血清可溶性Fas-和FasL-mRNA检测方法的建立
作者：何海棠 骆抗先 王晋豫 朱幼芙 卢桥生
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515
关键词：Fas；FasL；mRNA；血清检测
摘要 摘要：目的 建立可用于研究工作的血清学检测方法。方法 按GenBank 的Fas和FasL序列设计引物, 以相应质粒作阳性材料, 建立各自的RT- PCR。结果 27例慢性乙型肝炎血清检出sFasL-mRNA13例(48.2%), sFas-mRNA21例(77.8%)。结论 目前尚无检测血清抗原的试剂, 相关研究工作中可应用这一技术。
中图分类号：R446.11
Development of reverse transcription polymerase chain reaction assays for serological detection of soluble FasL- and Fas-mRNA
, 百拇医药
He Haitang, Luo Kangxian, Wang Jinyu, Zhu Youfu, Lu Qiaosheng
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish serological methods for detecting these soluble molecules sFas and sFasL. Methods The primers were designed according to the published sequences of Fas and FasL. The well-defined Fas and FasL plasmids were used as positive materials. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assays were established for detecting the soluble FasL- and Fas-mRNA in serum. Results The sera of 27 patients with chronic hepatitis B were tested. Thirteen (48.2%) were sFasL-mRNA seropositive and 21 (77.8%) sFas-mRNA positive. The sFasL-mRNA might derive from liver cells or lymphocytes, and the sFas-mRNA mainly from hepatocytes of hepatitis patients. Conclusions The methodology described in this paper might be used in research work. Combined with the in situ investigations of their membranous molecules, the functions of Fas/FasL in induction of apoptosis may be studied more completely.
, 百拇医药
Key words: Fas; FasL; mRNA; serological assays
Fas及其配体FasL诱导细胞凋亡, 表达FasL的T细胞引起表达Fas的靶细胞凋亡。这两种细胞膜性分子(mFas和mFasL)又都有可溶性分子(sFas和sFasL)。sFas可阻断FasL的作用; sFasL又抑制sFas的作用。我们曾原位研究慢性乙型肝炎及其肝病的肝组织中Fas /FasL诱导的肝细胞凋亡[1]。因国内无检测方法报道, 未能同时研究其可溶性分子的表现, 难以全面评估这一系统在凋亡、进而在肝炎和肝病发病机制中的意义。经长时间探索建立了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 可用于血清学检测。
1 材料和方法
1.1 血清来源 慢性乙型肝炎27例, 均经肝活组织检查确定诊断。健康献血员20例对照。
, http://www.100md.com
1.2 FasL和Fas质粒 作阳性对照的FasL质粒由中山大学生化系徐安龙教授惠赠; Fas质粒为pL430由珠江医院陈俊博士提供。
1.3 血清RNA提取 血清200 μl 加变性缓冲液(异硫氰酸胍4 mol/L, 枸橼酸钠25 mmol/L,十二烷基肌氨酸钠0.5%, β巯基乙醇0.1 mol/L) 200 μl混匀; 加2 mol/L pH4.0 NaAc50 μl混匀; 加饱和酚 200μl、24:1氯仿-异戊醇 200 μl混匀 放置4 ℃15 min; 4 ℃离心12 000 r/min 10 min。取上清液加氯仿-异戊醇400μl混匀, 4 ℃离心12 000 r/min 5 min。取上清加无水乙醇2.5倍, -70 ℃放置1 h。4 ℃离心12 000 r/min 15 min, 弃乙醇, 再用70%乙醇洗沉淀物, 空气干燥, H2O 10 μl悬浮作模板备用。
1.4 RT-PCR
, 百拇医药
1.4.1引物FasL(+):5'-ATGTTTCAGCTCTTCCAC-CTACAGAAGGA;FasL(-):5'-TGACCAGAGAGAG-CTCAGATACGTTGAC。Fas(+): 5'-GGACCCA-GAATACCAAGTGC; Fas(-): 5'-GCCACTGTTT-CAGGATTTAAGG。
1.4.2 cDNA合成 H2O10 μl、模板5 μl、引物 [FasL(-)或Fas(-)]2 μl、5倍浓度反转录缓冲液5μl、10 mmol/L dNTP2 μl混匀, 93 ℃、5 min, 立即冰浴。加M-MLV100 U、RNA酶抑制剂40 U, 混匀, 37 ℃、90 min。
1.4.3 反应 cDNA产物93 ℃、5 min, 冰浴, 加H2O 30 μl, 引物(FasL或Fas一对), 10倍浓度反转录PCR缓冲液5μl, 2 mmol/L dNTP 5 μl, DNAp2.5 U混匀。95℃、50 s，55 ℃、50 s，71 ℃、70 s, 35次循环。
, 百拇医药
1.5 电泳 2%琼脂糖溶于TBE缓冲液, 按常规电泳。
2 结果和讨论
