小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序的筛选
作者：吴丰春 魏 泓
单位：第三军医大学实验动物中心 重庆，400038
关键词：随机扩增多态性DNA；筛选
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL
提 要：目的：筛选优化小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法：以40条引物对9个品系的小鼠基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD-PCR，分析比较扩增结果。结果：在下列反应体系及扩增程序下结果较好：在25 μl的反应体系中含有10×buffer 2.5 μl,dNTP 200μmol/L, Mg2+ 2.5 mmol/L，引物0.2 μmol/L，Taq酶1.5 U，模板DNA 20 ng，扩增程序为94℃变性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环后接10 min延伸。结论：以上述反应体系及扩增程序进行小鼠RAPD-PCR，扩增结果稳定。
, http://www.100md.com
中图法分类号：Q751
Optimizing of RAPD-PCR procedure in mice*
Wu Fengchun, Wei Hong
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To optimize the RAPD-PCR procedure in mice. Methods: Forty primers were used to amplify DNA in 9 strains of mice and then the results of the amplification were analyzed. Results: Optimal reaction system was as follows: 25 μl of each PCR mixture containing 2.5 μl of 10×Taq Reaction buffer, 200 μmol/L of each dNTPs, 2.5 mmo/L of Mg2+, 0.2 μmol/L of primer, 1.5 unit of Taq DNA polymerase and 20 ng of total DNA. The reaction condition was 40 cycles of denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 38℃ for 1 min and extension at 72℃ for 2 min. Conclusion: The use of the above-mentioned reaction system and amplifying procedure for RAPD-PCR in mice can get stable results.
, 百拇医药
Key words random amplified polymorphic DNA; optimizing
* This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.3960079
RAPD(Random amplified polymorphic，DNA)是近几年发展起来的一项DNA多态检测技术，由于其快速、简单、方便、经济、规范等优点，在动物、植物、微生物种属鉴定、亲缘关系的划分及多态性分析中得到广泛应用[1]。然而RAPD技术还不成熟，亦有一定缺点，主要表现在各实验室结果可比性差，重复性差，这是因为RAPD技术对实验条件要求十分严格，RAPD图谱受诸多因素影响[2]。为此本实验对小鼠RAPD-PCR的反应体系及扩增程序进行了筛选及分析，以便获得稳定的扩增结果。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 TA1、BALB/c、DBA/2、615、BALB/c-nu/nu、T739、SCID近交系小鼠和昆明鼠、NIH封闭群小鼠各5只，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 10×buffer、Taq酶、Mg2+、dNTP均为德国BM公司产品。
1.1.3 PCR仪 美国PE2400型。
1.1.4 引物 采用美国Operon Technologies公司的两套试剂盒：Primer kits for RAPDS AB-0320-kitN及AB-0320-kit2，每套试剂盒含20条引物，共40条引物。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 取小鼠尾部组织100 mg剪碎，匀浆，加消化液(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L NaCl,1.0% SDS, 200 μg/ml蛋白酶K，pH8.0)消化，按常规方法提取DNA，乙醇沉淀，TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 1 mmol/L EDTA)溶解，各品系内小鼠DNA样品混匀，构成DNA样品池[3]。
