作用外，主要与TFPI释放有关。
, 百拇医药
在体外循环心内直视手术过程中，心脏插管、体外循环及手术损伤等将激活机体内、外源性凝血途径产生凝血。因此在插管行体外循环前，需先行全身肝素化以防凝血。本实验发现在肝素化后10?min，血浆中TFPI较术前明显增高，是术前的3倍多[6]；在体外循环过程中TFPI亦升高，而使用鱼精蛋白后，TFPI即下降至术前水平，说明肝素使内皮细胞释放TFPI入血，参与抗凝过程，而使用适量鱼精蛋白后，中和了体内肝素，使TFPI恢复正常。
CPB围术期TFPI与ACT的变化相似，说明术中肝素用量恰当，使ACT值在手术要求的范围内波动，起到抗凝作用。CPB时间的长短及性别不同，TFPI的变化相似，说明TFPI的变化不受CPB时间和性别的影响。抑肽酶在CPB手术中起着重要作用，主要通过抑制激肽释放酶以抑制纤溶与保护血小板功能，达到减少术后出血的作用。笔者在预充液中加入抑肽酶与未加抑肽酶，二组TFPI的变化相似，各时点比较亦差异无显著性，说明抑肽酶可能对血浆TFPI水平无影响，不影响肝素的抗凝作用。
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综上所述，TFPI在CPB心脏手术围术期的变化与肝素的抗凝作用有着密切的关系。本组病例未发现TFPI和ACT在术前、术中及术后出现异常的病理变化，其变化符合CPB心脏手术中的病理生理变化。
作者：陈胜喜 男 52岁 教授 ①湖南省卫生厅资助课题(94-4)
参考文献
[1]Broze GJ Jr. Tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost, 1995,74:90-93
[2]Bajij MS, Rana SV, Wysolmerski RB, et al. Inhibitor of the factor Ⅶa-tissue factor complex is reduced in patients with disseminated intravascular coagulation, but not in patients with severe hepatocellular disease. J Clin Invest, 1987,79:1874-1879
, 百拇医药
[3]杨寅柯，何晓凡，李俊成，等.抗组织因子途径抑制物单克隆抗体的制备及鉴定.中华血液学杂志，1997，18(3)：118-122
[4]Broze GJ Jr, Wesselschmidt R, Higuchi D, et al. The interaction between LACI and heparin. Adv Exp Med Biol, 1993,313:189-192
[5]Broze GJ Jr, Warren LA, Novotny WF. The lipoprotein associated coagulation inhibitor that inhibits factor Ⅶ-tissue factor complex also inhibits xa: Insight into the possible mechanism of action. Blood, 1988,71:335-337
[6]Novotny WF, Brown SG, Miletich JP, et al. Plasma antigen levels of the lipoprotein associated coagulation inhibitor in patient samples. Blood, 1991,78:387-389
1997-11-24 收稿, 百拇医药
单位：陈胜喜 李国虎 许廖梅 何争鸣(附属湘雅医院胸心外科 长沙 410008)
关键词：体外循环；组织因子途径抑制物*；肝素；激活凝血时间*；心脏外科学
湖南医科大学学报990109 提要 检测20例体外循环心内直视手术病人围术期血浆组织因子途径抑制物(TFPI)及激活凝血时间(ACT)，结果发现肝素化后及体外循环过程中TFPI与ACT明显升高，二者变化相似，预充液中加入抑肽酶对TFPI的变化无明显影响。提示TFPI在体外循环过程中起抗凝血作用。
中国图书分类号 R654.1
Affection of aprotinin on tissue factor pathway inhibitor in
, 百拇医药
peri-operation of cardiac direct vision operation
Chen Shengxi Li Guohu Xu Liaomei He Zhengmin
(Department of Cardiothoracic Surgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008)
Twenty patients underwent cardiac operation with cardiopulmonary bypass(CPB). We collected their blood samples during peri-operation and measured tissue factor pathway inhibitor(TFPI) and active coagulation time(ACT). The results were that TFPI and ACT were significantly increased after heparin injection and during CPB. The changes of TFPI and ACT were similar and pathophysiological; it was evident that heparin stimulated TFPI release and ACT prolonged during cardiac operation with CPB. Aprotinin did not affect the change of TFPI. The results suggest that TFPI has the effect on anticoagulation during CPB.