2.1 阳性对照 用FasL质粒作模板, 以相应引物获得PCR电泳带为467 bp (图1), 用Fas质粒作模板, 有300 bp和237 bp的2条带 (图2), 前者可能是膜性分子、后者是可溶性分子, 都符合预期的分子大小。
图1 反转录聚合酶链反应检测FasL-mRNA
Fig.1 Detection of FasL-mRNA with RT-PCR
M: Molecular size marker; Lane 1: FasL-cDNA plasmid; 2:Normal serum; 3-6: positive sera, banded at 467 bp as the same with the plasmid
, http://www.100md.com
图2 反转录聚合酶链反应检测Fas-mRNA
Fig.2 Detection of Fas-mRNA with RT-PCR
M: Molecular size marker; Lane 1: Fas-cDNA plasmid with 2 bands of 300 bp(membranous molecule) and 237 bp(soluble molecule); 2:Normal serum; 3-4:Positive sera
2.2 阴性对照 血清FasL-mRNA在20例正常人中检出3例。外周血淋巴细胞被任何原因激活都可表达FasL-mRNA, 可能解释这一结果。虽然生理情况下的组织也可能表达微量Fas-mRNA, 但未能用这一方法检出。
2.3 病人血清 sFasL是mFasL在细胞表面经蛋白酶水解形成, 只有一种mRNA, 合成的FasL或在细胞膜上、或溶解在血清中；而sFas-mRNA是缺失穿膜区段(63 bp)的拼接mRNA, 有mFas-mRNA和sFas-mRNA2种分子[2]。在血清中检出的是两者的可溶性分子。
, 百拇医药
27例慢性乙型肝炎病人血清检出sFasL13例(48.2%), 可来自肝细胞或淋巴细胞; 检出sFas21例(77.8%), 应主要来自肝细胞。其临床意义当结合肝组织 Western吸印杂交和原位检测结果才能阐明, 将另文报告。
因无检测血清中Fas/ FasL的试剂, 迄今国内的相关研究主要局限在原位免疫组化技术, 血清学检测方法的开展, 将为研究工作打开新的视野。
作者简介：何海棠，女，1969年出生，技师，电话87636914
参考文献
1 Luo KX, Zhu YF, He HT et al. In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis B infection and related liver diseases. J Viral Hepat, 1997,4:303
2 Knipping E, Debatin KM, Stricker K et al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B-and T-cell lines and increased serum levels in B-and T-cell leukemias. Blood, 1995, 85:1562
(收稿日期：1998-07-14), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515
关键词：Fas；FasL；mRNA；血清检测
摘要 摘要：目的 建立可用于研究工作的血清学检测方法。方法 按GenBank 的Fas和FasL序列设计引物, 以相应质粒作阳性材料, 建立各自的RT- PCR。结果 27例慢性乙型肝炎血清检出sFasL-mRNA13例(48.2%), sFas-mRNA21例(77.8%)。结论 目前尚无检测血清抗原的试剂, 相关研究工作中可应用这一技术。
中图分类号：R446.11
Development of reverse transcription polymerase chain reaction assays for serological detection of soluble FasL- and Fas-mRNA
, 百拇医药
He Haitang, Luo Kangxian, Wang Jinyu, Zhu Youfu, Lu Qiaosheng
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish serological methods for detecting these soluble molecules sFas and sFasL. Methods The primers were designed according to the published sequences of Fas and FasL. The well-defined Fas and FasL plasmids were used as positive materials. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assays were established for detecting the soluble FasL- and Fas-mRNA in serum. Results The sera of 27 patients with chronic hepatitis B were tested. Thirteen (48.2%) were sFasL-mRNA seropositive and 21 (77.8%) sFas-mRNA positive. The sFasL-mRNA might derive from liver cells or lymphocytes, and the sFas-mRNA mainly from hepatocytes of hepatitis patients. Conclusions The methodology described in this paper might be used in research work. Combined with the in situ investigations of their membranous molecules, the functions of Fas/FasL in induction of apoptosis may be studied more completely.
