胆囊结石患者胆汁需氧菌和厌氧菌DNA检测及意义
作者：方驰华 杨继震
单位：第一军医大学珠江医院普外科，广州，510282
关键词：胆结石；胆汁；细菌；脱氧核糖核酸；聚合酶链式反应
第一军医大学学报990125 摘要：目的 从分子生物学水平研究胆囊结石患者胆汁细菌脱氧核糖核酸(DNA)，探讨细菌在胆结石发病机理中的作用。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)对胆汁中5种需氧菌和4种厌氧菌DNA进行检测。结果 检测70例，存在需氧菌56例(80%)和厌氧菌DNA 23例(32.86%)。两类细菌DNA同时存在者为20例(28.57%)。首次从21例胆汁中检测出幽门螺杆菌DNA。结论 胆结石胆汁中存在多种细菌DNA，胆结石核心可能与细菌感染有关。
中图分类号：Q 657.4
Measurement and its significance of DNA of aerobic and anaerobic bacteria in bile in gallstone patients
, http://www.100md.com
Fang Chihua, Yang Jizhen
Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
Abstract: Objective To study DNA of bacteria in bile at molecular biology level and explore the role of bacteria in gallstone pathogenesis. Methods DNA of 5 kinds of aerobic and 4 kinds of anaerobic bacteria in bile was tested by polymerase chain reaction (PCR). Results DNA of the aerobic and anaerobic bacteria was detected in 56 (80%) and 23 patients (32.86%) in 70 patients tested respectively. DNA of the both kinds of the bacterium was detected in 20 patients (28.5%). DNA of Helicobacter pylori was detected in 21 patients at first. Conclusion There are multiple kinds of bacterial DNA in the bile and gallstone nuclear detected may be related to bacterial infection.
, 百拇医药
Key words: gallstones; bile; bacteria; deoxyribonucleic acid; polymerase chain reaction
为了探讨细菌在胆结石核心形成中的分子生物学证据，我们采用聚合酶链式反应(PCR)对胆囊结石胆汁细菌脱氧核糖核酸(DNA)进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料 70例患者，男26例，女44例，年龄18~71岁，平均(43.62±12.02)岁。经B超检测，诊断为单纯胆囊结石，同期施行腹腔镜胆囊切除术，近半年来无急性发作史患者。
1.2 方法
1.2.1 标本收集 完成腹腔镜胆囊切除，经脐孔取出胆囊，无菌注射器穿刺抽取胆汁3～5 ml置于无菌试管内，置-29 ℃保存，备测。
, 百拇医药
1.2.2 细菌引物 需氧菌包括大肠埃氏杆菌(BC)、伤寒杆菌(BT)、幽门螺杆菌(HP)、变形杆菌(BP)、克雷伯氏杆菌(KP)和厌氧菌包括脆弱类杆菌(BF)、消化球菌(PP)、梭形芽胞杆菌(CS)、产气荚膜杆菌(BPF)DNA引物(表1, 2)及阳性标本对照来自解放军基因研究所。
表1 5种需氧菌细菌引物
Tab.1 Five primers of aerobic bacteria Bacterium
Primer
Primer Sequence
bp
Escherichia coli
P1
, 百拇医药
5’ TCTCTATGTGCATACGGAG 3’
320
P2
5’ CCATACTGATTGCCGCAA 3’
Salmonella typhi
P3
5’ ACTGCTAAAACCACTACT 3’
458
P4
5’ TTAACGCAGTAAAGAGAG 3’
Helicobacter pylori
, 百拇医药
P5
5’ GCCAATGGTAAATTAGTT 3’
411
P6
5’ CTCCTTAATTGTTTTTAC 3’
Proteus Vulgaris
P7
5’ CTGGTAGGTATGGTGAGG 3’
320
P8
5’ CCAGGCCAACAATTATTTCC 3’
, 百拇医药
Klebsiella pneumoniae
P9
5’ GCTGATCTTGACTATGTGGTG 3’
288
P10
5’ GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG 3’
表2 4种厌氧菌细菌引物
Tab. 2 Four primers of anaerobic bacteria Bacterium
Primer
