胃癌内镜活检组织nm23，CD44V基因蛋白的表达及临床意义
作者：张立玮 王士杰 王顺平 李英赛 丛庆文 吴明利 左连富 郭建文 刘江惠
单位：张立玮 王士杰 王顺平 李英赛 丛庆文 吴明利(河北医科大学第四医院内镜室 050011)；左连富 郭建文 刘江惠(河北省肿瘤研究所)
关键词：胃肿瘤；基因表达；活检组织；流式细胞光度术
中国内镜杂志990113 应用流式细胞光度术和免疫荧光染色技术，对胃癌活检组织nm23，CD44V基因的表达进行了定量研究。结果表明：胃癌组织nm23、CD44V表达量明显高于正常胃粘膜组织，并发现nm23表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移及组织学分级呈负相关，CD44V表达与淋巴结转移呈正相关。提示这一方法可作为胃癌术前估计预后的一项指标。
分类号 R735.2
, 百拇医药
恶性肿瘤的发生、发展及转移不仅与癌基因、抑癌基因相关，而且与调控基因的表达有关。在肿瘤转移机制研究中，尤以促进转移发生的转移基因和控制转移发生的转移抑制基因的研究引人注目。本研究应用流式细胞分析技术(FCM)测定内镜活检组织中肿瘤转移抑制基因nm23、肿瘤转移基因CD44V在胃癌中的表达，旨在探明其与胃癌生物学行为的关系，并寻求一种术前判定胃癌浸润、转移并了解预后的基因检测手段。
1 材料和方法
1.1 材料来源
50例胃癌取自胃镜活检组织并经病理证实，10例正常胃粘膜组织作为对照。取下各组织分别用70%酒精固定，低温(4℃)保存，供FCM检测。
1.2 试剂
鼠抗人nm23蛋白单克隆抗体，鼠抗人CD44V蛋白单克隆抗体(均为美国Snata Cruz公司产品)。
, 百拇医药
1.3 方法
固定后的标本用生理盐水反复冲洗搓网法制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法，用1∶100稀释的nm23、CD44V蛋白单克隆抗体对细胞进行免疫荧光染色，37℃水溶30min，离心洗涤后加入羊抗鼠FITC-IgG染色，37℃水溶30min，离心洗涤，400目筛网过滤后即可上机检测。
1.4 流式细胞分析
采用美国BD公司生产的流式细胞仪FACS-420型，光源为2W氩离子激光器，工作功率为300mV，分别进行单参数分析，测定前以鸡红细胞作为标准细胞样品调整仪器的变异系数值在5%以内。测定数据和图形输入HP-300 Consort 30计算机，应用相应的软件程序进行资料处理。
1.5 nm23、CD44V基因蛋白表达的定量分析
, 百拇医药
按照Morkve等[1]提出的荧光指数(Fluorescence Index,FI)表示nm23、CD44V的相对含量：
1.6 统计方法
采用t检验、χ2检验分析方法。
2 结果
2.1 胃癌组织和正常粘膜nm23、CD44V蛋白定量表达的比较
本组检测结果显示胃癌组织nm23、CD44V蛋白表达值明显高于正常粘膜表达值，具有显著性差异(P<0.01)见表1。
表1 胃癌组织和正常粘膜nm23、CD44V蛋白定量表的比较(
±s) 组 别
, 百拇医药
例 数
nm23(FI)
CD44V(FI)
胃癌组织
50
1.25±0.19
1.52±0.20
正常组织
10
1.07±0.05
, 百拇医药
1.09±0.05
注：P<0.01
2.2 胃癌组织nm23、CD44V蛋白定量表达与临床病理的关系
nm23蛋白表达值在组织分化Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ级分别为(1.28±0.21)和(1.19±0.16)，具有统计学差异(P<0.05)；浸润深度在m-Sm和Pm-S分别为(1.40±0.16)和(1.21±0.17)，有淋巴结转移组(1.16±0.13)与无淋巴结转移组(1.34±0.20)，两组相比均有显著性差异(P<0.01)见表2。
CD44V蛋白表达值在淋巴结转移组(1.66±0.16)，明显高于无淋巴结转移组的(1.47±0.13)，具有显著性差异(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
表2 胃癌组织nm23、CD44V蛋白定量表达与临床病理的关系(±s) 类别
例数
nm23(FI)
CD44V(FI)
大体类型
限局性
36
1.26±0.19
1.54±0.21
浸润性
, 百拇医药
14
1.21±0.20
1.52±0.19
组织学分级
Ⅰ～Ⅱ级
32
1.28±0.212)
1.54±0.19
Ⅲ级
18
1.19±0.16
1.55±0.18
, http://www.100md.com
浸润深度
m-Sm
11