1.2.2 RAPD-PCR反应体系及扩增程序的筛选在RAPD-PCR反应体系及扩增程序基本模式的基础上，分析改变预变性时间、退火温度、循环次数、dNTP的浓度、Mg2+的浓度、Taq的浓度、引物浓度、分析其对结果的影响。
2 结果
2.1 模板DNA预变性时间对RAPD-PCR的影响
, 百拇医药
实验中我们分别采用对模板DNA进行预变性10、8、5、3、2、1min，以及不进行预变性94℃直接启动的方法进行RAPD-PCR，结果显示，模板DNA预变性时间的长短，以及是否预变性，对扩增结果影响不大，94℃直接启动变性1min后足以扩增出较好的结果，见图1。
图1 预变性时间对RAPD-PCR的影响
Fig 1 Effects of pre-denaturation time on RAPD-PCR
a.10 min；b.8 min；c.5 min；d.3 min；e.2 min；f.1 min；g.0 min；DNA BALB/c小鼠；引物：ABN-05; 1. Amplified DNA: DNA of BALB/c mouse genome；2. Primer used: ABN-05
, 百拇医药
2.2 退火温度对RAPD-PCR的影响
在RAPD-PCR体系中不同模板DNA，不同引物，其最适退火温度不同[4]，实验中我们采用ABN-11引物分别与上述9品系小鼠的模板DNA反应和DBA/2小鼠的模板DNA分别与上述40种引物反应的方法，在退火温度分别为36℃、38℃、40℃、45℃、50℃条件下进行RAPD-PCR，发现在36℃～42℃范围内随温度升高，RAPD谱带更清晰，特异性更强，但在40℃时有阴性结果出现，并随退火温度的升高，结果阴性率逐渐增多，在45℃退火条件下，结果阴性率不但更高，RAPD谱带反而变弱，50℃退火时，很难扩增出结果，说明随退火温度的升高，引物和模板结合的特异性增强，结合的机率减少。反之，引物和模板结合的特异性降低，结合的机率增加。考虑到既要尽量避免出现阴性结果，又要增强结果的特异性，我们认为退火温度为38℃较适宜。
2.3 循环次数对RAPD-PCR的影响
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RAPD-PCR循环次数的多少直接影响扩增产物的量及结果的特异性，循环次数少，产物量少；循环次数太多，则有非特异性产物产生。因为PCR反应到达一定程度后，会产生平台效应[5]，过多的循环会增加非特异产物的数量和复杂性，本实验认为循环次数为35～40次足够。
2.4 dNTP浓度对RAPD-PCR的影响
dNTP是反应的底物，其浓度过低影响反应速度和产量，表现为RAPD谱带中明带变强，弱带消失；其浓度过高又会增加碱基误配，导致非特异产物增加，RAPD谱带中非特异带增加，我们分别在dNTP浓度为100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L的情况下进行RAPD-PCR，发现dNTP浓度为200 μmol/L时扩增结果较理想，见图2。
, http://www.100md.com 图2 dNTP浓度对RAPD-PCR的影响
Fig 2 Effects of dNTP′s concentrations on PAPD-PCR
a. 250 μmol/L; b. 200 μmol/L; c. 150 μmol/L； d. 100 μmol/L; m. Marker; DNA.DBA/2小鼠；引物：AB2-20；1. Amplified DNA:DNA of DBA/2 mouse genome；2. primer used:AB2-20
2.5 Mg2+浓度对RAPD-PCR的影响
Mg2+是Taq酶的激活剂，除直接影响PCT的特异性和效率外，也有利于引物和模板的结合及增加引物和模板结合后的稳定性，这对于使用非特异性引物的RAPD-PCR反应来讲，Mg2+显得更重要，因此在RAPD-PCR反应中要使用高浓度Mg2+(可达2.5 mmol/L或更高，一般PCR Mg2+浓度为1.5 mmol/L)[6]。但是反应体系中所示Mg2+浓度，并不一定是参加反应的游离Mg2+浓度，因为反应体系中DNA模板的浓度、纯度、引物、dNTP均会影响Mg2+浓度。因此，在优化Mg2+最适浓度时应设置几个浓度梯度来精确其最适浓度。经本实验筛选认为Mg2+浓度为2.5 mmol/L时扩增结果较好。
, 百拇医药
2.6 Taq酶对RAPD-PCR的影响
Taq酶的浓度决定产物的特异性和产量，Taq酶浓度太高会增加非特异性产物，过低又会使产物量降低。本实验认为，在25 μl的反应体系中加入1.5 U的酶较合适。另外，不同厂家从不同菌株上分离的Taq酶其活性可能有差异应加以注意。
2.7 引物浓度对RAPD-PCR的影响
由于RAPD-PCR反应使用的是单一的随机引物，所以反应体系中使用高浓度引物更有利于造成引物和模板错配的机会，但是引物浓度不宜太高，否则会有非特异性产物产生，反应体系中含有0.2 μmol/L的引物即可。
3 讨论
