内毒素腹腔内注射诱发小鼠肠套叠的实验研究
作者：林 中 M.Hanani P.Cohen
单位：林中 桂林医学院附属医院消化内科 广西桂林市 541001；M.Hanani P.Cohen 以色列希伯来大学医学院Hadassah医院
关键词：肠套叠；内毒素；一氧化氮；小鼠
华夏医学990103 摘要 报告了一种新型的内毒素肠套叠动物模型，并对其发病机理进行了初步探索。结果发现：给小鼠腹腔内注射内毒素，肠套叠诱发率为23.8%，内毒素最佳剂量是12mg/kg，肠套叠形成高峰时间在6～12h。内毒素使肠传递时间延长，一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME降低肠套叠诱发率。实验结果提示：内毒素可诱发肠套叠，其发病机理与肠动力紊乱有关。该动物模型可为研究肠套叠的病因，发病机理及治疗提供帮助。
中图分类号 R332;R602
, http://www.100md.com
Intraperitoneal Injection of Lipopolysaccharide Induces Intussusception in Mice
Lin Zhong,Menachem Hanani,Patrizia Cohen
Department of Internal Medicine, Affiliated Hospital,Guilin Medical College,Guilin 541001
Abstract Background:Intussusception is a common cause of intestinal obstruction in children.Its etiology is unclear,and research in this area has been hindered by the lack of a reproducible animal model.Methods:Lipopolysaccharide (LPS) was injected intraperitoneally in adult mice.At time points from two hours to eight days after the administration of LPS the animals were inspected for the presence of intussusception.Gastrointestinal transit was assessed by measuring the passage of charcoal in the small intestine.Transit index was defined as the ratio between the distance traveled by charcoal and the total length of the small intestine.Results:Intussusceptions were found in up to 23.8% of the LPS-injected animals.The threshold for the LPS effect was at 4mg/kg,and incidence reached a plateau at 12mg/kg.The intrssusception incidence peaked at 6h after LPS injection and declined to zero after 15h.LPS (12mg/kg) reduced the transit index from (56.2±1.4)% to (37.7±2.1)%.The nitric oxide synthese inhibitor L-NAME (20mg/kg) reduced the intussusception incidence from 23.8% to 3.8%.No pathological change was found in the intussuscepted bowels.Conclusions:LPS caused a high incidence of intussusception in mice,apparently by disturbing gastrointestinal motility.One putative mediator involved is NO.This model could be useful for studying the etiology and possible treatment of intussusception.
, 百拇医药
Key words intussusception;lipopolysaccharide;mice;motility
肠套叠是小儿肠梗阻常见原因之一。90%小儿肠梗阻病因不明。由于缺乏理想的肠套叠动物模型，肠套叠病因及发病机理的研究受到阻碍。经外科手术形成的肠套叠模型不但对实验动物创伤大，引起生理功能紊乱，也不能研究其发病机理。
在本实验中，我们给予小鼠内毒素(LPS)腹腔内注射，获得较高的肠套叠率，为肠套叠发病机理的研究提供了一种实用动物模型。本实验对肠套叠的发病机理进行了初步的探索。
1 材料与方法
1.1 动物 成年Balb/c小鼠，不分雌雄，体重22～30g。喂以市售的啮齿动物饲料，饮水为自来水，光照12h/d，室温20～22℃。