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Key words cardiopulmonary bypass; tissue factor pathway inhibitor*; aprotinin; heparin; active coagulation time*; heart surgery
组织因子途径抑制物(Tissue Factor Pathway Inhibitor; TFPI)又称外源性凝血途径抑制物，是近年确定的一种内源性抗凝蛋白，可在抑制组织因子介导的凝血途径中发挥重要作用[1]。临床上发现TFPI的改变与某些恶性肿瘤、败血症、血栓性疾病、血友病及心脑血管疾病等相关联[2]。体外循环心脏手术过程中，由于使用肝素和体外循环(CPB)，机体凝血系统将产生一系列变化。CPB心脏手术围术期TFPI将如何变化?抑肽酶在CPB中的使用可否影响肝素诱导释放TFPI?目前国内外尚未见此类文献报道。笔者对此进行了初步观察，现将结果报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 选择96年3～5月我院住院的心脏手术病人20例，男13例，女7例，年龄4～37(平均14.2±8.6)岁。其中室间隔缺损11例，房间隔缺损2例，肺动脉狭窄1例，二尖瓣置换3例，主动脉瓣置换3例。20例病人中有14例使用抑肽酶(40?kU.kg-1)。所有病人均无血液系统疾病史。
1.2 方法
1.2.1 标本的采集 本组病人均在气管插管、全麻、体外循环下行心内直视手术。病人在心脏插管前，先行全身肝素化，剂量为3?mg.kg-1，体外循环机器预充液中肝素用量为每100?ml中2?mg。术中根据激活凝血时间(ACT)的长短决定是否追加肝素。如ACT值<480?s，即追加肝素1?mg.kg-1.h-1，停止体外循环，拔除心脏插管后，给予1～1.3倍肝素量的鱼精蛋白以中和肝素。采集标本时间为术前，肝素化后10?min，体外循环30?min,术毕及术后24?h。采集桡动脉血标本作血浆TFPI及全血ACT的测定。
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1.2.2 TFPI抗原的测定 采用双夹心酶联免疫法[3]。血标本用3.8%枸椽酸三钠按1∶9(V/V)抗凝，6?000?r.min-1离心10?min，取血浆于-70℃保存。将冻存血浆在37℃下温育15?min，用20倍缓冲液稀释，取0.1?ml稀释血浆或TFPI标准液(美国ADI公司生产)至已复被包被抗体的酶标孔，37℃孵育1h，用缓冲液缓冲洗4次。加入0.1?ml鼠抗人TFPI单克隆抗体(4F8)作为检测抗体，37℃孵育1h，以缓冲液冲洗4次。加入0.1?ml酶标羊抗鼠IgG(Southern Biotechnology Associates公司产品)，37℃作用1h，以缓冲液冲洗4次，加入0.1?ml发色底物，37℃孵育30?min，每孔加2?mol H2SO4 50?μl终止反应。在酶标仪上测得492?nm吸光度，绘成标准曲线上计算得TFPI抗原的含量。检测药盒由湖南医科大学止血生理实验室提供。
1.2.3 激活凝血时间的测定 取全血0.5?ml，立即放入双道测试药筒中，起始ACT测生仪，从显示器上读取ACT值。检测仪器及测试药筒为美国Metronic公司产品。
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1.3 统计学处理 计量资料用
±s表示，组间及组内比较用t检验。2 结 果
2.1 体外循环的时间 本组病人体外循环时间平均为71.6±44.5?min。其中<55?min者11例，平均时间为39.8±10.3?min；>80?min者9例，平均时间为110.6±38.4?min。所有病人术后均顺利恢复，未发生大出血等血液系统的并发症。
2.2 TFPI值的测定 体外循环心脏手术围术期，TFPI值在肝素化后较术前明显升高(P<0.01)，CPB过程中亦明显升高(P<0.01)，鱼精蛋白中和肝素后即下降至术前水平(图1)。
, http://www.100md.com 图1 体外循环围术期TFPI的变化
Fig.1 Changes of TFPI in peri-operation of CPB
2.3 ACT值的测定 肝素化后和CPB中ACT值均较术前明显延长(均P<0.01)；鱼精蛋白中和肝素后ACT下降至术前水平，其变化与TFPI的变化相似(图2)。
图2 体外循环围术期ACT的变化
Fig.2 Changes of ACT in peri-operation of CPB
2.4 体外循环时间长短与TFPI的关系 CPB时间39.8±10.3?min与CPB时间110.6±38.4?min二者的TFPI的变化说明TFPI的变化可能与体外循环时间长短无明显关系(图3)。
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图3 不同体外循环时间TFPI的变化
Fig.3 Changes of TFPI in the different CPB time
2.5 不同性别病人TFPI的变化 体外循环心脏手术围术期男性病人与女性病人TFPI的变化相似(图4)。
图4 不同性别病人体外循环围术期TFPI的变化
Fig. 4 Changes of TFPI in patients with different sexes