对RAPD-PCR影响因素很多，除本实验涉及的因素外下列因素也都对RAPD-PCR有影响：①模板DNA的浓度及纯度，因为引物和不同浓度的模板DNA结合有所不同，DNA在制备过程中若残留过多的酚、氯仿、酒精、蛋白质等均对RAPD-PCR有影响；②反应体系中其它杂质离子浓度过高也影响RAPD-PCR，我们在实验中发现，当反应体系中Na+浓度超过40 mmol/L时，很难扩增出结果；③由于不同厂家生产的PCR仪控温精度有所不同，因此在优化RAPD-PCR条件也应注意；④不同厂家生产的反应缓冲液成份的细微差异，甚至即使同一厂家生产的缓冲液，若使用的Mg2+、Taq酶与之不匹配有时也影响RAPD-PCR。另外，实验人员素质的差别对反应也有影响，但是只要条件稳定，操作中养成严谨的态度，对影响因素引起足够的重视，其结果是具有重复性的，RAPD技术本身是稳定的。
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综上所述，在本实验条件下得到的小鼠较好的RAPD-PCR反应体系及扩增程序为：在25 μl的反应体系中含有10×buffer 2.5 μl,dNTP 200 μmol/L Mg2+ 2.5 mmol/L，引物0.2 μmol/L，Taq酶1.5 U，模板DNA 20 ng，扩增程序为94℃变性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环后接10 min延伸。
国家自然科学基金资助项目，NO.3960079 全军"九五"医药卫生科研基金资助项目，NO.96M038 重庆市攻关项目资助
作者简介：吴丰春，男，29岁，助教，学士
参考文献
[1] Chalmers K J, Waugh R. Detection of gonetic variation between and within population of gliricidia sepium and G, maculata using RAPD markers. Heredity,1996,69( ):465
, 百拇医药
[2] 刘恩岐，张 薇，徐仓宝，等.RAPD技术在实验动物学研究中的应用.实验动物科学与管理，1997，14(4)：57
[3] 张文艳，龚春梅.一种新的近交系实验动物遗传监测方法及小鼠性别相关RAPD标记的发现.实验生物学报，1996，29(4)：59
[4] 陈永久，张亚平.随机扩增多态DNA影响因素的研究.动物学研究，1997，18(2)：221
[5] 林万明 主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.9～11
[6] 孟祥文，李 璞.AP-PCR技术及应用.国外医学：遗传学分册，1995，18(3)：117
收稿：1998-09-04；修回：1998-12-09, 百拇医药
单位：第三军医大学实验动物中心 重庆，400038
关键词：随机扩增多态性DNA；筛选
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL
提 要：目的：筛选优化小鼠RAPD-PCR反应体系及扩增程序。方法：以40条引物对9个品系的小鼠基因组DNA在各种不同条件下进行RAPD-PCR，分析比较扩增结果。结果：在下列反应体系及扩增程序下结果较好：在25 μl的反应体系中含有10×buffer 2.5 μl,dNTP 200μmol/L, Mg2+ 2.5 mmol/L，引物0.2 μmol/L，Taq酶1.5 U，模板DNA 20 ng，扩增程序为94℃变性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环后接10 min延伸。结论：以上述反应体系及扩增程序进行小鼠RAPD-PCR，扩增结果稳定。
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中图法分类号：Q751
Optimizing of RAPD-PCR procedure in mice*
Wu Fengchun, Wei Hong
(Laboratory Animal Center, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To optimize the RAPD-PCR procedure in mice. Methods: Forty primers were used to amplify DNA in 9 strains of mice and then the results of the amplification were analyzed. Results: Optimal reaction system was as follows: 25 μl of each PCR mixture containing 2.5 μl of 10×Taq Reaction buffer, 200 μmol/L of each dNTPs, 2.5 mmo/L of Mg2+, 0.2 μmol/L of primer, 1.5 unit of Taq DNA polymerase and 20 ng of total DNA. The reaction condition was 40 cycles of denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 38℃ for 1 min and extension at 72℃ for 2 min. Conclusion: The use of the above-mentioned reaction system and amplifying procedure for RAPD-PCR in mice can get stable results.