1.2 LPS给药 小鼠随机分组，雌雄搭配，每组20～30只。腹腔内一次性注射1ml LPS溶液(E.Coli,美国Sigma公司)。LPS溶于蒸馏水，浓度2～30mg/kg不等(见图1)。注射后在不同的时间(2h至8d)以颈椎脱位方式处死小鼠，剖腹检查。
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图1 不同剂量的LPS(mg/kg)肠套叠诱发率
对照组23只小鼠腹腔内注射1ml蒸馏水，9h后处死剖腹观察。
1.3 胃肠传递时间测定 3组小鼠用于胃肠传递时间测定，以传递指数(TI)表示。腹腔内注射内毒素(12mg/kg)后，测定第6小时，9小时及15小时的TI。在处死小鼠前15min，胃内灌注0.3ml 10%活性碳阿拉伯胶溶液，碳未被推进的长度(从幽门计起)与小肠全长之比，乘以100%即为TI。
1.4 一氧化氮合成酶(NOS)抑制试验 20只小鼠皮下注射NOS抑制剂L-NAME 20mg/kg(美国Sigma公司)，同时给予LPS 12mg/kg腹腔内注射，6h后剖腹观察。
1.5 病理分析 12只患肠套叠的小鼠和4只对照送病理检查，套叠肠段做系列切片，HE染色观察。
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2 结果
2.1 肠套叠诱发率与剂量、时间的关系 实验组261只小鼠接受不同浓度的LPS腹腔内注射。LPS诱发肠套叠的阈值约为4mg/kg，最适剂量是8～16mg/kg；最佳时间是6～12h，当剂量与时间选择恰当时，肠套叠诱发率可达23.8%(见图2)。LPS注射15h后，未见肠套叠。对照组23只小鼠无1例形成肠套叠。
图2 LPS(12mg/kg)注射后不同时间肠套叠形成率
2.2 肠套叠的类型和部位 在整个实验中，43只小鼠发生51个肠套叠，其中7只有多发性(2～3个)。类型以回回型为主，占68.6%，未见回盲型。肠套叠主要发生在中段及远段小肠。结结型11个，占21.6%。肠套叠长度2～24mm,平均4.2mm。
, http://www.100md.com 2.3 年龄差异 最适合用于诱发肠套叠实验的小鼠是大于60日龄，体重25g左右的小鼠。10日龄的幼鼠肠套叠诱发率为6.7%(1/15只)；60周龄的小鼠肠套叠诱发率也很低(1/8只)。
2.4 LPS对胃肠传递时间的效应 TI于胃内灌注活性碳后15min测定，正常对照TI为(56.2±1.4)%。在注射LPS后6h和9h，TI分别为(42.7±4.3)%和(37.7±2.1)%(P<0.05)。第15小时TI恢复到正常水平为(57.5±5.0)%(见图3)。
图3 LPS对胃肠传递时间的效应
2.5 NOS的抑制效应 26只小鼠同时注射LPS和L-NAME,仅1只(3.8%)形成一个肠套叠。26只小鼠无一死亡。
2.6 病理发现 12个肠套叠肠段和4只对照鼠小肠送病理检查，沿长轴正中剖面可清晰见到肠套叠的3个筒6个层面。系列切片检查在肠套叠部分无Peyer淋巴小结增生、粘膜损害、静脉瘀血等病理改变。
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3 讨论
目前，肠套叠动物模型多经外科手术形成，实验动物肠套叠仅有少量报道。1977年Schoenbaum等[1]报道在77只不明原因急性死亡的豚鼠中，49只患有肠套叠，疑是与草料中黄曲霉毒素和有机磷农药有关。Blaskett[2]观察到小鼠接种百日咳疫苗后有7.3%发生肠套叠。但后来的研究未能重复这一结果[3]。本实验用LPS可诱发23.8%的小鼠发生肠套叠，重复性强，为该病的研究提供了一种新的动物模型。
病毒感染与肠套叠发生有一定的关系，与革兰阴性菌感染的关系也有报道[4，5]。如同病毒感染诱发肠套叠一样，革兰阴性菌感染后可导致Peyer淋巴小结肿大、局灶性粘膜损伤充血水肿，均成为肠套叠的起动点(leading point)。但在本实验中，肠套叠段没有发现任何淋巴增生、粘膜损害，提示在本研究的模型中，肠套叠的发生可能是另一种机理，以下观察支持这种设想：
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①在LPS注射第6小时和9小时，胃肠传递时间显著减慢，15h后恢复到正常水平。同时我们观察到，LPS注射后肠套叠的形成在6h进入高峰，而15h后则骤降至零，提示肠动力紊乱和肠套叠的发生有一定关系。
②同时给予NOS抑制剂L-NAME时，LPS的肠套叠诱发率仅为3.8%。有报道肠道及肝脏可诱导的NOS活性在LPS注射后6h达高峰[6]。由此可见，给小鼠注射LPS后，NOS活性的增强、肠套叠的发生、胃肠传递时间的改变三者在时间上是一致的，提示一氧化氮(NO)在肠套叠的发生中起一定的作用。NO可抑制肠蠕动[7]，LPS的一些毒性作用是通过NO介导的。
临床上也观察到肠套叠与肠动力改变关系密切。对一患者肠套叠邻近肠段电生理测试发现，其移行性复合波(MMC)Ⅱ相消失[8]。狗实验中，一个剂量的LPS使MMCⅡ相消失2d[9]。在实验性腹膜炎动物模型，腹腔内注射细菌E.Coli后监测肠道的肌电活动显示MMCⅡ相完全受到抑制，已知E.Coli是通过释放内毒素，再由NO、PAF(血小板激活因子)等介质介导而引起病理损害[10]。
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总之，多方面的依据明确提示异常的肠动力在肠套叠形成中起关键的作用。