, 百拇医药
Key words: Fas; FasL; mRNA; serological assays
Fas及其配体FasL诱导细胞凋亡, 表达FasL的T细胞引起表达Fas的靶细胞凋亡。这两种细胞膜性分子(mFas和mFasL)又都有可溶性分子(sFas和sFasL)。sFas可阻断FasL的作用; sFasL又抑制sFas的作用。我们曾原位研究慢性乙型肝炎及其肝病的肝组织中Fas /FasL诱导的肝细胞凋亡[1]。因国内无检测方法报道, 未能同时研究其可溶性分子的表现, 难以全面评估这一系统在凋亡、进而在肝炎和肝病发病机制中的意义。经长时间探索建立了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术, 可用于血清学检测。
1 材料和方法
1.1 血清来源 慢性乙型肝炎27例, 均经肝活组织检查确定诊断。健康献血员20例对照。
, http://www.100md.com
1.2 FasL和Fas质粒 作阳性对照的FasL质粒由中山大学生化系徐安龙教授惠赠; Fas质粒为pL430由珠江医院陈俊博士提供。
1.3 血清RNA提取 血清200 μl 加变性缓冲液(异硫氰酸胍4 mol/L, 枸橼酸钠25 mmol/L,十二烷基肌氨酸钠0.5%, β巯基乙醇0.1 mol/L) 200 μl混匀; 加2 mol/L pH4.0 NaAc50 μl混匀; 加饱和酚 200μl、24:1氯仿-异戊醇 200 μl混匀 放置4 ℃15 min; 4 ℃离心12 000 r/min 10 min。取上清液加氯仿-异戊醇400μl混匀, 4 ℃离心12 000 r/min 5 min。取上清加无水乙醇2.5倍, -70 ℃放置1 h。4 ℃离心12 000 r/min 15 min, 弃乙醇, 再用70%乙醇洗沉淀物, 空气干燥, H2O 10 μl悬浮作模板备用。
1.4 RT-PCR
, 百拇医药
1.4.1引物FasL(+):5'-ATGTTTCAGCTCTTCCAC-CTACAGAAGGA;FasL(-):5'-TGACCAGAGAGAG-CTCAGATACGTTGAC。Fas(+): 5'-GGACCCA-GAATACCAAGTGC; Fas(-): 5'-GCCACTGTTT-CAGGATTTAAGG。
1.4.2 cDNA合成 H2O10 μl、模板5 μl、引物 [FasL(-)或Fas(-)]2 μl、5倍浓度反转录缓冲液5μl、10 mmol/L dNTP2 μl混匀, 93 ℃、5 min, 立即冰浴。加M-MLV100 U、RNA酶抑制剂40 U, 混匀, 37 ℃、90 min。
1.4.3 反应 cDNA产物93 ℃、5 min, 冰浴, 加H2O 30 μl, 引物(FasL或Fas一对), 10倍浓度反转录PCR缓冲液5μl, 2 mmol/L dNTP 5 μl, DNAp2.5 U混匀。95℃、50 s，55 ℃、50 s，71 ℃、70 s, 35次循环。
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1.5 电泳 2%琼脂糖溶于TBE缓冲液, 按常规电泳。
2 结果和讨论
2.1 阳性对照 用FasL质粒作模板, 以相应引物获得PCR电泳带为467 bp (图1), 用Fas质粒作模板, 有300 bp和237 bp的2条带 (图2), 前者可能是膜性分子、后者是可溶性分子, 都符合预期的分子大小。
图1 反转录聚合酶链反应检测FasL-mRNA
Fig.1 Detection of FasL-mRNA with RT-PCR
M: Molecular size marker; Lane 1: FasL-cDNA plasmid; 2:Normal serum; 3-6: positive sera, banded at 467 bp as the same with the plasmid
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图2 反转录聚合酶链反应检测Fas-mRNA
Fig.2 Detection of Fas-mRNA with RT-PCR
M: Molecular size marker; Lane 1: Fas-cDNA plasmid with 2 bands of 300 bp(membranous molecule) and 237 bp(soluble molecule); 2:Normal serum; 3-4:Positive sera
2.2 阴性对照 血清FasL-mRNA在20例正常人中检出3例。外周血淋巴细胞被任何原因激活都可表达FasL-mRNA, 可能解释这一结果。虽然生理情况下的组织也可能表达微量Fas-mRNA, 但未能用这一方法检出。
2.3 病人血清 sFasL是mFasL在细胞表面经蛋白酶水解形成, 只有一种mRNA, 合成的FasL或在细胞膜上、或溶解在血清中；而sFas-mRNA是缺失穿膜区段(63 bp)的拼接mRNA, 有mFas-mRNA和sFas-mRNA2种分子[2]。在血清中检出的是两者的可溶性分子。
, 百拇医药
27例慢性乙型肝炎病人血清检出sFasL13例(48.2%), 可来自肝细胞或淋巴细胞; 检出sFas21例(77.8%), 应主要来自肝细胞。其临床意义当结合肝组织 Western吸印杂交和原位检测结果才能阐明, 将另文报告。
因无检测血清中Fas/ FasL的试剂, 迄今国内的相关研究主要局限在原位免疫组化技术, 血清学检测方法的开展, 将为研究工作打开新的视野。
作者简介：何海棠，女，1969年出生，技师，电话87636914
参考文献
1 Luo KX, Zhu YF, He HT et al. In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis B infection and related liver diseases. J Viral Hepat, 1997,4:303
2 Knipping E, Debatin KM, Stricker K et al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B-and T-cell lines and increased serum levels in B-and T-cell leukemias. Blood, 1995, 85:1562
(收稿日期：1998-07-14), 百拇医药