Primer Sequence
, http://www.100md.com
bp
Bacteroides fragilis
P1
5’ GAAGCTTATGGTACAGGTTGG 3’
240
P2
5’ ATTACCATCCTCCTTGTTGTAAGG 3’
Peptococcus
P3
5’ TTAGCAGGTAATGGCTAGAG 3’
210
, 百拇医药
P4
5’ CTCGGTTAACCTCAATTATG 3’
Clostridium
P5
5’ AAACTCAAATGAATTGACGG 3’
540
P6
5’ GACGGGCGGTGTGTACAA 3’
Bacillus. perfringens
P7
5’ GCTCTTGCAACTTCTATGTT 3’
, http://www.100md.com
230
P8
5’ CATTGTCGTCAGGTTGGCG 3’
1.2.2 处理液和反应液 1)处理液：蛋白酶K 60 mg/L, 0.45% Tween-20, 0.45% Triton X-100, PCR缓冲液，5 000 r/min离心，取上清为PCR模板。(2)反应液：5×反应缓冲液 5 μl，混合10×dNTP 2.5μl ，引物5.0 μl，无菌双蒸水6.5 μl，加入备用模板5.0 μl，无菌石蜡油30 μl，Taq-DNA聚合酶。
1.2.3 PCR-DNA扩增 采用解放军基因研究所的DTC-3C型扩增仪。取胆汁60 μl，处理液40 μl 混合后煮沸20 min，离心14 000 r/min 5 min，取上清液5 μl 加入引物中，放入扩增仪进行循环，共38次。取扩增好引物13 μl，点样，琼脂糖、TAE电泳，并与阳标对照。
, 百拇医药
2 结果
检测胆汁70例，需氧菌DNA存在56例，厌氧菌存在23例。各类细菌DNA存在情况见表3。
表3 需氧菌、厌氧菌DNA存在情况(例)
Tab.3 DNA of aerobic and anaerobic bacteria
(No. of case) Bacterium
Single
Double
Multiple
Total
Aerobic
, http://www.100md.com
29
19
8
56
Anaerobic
16
5
2
23
在需氧菌中，单菌DNA 29例，其中HP 2例、KP 12例、BT 5例、BC 6例、BP 4 例。双菌DNA 19 例，其中BC+KP 5 例、HP+KP 3例、BC+KP 4 例、HP+BT 4 例、BC+BP 2 例、BT+BP 1 例。多菌DNA 8 例，其中HP+BC+BP 3 例、BC+KP+BP 1例、HP+BT+KP 2例、HP+BT+BC+BP 1 例、BC+HP+BT+KP 1 例。
, 百拇医药
在厌氧菌中，单菌DNA 16 例，其中BF 5 例、PP 4 例、CS 4 例、BPF 3 例。双菌DNA 5例，其中PP+CS 3例、CS+BPF 1例、BF+BPF 1 例。BF+CS+BPF 2 例。
此外，需氧菌DNA和厌氧菌DNA共存20例。
3 讨论
PCR是特异性DNA序列体外引物定向酶促扩
增法，具有灵敏度高，特异性强。采用该技术使细菌的检测率大大提高[1]。本研究中，需氧菌DNA存在56例，占80%，厌氧菌23例，占32.86%；需氧菌和厌氧菌中存在双菌以上DNA分别为27例(48.21%)和7例(30.43%)；需氧菌DNA和厌氧菌DNA 同时存在20例，占28.57%。在有的患者胆汁中，同时共存5~6种细菌DNA。本组检测细菌DNA仅9种，可以推测，随着检测细菌DNA增多，细菌DNA检测率更高，由此可见，PCR对胆道感染细菌检测有重要意义。
, 百拇医药
胆道细菌感染和细菌在胆囊结石核心形成中的作用一直是人们关注的问题，目前尚无确切定论。近年来采用分子生物学手段从胆囊结石中检测出细菌DNA[2]后，细菌在胆固醇结石形成中的作用，现在被得到重新认识[3]。目前认为，β-葡萄糖醛酸酶活性不仅存在大肠埃氏杆菌、克雷伯氏杆菌，而且存在脆弱类杆菌、梭形芽孢杆菌。这些细菌同时产生磷脂酶A，前者将结合胆红素分解为非结合胆红素，后者将卵磷脂降解为软脂酸产生沉积，同时也降低胆固醇的溶解度和促核形成。
此外，本研究首次从胆汁中检测HP DNA 21例，占30%，而在门静脉血中未检测出该菌DNA，证明HP来自十二指肠乳头逆流。至于该菌对胆囊粘膜损害机理、病理改变、成石作用有待进一步研究。
作者简介：方驰华，男，1958年出生，1994年同济医科大学肝胆外科研究生毕业，硕士，副主任医师，参加编著1部，发表论文238篇，电话85143116
, 百拇医药
参考文献
1 Swidsinski A, Ludwing N, Pahlig H et al. Molecular genetic evidence of bacterial colonization of cholesterol gallstones. Gastroenterology, 1995, 108(3):860
2 方驰华，杨继震. 胆囊结石需氧菌和厌氧菌分子生物学研究及意义. 第四军医大学学报，1998, 19(6):681
3 Soloway RD, Crowther RS. Bacteria and cholesterol gallstones: Molecular biology comes to gallstone pathogenesis. Gastroenterology, 1995, 108(3):934
(收稿日期：1998-08-13), 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院普外科，广州，510282