本实验中，肠套叠的高峰发生于LPS腹腔内注射后6～12h，15h后降至零，提示套叠的肠段能自行完全地复位。这可以解释为15h后LPS对肠动力的抑制作用减弱，LPS注射15h，胃肠传递时间恢复正常可以说明这一点。LPS注射后15～20h，NO合成也恢复到正常水平是另一个佐证[6]。临床上也观察到有5%～6%的肠套叠可自行完全恢复[11，12]，或许还会更高[12]。
笔者认为，LPS一次性腹腔内注射可诱导小鼠肠套叠，其诱发率可达23.8%。本实验观察到套叠肠段缺乏病理改变，LPS注射后胃肠传递时间延长，L-NAME降低肠套叠发生率，据此我们认为LPS的肠套叠诱导作用是通过引起肠动力紊乱实现的。我们期望该动物模型将对研究肠套叠的病因及治疗起到作用。
作者简介：林中(1955～)，男，1985年毕业于湖南医科大学，硕士研究生，曾留学以色列希伯来大学医学院。在国内外学术刊物上发表论文20余篇，擅长诊断性及治疗性ERCP。现任桂林医学院附属医院消化内科主任，副教授。
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参考文献
[1] Schoenbaum M,Klopfer U,Egyed NM.Spontaneous intussusception of the small intestine in guinea-pig.Lab Anim, 1972,6:327～330
[2] Blaskett AC,Walden NB,Kleinberg IO,et al.Thiomersal preservative,pertussis vaccine and intussusception of the bowel in mice.J Biol Stand, 1978,6:267～270
[3] Reijnen JAM,Festen C,Vander Gulden WJI.Intraperitoneal injection of Bordetella pertussis vaccine and thiomersal failed to produce intussusception in mice.Z Versuchstierkd, 1988,31:245～247
, 百拇医药
[4] Matsushita M,Suzaki T,Hajiro K.Intussusception associated with Salmonella typhimurium enterocolitis.Am J Gastroenterol,1994,89:1246～1248
[5] Lopez EL,Devoto S,Woloj M,et al.Intussusception associated with Escherichia coli 0157:H7.Pediatr Infect Dis J, 1989,8:471～473
[6] Salter M,Knowles RG,Moncada S.Widespread distribution,species distribution and changes in activity of Ca2+-dependent and Ca2+-independent nitric oxide synthases.FEBS Lett, 1991,291:145～149
, 百拇医药
[7] Calignano A,Whittle BJR,Di Roas M,MOncada S.Involvement of endogenous nitric oxide in the regulation of rat intestinal motility in vivo.Europ J Pharmacol, 1992,229:273～282
[8] Hocking Mp,McCoy DM,Vogel SB,et al.Antiperistaltic and isoperistaltic intussusception associated with abnormal motility after Roux-en-ygastric bypass:A case report,Surgery,1991,110:109～112
[9] Cullen JJ,Caropreso DK,Ephgrave KS.Effect of endotoxin on canine gastrointestinal motility and transit.J Surg Res, 1995,58:90～95
, 百拇医药
[10] Hau T.Bacteria,toxins,and the peritoneum.World J Surg, 1990,14:167～175
[11] Goldman L,Elman R.Spontaneous reduction of acute intussusception in children.Am J Surg, 1940,49:259～263
[12] Swischuk LE,John SD,Swischuk PN.Spontaneous reduction of intussusception:Verification with US. Radiology, 1994,192:269～271
(收稿 1998-10-10), 百拇医药