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Key words random amplified polymorphic DNA; optimizing
* This project was supported by the National Natural Science Foundation of China,No.3960079
RAPD(Random amplified polymorphic，DNA)是近几年发展起来的一项DNA多态检测技术，由于其快速、简单、方便、经济、规范等优点，在动物、植物、微生物种属鉴定、亲缘关系的划分及多态性分析中得到广泛应用[1]。然而RAPD技术还不成熟，亦有一定缺点，主要表现在各实验室结果可比性差，重复性差，这是因为RAPD技术对实验条件要求十分严格，RAPD图谱受诸多因素影响[2]。为此本实验对小鼠RAPD-PCR的反应体系及扩增程序进行了筛选及分析，以便获得稳定的扩增结果。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 TA1、BALB/c、DBA/2、615、BALB/c-nu/nu、T739、SCID近交系小鼠和昆明鼠、NIH封闭群小鼠各5只，由第三军医大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 10×buffer、Taq酶、Mg2+、dNTP均为德国BM公司产品。
1.1.3 PCR仪 美国PE2400型。
1.1.4 引物 采用美国Operon Technologies公司的两套试剂盒：Primer kits for RAPDS AB-0320-kitN及AB-0320-kit2，每套试剂盒含20条引物，共40条引物。
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1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 取小鼠尾部组织100 mg剪碎，匀浆，加消化液(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L NaCl,1.0% SDS, 200 μg/ml蛋白酶K，pH8.0)消化，按常规方法提取DNA，乙醇沉淀，TE(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 1 mmol/L EDTA)溶解，各品系内小鼠DNA样品混匀，构成DNA样品池[3]。
1.2.2 RAPD-PCR反应体系及扩增程序的筛选在RAPD-PCR反应体系及扩增程序基本模式的基础上，分析改变预变性时间、退火温度、循环次数、dNTP的浓度、Mg2+的浓度、Taq的浓度、引物浓度、分析其对结果的影响。
2 结果
2.1 模板DNA预变性时间对RAPD-PCR的影响
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实验中我们分别采用对模板DNA进行预变性10、8、5、3、2、1min，以及不进行预变性94℃直接启动的方法进行RAPD-PCR，结果显示，模板DNA预变性时间的长短，以及是否预变性，对扩增结果影响不大，94℃直接启动变性1min后足以扩增出较好的结果，见图1。
图1 预变性时间对RAPD-PCR的影响
Fig 1 Effects of pre-denaturation time on RAPD-PCR
a.10 min；b.8 min；c.5 min；d.3 min；e.2 min；f.1 min；g.0 min；DNA BALB/c小鼠；引物：ABN-05; 1. Amplified DNA: DNA of BALB/c mouse genome；2. Primer used: ABN-05
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2.2 退火温度对RAPD-PCR的影响
在RAPD-PCR体系中不同模板DNA，不同引物，其最适退火温度不同[4]，实验中我们采用ABN-11引物分别与上述9品系小鼠的模板DNA反应和DBA/2小鼠的模板DNA分别与上述40种引物反应的方法，在退火温度分别为36℃、38℃、40℃、45℃、50℃条件下进行RAPD-PCR，发现在36℃～42℃范围内随温度升高，RAPD谱带更清晰，特异性更强，但在40℃时有阴性结果出现，并随退火温度的升高，结果阴性率逐渐增多，在45℃退火条件下，结果阴性率不但更高，RAPD谱带反而变弱，50℃退火时，很难扩增出结果，说明随退火温度的升高，引物和模板结合的特异性增强，结合的机率减少。反之，引物和模板结合的特异性降低，结合的机率增加。考虑到既要尽量避免出现阴性结果，又要增强结果的特异性，我们认为退火温度为38℃较适宜。
2.3 循环次数对RAPD-PCR的影响
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RAPD-PCR循环次数的多少直接影响扩增产物的量及结果的特异性，循环次数少，产物量少；循环次数太多，则有非特异性产物产生。因为PCR反应到达一定程度后，会产生平台效应[5]，过多的循环会增加非特异产物的数量和复杂性，本实验认为循环次数为35～40次足够。