关键词：胆结石；胆汁；细菌；脱氧核糖核酸；聚合酶链式反应
第一军医大学学报990125 摘要：目的 从分子生物学水平研究胆囊结石患者胆汁细菌脱氧核糖核酸(DNA)，探讨细菌在胆结石发病机理中的作用。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)对胆汁中5种需氧菌和4种厌氧菌DNA进行检测。结果 检测70例，存在需氧菌56例(80%)和厌氧菌DNA 23例(32.86%)。两类细菌DNA同时存在者为20例(28.57%)。首次从21例胆汁中检测出幽门螺杆菌DNA。结论 胆结石胆汁中存在多种细菌DNA，胆结石核心可能与细菌感染有关。
中图分类号：Q 657.4
Measurement and its significance of DNA of aerobic and anaerobic bacteria in bile in gallstone patients
, http://www.100md.com
Fang Chihua, Yang Jizhen
Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
Abstract: Objective To study DNA of bacteria in bile at molecular biology level and explore the role of bacteria in gallstone pathogenesis. Methods DNA of 5 kinds of aerobic and 4 kinds of anaerobic bacteria in bile was tested by polymerase chain reaction (PCR). Results DNA of the aerobic and anaerobic bacteria was detected in 56 (80%) and 23 patients (32.86%) in 70 patients tested respectively. DNA of the both kinds of the bacterium was detected in 20 patients (28.5%). DNA of Helicobacter pylori was detected in 21 patients at first. Conclusion There are multiple kinds of bacterial DNA in the bile and gallstone nuclear detected may be related to bacterial infection.
, 百拇医药
Key words: gallstones; bile; bacteria; deoxyribonucleic acid; polymerase chain reaction
为了探讨细菌在胆结石核心形成中的分子生物学证据，我们采用聚合酶链式反应(PCR)对胆囊结石胆汁细菌脱氧核糖核酸(DNA)进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料 70例患者，男26例，女44例，年龄18~71岁，平均(43.62±12.02)岁。经B超检测，诊断为单纯胆囊结石，同期施行腹腔镜胆囊切除术，近半年来无急性发作史患者。
1.2 方法
1.2.1 标本收集 完成腹腔镜胆囊切除，经脐孔取出胆囊，无菌注射器穿刺抽取胆汁3～5 ml置于无菌试管内，置-29 ℃保存，备测。
, 百拇医药
1.2.2 细菌引物 需氧菌包括大肠埃氏杆菌(BC)、伤寒杆菌(BT)、幽门螺杆菌(HP)、变形杆菌(BP)、克雷伯氏杆菌(KP)和厌氧菌包括脆弱类杆菌(BF)、消化球菌(PP)、梭形芽胞杆菌(CS)、产气荚膜杆菌(BPF)DNA引物(表1, 2)及阳性标本对照来自解放军基因研究所。
表1 5种需氧菌细菌引物
Tab.1 Five primers of aerobic bacteria Bacterium
Primer
Primer Sequence
bp
Escherichia coli
P1
, 百拇医药
5’ TCTCTATGTGCATACGGAG 3’
320
P2
5’ CCATACTGATTGCCGCAA 3’
Salmonella typhi
P3
5’ ACTGCTAAAACCACTACT 3’
458
P4
5’ TTAACGCAGTAAAGAGAG 3’
Helicobacter pylori
, 百拇医药
P5
5’ GCCAATGGTAAATTAGTT 3’
411
P6
5’ CTCCTTAATTGTTTTTAC 3’
Proteus Vulgaris
P7
5’ CTGGTAGGTATGGTGAGG 3’
320
P8
5’ CCAGGCCAACAATTATTTCC 3’
, 百拇医药
Klebsiella pneumoniae
P9
5’ GCTGATCTTGACTATGTGGTG 3’
288
P10
5’ GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG 3’
表2 4种厌氧菌细菌引物
Tab. 2 Four primers of anaerobic bacteria Bacterium
Primer
Primer Sequence