单位：林中 桂林医学院附属医院消化内科 广西桂林市 541001；M.Hanani P.Cohen 以色列希伯来大学医学院Hadassah医院
关键词：肠套叠；内毒素；一氧化氮；小鼠
华夏医学990103 摘要 报告了一种新型的内毒素肠套叠动物模型，并对其发病机理进行了初步探索。结果发现：给小鼠腹腔内注射内毒素，肠套叠诱发率为23.8%，内毒素最佳剂量是12mg/kg，肠套叠形成高峰时间在6～12h。内毒素使肠传递时间延长，一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME降低肠套叠诱发率。实验结果提示：内毒素可诱发肠套叠，其发病机理与肠动力紊乱有关。该动物模型可为研究肠套叠的病因，发病机理及治疗提供帮助。
中图分类号 R332;R602
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Intraperitoneal Injection of Lipopolysaccharide Induces Intussusception in Mice
Lin Zhong,Menachem Hanani,Patrizia Cohen
Department of Internal Medicine, Affiliated Hospital,Guilin Medical College,Guilin 541001
Abstract Background:Intussusception is a common cause of intestinal obstruction in children.Its etiology is unclear,and research in this area has been hindered by the lack of a reproducible animal model.Methods:Lipopolysaccharide (LPS) was injected intraperitoneally in adult mice.At time points from two hours to eight days after the administration of LPS the animals were inspected for the presence of intussusception.Gastrointestinal transit was assessed by measuring the passage of charcoal in the small intestine.Transit index was defined as the ratio between the distance traveled by charcoal and the total length of the small intestine.Results:Intussusceptions were found in up to 23.8% of the LPS-injected animals.The threshold for the LPS effect was at 4mg/kg,and incidence reached a plateau at 12mg/kg.The intrssusception incidence peaked at 6h after LPS injection and declined to zero after 15h.LPS (12mg/kg) reduced the transit index from (56.2±1.4)% to (37.7±2.1)%.The nitric oxide synthese inhibitor L-NAME (20mg/kg) reduced the intussusception incidence from 23.8% to 3.8%.No pathological change was found in the intussuscepted bowels.Conclusions:LPS caused a high incidence of intussusception in mice,apparently by disturbing gastrointestinal motility.One putative mediator involved is NO.This model could be useful for studying the etiology and possible treatment of intussusception.
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Key words intussusception;lipopolysaccharide;mice;motility
肠套叠是小儿肠梗阻常见原因之一。90%小儿肠梗阻病因不明。由于缺乏理想的肠套叠动物模型，肠套叠病因及发病机理的研究受到阻碍。经外科手术形成的肠套叠模型不但对实验动物创伤大，引起生理功能紊乱，也不能研究其发病机理。
在本实验中，我们给予小鼠内毒素(LPS)腹腔内注射，获得较高的肠套叠率，为肠套叠发病机理的研究提供了一种实用动物模型。本实验对肠套叠的发病机理进行了初步的探索。
1 材料与方法
1.1 动物 成年Balb/c小鼠，不分雌雄，体重22～30g。喂以市售的啮齿动物饲料，饮水为自来水，光照12h/d，室温20～22℃。