2.6 抑肽酶对TFPI的影响 体外循环机制预充液中加入抑肽酶组与未加入抑肽酶组的TFPI 变化相似，两组比较差异无显著性 (P>0.05)(图5)。
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图5 抑肽酶对体外循环围术期TFPI的影响
Fig.5 Affection of aprotinin of TFPI in peri-operation of CPB
3 讨 论
TFPI是一个具有276个氨基酸残基的单肽链蛋白质，整个肽链分为5个不同区域，即带高度负电荷的N端，带高度正电荷的C端，以及中间3个Kunitz功能域。TFPI主要以3种方式存在于血液中：①部分游离存在，大多以与脂蛋白结合的方式存在于血浆，血管内皮是产生血浆TFPI的主要部位；②存在于血小板的一种不同于α颗粒和溶酶体的新型颗粒中，由血小板本身产生；③血管内皮细胞合成的TFPI在正常条件下大部分以与血管内皮腔面的糖胺聚糖相结合的形式存在，这种TFPI与肝素有很强的亲和力。在TFPI的C端以及第三个Kunitz抑制区均有肝素的结合点[4]。在肝素的作用下，与血管内皮糖胺聚糖结合的TFPI可大量释放入血液循环。这类完整的TFPI较血浆中与脂蛋白结合的TFPI对xa与Ⅶa/TF有更大的催化抑制活性。TFPI与因子xa(Fxa)结合，直接抑制Fxa的催化活性，在Ca2+存在的条件下，再以Fxa依赖方式与FⅦa/TF结合，形成Fxa-TFPI-FⅦa/TF四合体，从而抑制FⅦa/TF对Fxa和Fx的催化活性，发挥抗凝作用[5]。因此，肝素在体内的强抗凝作用，除通过增强抗凝血酶Ⅲ的作用外，主要与TFPI释放有关。
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在体外循环心内直视手术过程中，心脏插管、体外循环及手术损伤等将激活机体内、外源性凝血途径产生凝血。因此在插管行体外循环前，需先行全身肝素化以防凝血。本实验发现在肝素化后10?min，血浆中TFPI较术前明显增高，是术前的3倍多[6]；在体外循环过程中TFPI亦升高，而使用鱼精蛋白后，TFPI即下降至术前水平，说明肝素使内皮细胞释放TFPI入血，参与抗凝过程，而使用适量鱼精蛋白后，中和了体内肝素，使TFPI恢复正常。
CPB围术期TFPI与ACT的变化相似，说明术中肝素用量恰当，使ACT值在手术要求的范围内波动，起到抗凝作用。CPB时间的长短及性别不同，TFPI的变化相似，说明TFPI的变化不受CPB时间和性别的影响。抑肽酶在CPB手术中起着重要作用，主要通过抑制激肽释放酶以抑制纤溶与保护血小板功能，达到减少术后出血的作用。笔者在预充液中加入抑肽酶与未加抑肽酶，二组TFPI的变化相似，各时点比较亦差异无显著性，说明抑肽酶可能对血浆TFPI水平无影响，不影响肝素的抗凝作用。
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综上所述，TFPI在CPB心脏手术围术期的变化与肝素的抗凝作用有着密切的关系。本组病例未发现TFPI和ACT在术前、术中及术后出现异常的病理变化，其变化符合CPB心脏手术中的病理生理变化。
作者：陈胜喜 男 52岁 教授 ①湖南省卫生厅资助课题(94-4)
参考文献
[1]Broze GJ Jr. Tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost, 1995,74:90-93
[2]Bajij MS, Rana SV, Wysolmerski RB, et al. Inhibitor of the factor Ⅶa-tissue factor complex is reduced in patients with disseminated intravascular coagulation, but not in patients with severe hepatocellular disease. J Clin Invest, 1987,79:1874-1879
, 百拇医药
[3]杨寅柯，何晓凡，李俊成，等.抗组织因子途径抑制物单克隆抗体的制备及鉴定.中华血液学杂志，1997，18(3)：118-122
[4]Broze GJ Jr, Wesselschmidt R, Higuchi D, et al. The interaction between LACI and heparin. Adv Exp Med Biol, 1993,313:189-192
[5]Broze GJ Jr, Warren LA, Novotny WF. The lipoprotein associated coagulation inhibitor that inhibits factor Ⅶ-tissue factor complex also inhibits xa: Insight into the possible mechanism of action. Blood, 1988,71:335-337
[6]Novotny WF, Brown SG, Miletich JP, et al. Plasma antigen levels of the lipoprotein associated coagulation inhibitor in patient samples. Blood, 1991,78:387-389
1997-11-24 收稿, 百拇医药