, http://www.100md.com
bp
Bacteroides fragilis
P1
5’ GAAGCTTATGGTACAGGTTGG 3’
240
P2
5’ ATTACCATCCTCCTTGTTGTAAGG 3’
Peptococcus
P3
5’ TTAGCAGGTAATGGCTAGAG 3’
210
, 百拇医药
P4
5’ CTCGGTTAACCTCAATTATG 3’
Clostridium
P5
5’ AAACTCAAATGAATTGACGG 3’
540
P6
5’ GACGGGCGGTGTGTACAA 3’
Bacillus. perfringens
P7
5’ GCTCTTGCAACTTCTATGTT 3’
, http://www.100md.com
230
P8
5’ CATTGTCGTCAGGTTGGCG 3’
1.2.2 处理液和反应液 1)处理液：蛋白酶K 60 mg/L, 0.45% Tween-20, 0.45% Triton X-100, PCR缓冲液，5 000 r/min离心，取上清为PCR模板。(2)反应液：5×反应缓冲液 5 μl，混合10×dNTP 2.5μl ，引物5.0 μl，无菌双蒸水6.5 μl，加入备用模板5.0 μl，无菌石蜡油30 μl，Taq-DNA聚合酶。
1.2.3 PCR-DNA扩增 采用解放军基因研究所的DTC-3C型扩增仪。取胆汁60 μl，处理液40 μl 混合后煮沸20 min，离心14 000 r/min 5 min，取上清液5 μl 加入引物中，放入扩增仪进行循环，共38次。取扩增好引物13 μl，点样，琼脂糖、TAE电泳，并与阳标对照。
, 百拇医药
2 结果
检测胆汁70例，需氧菌DNA存在56例，厌氧菌存在23例。各类细菌DNA存在情况见表3。
表3 需氧菌、厌氧菌DNA存在情况(例)
Tab.3 DNA of aerobic and anaerobic bacteria
(No. of case) Bacterium
Single
Double
Multiple
Total
Aerobic
, http://www.100md.com
29
19
8
56
Anaerobic
16
5
2
23
在需氧菌中，单菌DNA 29例，其中HP 2例、KP 12例、BT 5例、BC 6例、BP 4 例。双菌DNA 19 例，其中BC+KP 5 例、HP+KP 3例、BC+KP 4 例、HP+BT 4 例、BC+BP 2 例、BT+BP 1 例。多菌DNA 8 例，其中HP+BC+BP 3 例、BC+KP+BP 1例、HP+BT+KP 2例、HP+BT+BC+BP 1 例、BC+HP+BT+KP 1 例。
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在厌氧菌中，单菌DNA 16 例，其中BF 5 例、PP 4 例、CS 4 例、BPF 3 例。双菌DNA 5例，其中PP+CS 3例、CS+BPF 1例、BF+BPF 1 例。BF+CS+BPF 2 例。
此外，需氧菌DNA和厌氧菌DNA共存20例。
3 讨论
PCR是特异性DNA序列体外引物定向酶促扩
增法，具有灵敏度高，特异性强。采用该技术使细菌的检测率大大提高[1]。本研究中，需氧菌DNA存在56例，占80%，厌氧菌23例，占32.86%；需氧菌和厌氧菌中存在双菌以上DNA分别为27例(48.21%)和7例(30.43%)；需氧菌DNA和厌氧菌DNA 同时存在20例，占28.57%。在有的患者胆汁中，同时共存5~6种细菌DNA。本组检测细菌DNA仅9种，可以推测，随着检测细菌DNA增多，细菌DNA检测率更高，由此可见，PCR对胆道感染细菌检测有重要意义。
, 百拇医药
胆道细菌感染和细菌在胆囊结石核心形成中的作用一直是人们关注的问题，目前尚无确切定论。近年来采用分子生物学手段从胆囊结石中检测出细菌DNA[2]后，细菌在胆固醇结石形成中的作用，现在被得到重新认识[3]。目前认为，β-葡萄糖醛酸酶活性不仅存在大肠埃氏杆菌、克雷伯氏杆菌，而且存在脆弱类杆菌、梭形芽孢杆菌。这些细菌同时产生磷脂酶A，前者将结合胆红素分解为非结合胆红素，后者将卵磷脂降解为软脂酸产生沉积，同时也降低胆固醇的溶解度和促核形成。
此外，本研究首次从胆汁中检测HP DNA 21例，占30%，而在门静脉血中未检测出该菌DNA，证明HP来自十二指肠乳头逆流。至于该菌对胆囊粘膜损害机理、病理改变、成石作用有待进一步研究。
作者简介：方驰华，男，1958年出生，1994年同济医科大学肝胆外科研究生毕业，硕士，副主任医师，参加编著1部，发表论文238篇，电话85143116
, 百拇医药
参考文献
1 Swidsinski A, Ludwing N, Pahlig H et al. Molecular genetic evidence of bacterial colonization of cholesterol gallstones. Gastroenterology, 1995, 108(3):860
2 方驰华，杨继震. 胆囊结石需氧菌和厌氧菌分子生物学研究及意义. 第四军医大学学报，1998, 19(6):681
3 Soloway RD, Crowther RS. Bacteria and cholesterol gallstones: Molecular biology comes to gallstone pathogenesis. Gastroenterology, 1995, 108(3):934
(收稿日期：1998-08-13), 百拇医药