1.2 LPS给药 小鼠随机分组，雌雄搭配，每组20～30只。腹腔内一次性注射1ml LPS溶液(E.Coli,美国Sigma公司)。LPS溶于蒸馏水，浓度2～30mg/kg不等(见图1)。注射后在不同的时间(2h至8d)以颈椎脱位方式处死小鼠，剖腹检查。
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图1 不同剂量的LPS(mg/kg)肠套叠诱发率
对照组23只小鼠腹腔内注射1ml蒸馏水，9h后处死剖腹观察。
1.3 胃肠传递时间测定 3组小鼠用于胃肠传递时间测定，以传递指数(TI)表示。腹腔内注射内毒素(12mg/kg)后，测定第6小时，9小时及15小时的TI。在处死小鼠前15min，胃内灌注0.3ml 10%活性碳阿拉伯胶溶液，碳未被推进的长度(从幽门计起)与小肠全长之比，乘以100%即为TI。
1.4 一氧化氮合成酶(NOS)抑制试验 20只小鼠皮下注射NOS抑制剂L-NAME 20mg/kg(美国Sigma公司)，同时给予LPS 12mg/kg腹腔内注射，6h后剖腹观察。
1.5 病理分析 12只患肠套叠的小鼠和4只对照送病理检查，套叠肠段做系列切片，HE染色观察。
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2 结果
2.1 肠套叠诱发率与剂量、时间的关系 实验组261只小鼠接受不同浓度的LPS腹腔内注射。LPS诱发肠套叠的阈值约为4mg/kg，最适剂量是8～16mg/kg；最佳时间是6～12h，当剂量与时间选择恰当时，肠套叠诱发率可达23.8%(见图2)。LPS注射15h后，未见肠套叠。对照组23只小鼠无1例形成肠套叠。
图2 LPS(12mg/kg)注射后不同时间肠套叠形成率
2.2 肠套叠的类型和部位 在整个实验中，43只小鼠发生51个肠套叠，其中7只有多发性(2～3个)。类型以回回型为主，占68.6%，未见回盲型。肠套叠主要发生在中段及远段小肠。结结型11个，占21.6%。肠套叠长度2～24mm,平均4.2mm。
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2.4 LPS对胃肠传递时间的效应 TI于胃内灌注活性碳后15min测定，正常对照TI为(56.2±1.4)%。在注射LPS后6h和9h，TI分别为(42.7±4.3)%和(37.7±2.1)%(P<0.05)。第15小时TI恢复到正常水平为(57.5±5.0)%(见图3)。
图3 LPS对胃肠传递时间的效应
2.5 NOS的抑制效应 26只小鼠同时注射LPS和L-NAME,仅1只(3.8%)形成一个肠套叠。26只小鼠无一死亡。
2.6 病理发现 12个肠套叠肠段和4只对照鼠小肠送病理检查，沿长轴正中剖面可清晰见到肠套叠的3个筒6个层面。系列切片检查在肠套叠部分无Peyer淋巴小结增生、粘膜损害、静脉瘀血等病理改变。
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3 讨论
目前，肠套叠动物模型多经外科手术形成，实验动物肠套叠仅有少量报道。1977年Schoenbaum等[1]报道在77只不明原因急性死亡的豚鼠中，49只患有肠套叠，疑是与草料中黄曲霉毒素和有机磷农药有关。Blaskett[2]观察到小鼠接种百日咳疫苗后有7.3%发生肠套叠。但后来的研究未能重复这一结果[3]。本实验用LPS可诱发23.8%的小鼠发生肠套叠，重复性强，为该病的研究提供了一种新的动物模型。
病毒感染与肠套叠发生有一定的关系，与革兰阴性菌感染的关系也有报道[4，5]。如同病毒感染诱发肠套叠一样，革兰阴性菌感染后可导致Peyer淋巴小结肿大、局灶性粘膜损伤充血水肿，均成为肠套叠的起动点(leading point)。但在本实验中，肠套叠段没有发现任何淋巴增生、粘膜损害，提示在本研究的模型中，肠套叠的发生可能是另一种机理，以下观察支持这种设想：
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①在LPS注射第6小时和9小时，胃肠传递时间显著减慢，15h后恢复到正常水平。同时我们观察到，LPS注射后肠套叠的形成在6h进入高峰，而15h后则骤降至零，提示肠动力紊乱和肠套叠的发生有一定关系。
②同时给予NOS抑制剂L-NAME时，LPS的肠套叠诱发率仅为3.8%。有报道肠道及肝脏可诱导的NOS活性在LPS注射后6h达高峰[6]。由此可见，给小鼠注射LPS后，NOS活性的增强、肠套叠的发生、胃肠传递时间的改变三者在时间上是一致的，提示一氧化氮(NO)在肠套叠的发生中起一定的作用。NO可抑制肠蠕动[7]，LPS的一些毒性作用是通过NO介导的。
临床上也观察到肠套叠与肠动力改变关系密切。对一患者肠套叠邻近肠段电生理测试发现，其移行性复合波(MMC)Ⅱ相消失[8]。狗实验中，一个剂量的LPS使MMCⅡ相消失2d[9]。在实验性腹膜炎动物模型，腹腔内注射细菌E.Coli后监测肠道的肌电活动显示MMCⅡ相完全受到抑制，已知E.Coli是通过释放内毒素，再由NO、PAF(血小板激活因子)等介质介导而引起病理损害[10]。
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总之，多方面的依据明确提示异常的肠动力在肠套叠形成中起关键的作用。