2.4 dNTP浓度对RAPD-PCR的影响
dNTP是反应的底物，其浓度过低影响反应速度和产量，表现为RAPD谱带中明带变强，弱带消失；其浓度过高又会增加碱基误配，导致非特异产物增加，RAPD谱带中非特异带增加，我们分别在dNTP浓度为100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L的情况下进行RAPD-PCR，发现dNTP浓度为200 μmol/L时扩增结果较理想，见图2。
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Fig 2 Effects of dNTP′s concentrations on PAPD-PCR
a. 250 μmol/L; b. 200 μmol/L; c. 150 μmol/L； d. 100 μmol/L; m. Marker; DNA.DBA/2小鼠；引物：AB2-20；1. Amplified DNA:DNA of DBA/2 mouse genome；2. primer used:AB2-20
2.5 Mg2+浓度对RAPD-PCR的影响
Mg2+是Taq酶的激活剂，除直接影响PCT的特异性和效率外，也有利于引物和模板的结合及增加引物和模板结合后的稳定性，这对于使用非特异性引物的RAPD-PCR反应来讲，Mg2+显得更重要，因此在RAPD-PCR反应中要使用高浓度Mg2+(可达2.5 mmol/L或更高，一般PCR Mg2+浓度为1.5 mmol/L)[6]。但是反应体系中所示Mg2+浓度，并不一定是参加反应的游离Mg2+浓度，因为反应体系中DNA模板的浓度、纯度、引物、dNTP均会影响Mg2+浓度。因此，在优化Mg2+最适浓度时应设置几个浓度梯度来精确其最适浓度。经本实验筛选认为Mg2+浓度为2.5 mmol/L时扩增结果较好。
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2.6 Taq酶对RAPD-PCR的影响
Taq酶的浓度决定产物的特异性和产量，Taq酶浓度太高会增加非特异性产物，过低又会使产物量降低。本实验认为，在25 μl的反应体系中加入1.5 U的酶较合适。另外，不同厂家从不同菌株上分离的Taq酶其活性可能有差异应加以注意。
2.7 引物浓度对RAPD-PCR的影响
由于RAPD-PCR反应使用的是单一的随机引物，所以反应体系中使用高浓度引物更有利于造成引物和模板错配的机会，但是引物浓度不宜太高，否则会有非特异性产物产生，反应体系中含有0.2 μmol/L的引物即可。
3 讨论
对RAPD-PCR影响因素很多，除本实验涉及的因素外下列因素也都对RAPD-PCR有影响：①模板DNA的浓度及纯度，因为引物和不同浓度的模板DNA结合有所不同，DNA在制备过程中若残留过多的酚、氯仿、酒精、蛋白质等均对RAPD-PCR有影响；②反应体系中其它杂质离子浓度过高也影响RAPD-PCR，我们在实验中发现，当反应体系中Na+浓度超过40 mmol/L时，很难扩增出结果；③由于不同厂家生产的PCR仪控温精度有所不同，因此在优化RAPD-PCR条件也应注意；④不同厂家生产的反应缓冲液成份的细微差异，甚至即使同一厂家生产的缓冲液，若使用的Mg2+、Taq酶与之不匹配有时也影响RAPD-PCR。另外，实验人员素质的差别对反应也有影响，但是只要条件稳定，操作中养成严谨的态度，对影响因素引起足够的重视，其结果是具有重复性的，RAPD技术本身是稳定的。
, http://www.100md.com
综上所述，在本实验条件下得到的小鼠较好的RAPD-PCR反应体系及扩增程序为：在25 μl的反应体系中含有10×buffer 2.5 μl,dNTP 200 μmol/L Mg2+ 2.5 mmol/L，引物0.2 μmol/L，Taq酶1.5 U，模板DNA 20 ng，扩增程序为94℃变性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40个循环后接10 min延伸。
国家自然科学基金资助项目，NO.3960079 全军"九五"医药卫生科研基金资助项目，NO.96M038 重庆市攻关项目资助
作者简介：吴丰春，男，29岁，助教，学士
参考文献
[1] Chalmers K J, Waugh R. Detection of gonetic variation between and within population of gliricidia sepium and G, maculata using RAPD markers. Heredity,1996,69( ):465
, 百拇医药
[2] 刘恩岐，张 薇，徐仓宝，等.RAPD技术在实验动物学研究中的应用.实验动物科学与管理，1997，14(4)：57
[3] 张文艳，龚春梅.一种新的近交系实验动物遗传监测方法及小鼠性别相关RAPD标记的发现.实验生物学报，1996，29(4)：59
[4] 陈永久，张亚平.随机扩增多态DNA影响因素的研究.动物学研究，1997，18(2)：221
[5] 林万明 主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.9～11
[6] 孟祥文，李 璞.AP-PCR技术及应用.国外医学：遗传学分册，1995，18(3)：117
收稿：1998-09-04；修回：1998-12-09, 百拇医药