本实验中，肠套叠的高峰发生于LPS腹腔内注射后6～12h，15h后降至零，提示套叠的肠段能自行完全地复位。这可以解释为15h后LPS对肠动力的抑制作用减弱，LPS注射15h，胃肠传递时间恢复正常可以说明这一点。LPS注射后15～20h，NO合成也恢复到正常水平是另一个佐证[6]。临床上也观察到有5%～6%的肠套叠可自行完全恢复[11，12]，或许还会更高[12]。
笔者认为，LPS一次性腹腔内注射可诱导小鼠肠套叠，其诱发率可达23.8%。本实验观察到套叠肠段缺乏病理改变，LPS注射后胃肠传递时间延长，L-NAME降低肠套叠发生率，据此我们认为LPS的肠套叠诱导作用是通过引起肠动力紊乱实现的。我们期望该动物模型将对研究肠套叠的病因及治疗起到作用。
作者简介：林中(1955～)，男，1985年毕业于湖南医科大学，硕士研究生，曾留学以色列希伯来大学医学院。在国内外学术刊物上发表论文20余篇，擅长诊断性及治疗性ERCP。现任桂林医学院附属医院消化内科主任，副教授。
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参考文献
[1] Schoenbaum M,Klopfer U,Egyed NM.Spontaneous intussusception of the small intestine in guinea-pig.Lab Anim, 1972,6:327～330
[2] Blaskett AC,Walden NB,Kleinberg IO,et al.Thiomersal preservative,pertussis vaccine and intussusception of the bowel in mice.J Biol Stand, 1978,6:267～270
[3] Reijnen JAM,Festen C,Vander Gulden WJI.Intraperitoneal injection of Bordetella pertussis vaccine and thiomersal failed to produce intussusception in mice.Z Versuchstierkd, 1988,31:245～247
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[4] Matsushita M,Suzaki T,Hajiro K.Intussusception associated with Salmonella typhimurium enterocolitis.Am J Gastroenterol,1994,89:1246～1248
[5] Lopez EL,Devoto S,Woloj M,et al.Intussusception associated with Escherichia coli 0157:H7.Pediatr Infect Dis J, 1989,8:471～473
[6] Salter M,Knowles RG,Moncada S.Widespread distribution,species distribution and changes in activity of Ca2+-dependent and Ca2+-independent nitric oxide synthases.FEBS Lett, 1991,291:145～149
, 百拇医药
[7] Calignano A,Whittle BJR,Di Roas M,MOncada S.Involvement of endogenous nitric oxide in the regulation of rat intestinal motility in vivo.Europ J Pharmacol, 1992,229:273～282
[8] Hocking Mp,McCoy DM,Vogel SB,et al.Antiperistaltic and isoperistaltic intussusception associated with abnormal motility after Roux-en-ygastric bypass:A case report,Surgery,1991,110:109～112
[9] Cullen JJ,Caropreso DK,Ephgrave KS.Effect of endotoxin on canine gastrointestinal motility and transit.J Surg Res, 1995,58:90～95
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[10] Hau T.Bacteria,toxins,and the peritoneum.World J Surg, 1990,14:167～175
[11] Goldman L,Elman R.Spontaneous reduction of acute intussusception in children.Am J Surg, 1940,49:259～263
[12] Swischuk LE,John SD,Swischuk PN.Spontaneous reduction of intussusception:Verification with US. Radiology, 1994,192:269～271
(收稿 1998-10-10), 百拇医药