1.40±0.161)
1.56±0.25
Pm-S
39
1.21±0.17
1.49±0.18
淋巴结转移
阴性
24
, 百拇医药
1.34±0.201)
1.47±0.131)
阳性
26
1.16±0.13
1.66±0.16
注：1)P<0.01
2)P<0.05
m-粘膜层， Sm-粘膜下层， Pm-固有肌层， S-浆膜层
nm23、CD44V蛋白表达值与患者年龄、性别无关。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤转移是非常复杂的病变过程，涉及多种癌基因和抗癌基因的表达与调控，nm23基因是目前研究较为广泛的肿瘤转移抑制基因，该基因位于染色体17q21，3，编码17KD蛋白，分布于细胞核和细胞质中，nm23基因蛋白产物促进细胞中微管的聚合，影响肿瘤细胞对周围组织及基质的附着能力，从而影响癌转移过程。已有研究表明[2]，nm23表达的改变与多种肿瘤的转移有关，但不同的肿瘤其表达水平各异。
本研究采用FCM检测胃癌组织nm23基因蛋白的表达值较正常对照明显增高，与Nakayama所测结果一致[3]。本组结果未显示nm23与大体类型的相关性，而显示与肿瘤的组织学分级、浸润深度呈负相关，淋巴结转移组与非转移组相比，nm23表达量明显下降，这与Kodera[4]研究结果相同，说明nm23基因表达降低参与了胃癌的转移和浸润过程，可提示病情进展，对预后判断有参考价值。
, 百拇医药
CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜粘蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞、血液细胞和上皮细胞表面都能检测到它的表达。作为细胞表面粘附分子，其主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连，能与透明质酸酶结合，是一种与肿瘤发生及转移有关的基因。人类CD44基因位于11号染色体短臂上，至少有20个外显子，按表达方式分为两种类型：标准型CD44S和变异型CD44V，研究表明[5]具有转移能力的癌细胞主要表达CD44V，而非转移的癌细胞和正常组织则表达CD44S。
本组对50例胃癌组织检测结果显示CD44V表达值明显高于正常对照，具有显著性差异，说明在胃癌中存在CD44V基因的高表达，在淋巴结转移组其表达值也明显高于非转移组，表明CD44V表达与胃癌转移呈正相关，而在组织学分级、大体类型和浸润深度方面未显示相关性。
, 百拇医药
总之，胃癌发生、发展、浸润和转移过程中，存在多基因的共同调控，nm23、CD44V基因的表达与胃癌发展及转移密切相关。利用胃镜活检组织检测nm23、CD44V基因对于术前判断肿瘤的浸润深度、淋巴结转移提供理论依据，并可作为判断患者预后的有价值的分子生物学指标。
参考文献
1 Morkve O,Leaerum OD.Flow cytometry measurement of p21,p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissues from bronchial carcinoma.Cytometry,1991；12:438
2 黎怀星.nm23基因与肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：73
, 百拇医药
3 Nakayama H,yasui W.Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas.Jan J Cancer Res,1993;84:184
4 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M.Expression of nm23-H RNA levels in human gastric cancer tissues.Cancer,1994;73:259
5 金顺钱，张 伟.CD44的变异性表达和肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：58
(1998-09-21收稿 张熙纯审稿), http://www.100md.com
单位：张立玮 王士杰 王顺平 李英赛 丛庆文 吴明利(河北医科大学第四医院内镜室 050011)；左连富 郭建文 刘江惠(河北省肿瘤研究所)
关键词：胃肿瘤；基因表达；活检组织；流式细胞光度术
中国内镜杂志990113 应用流式细胞光度术和免疫荧光染色技术，对胃癌活检组织nm23，CD44V基因的表达进行了定量研究。结果表明：胃癌组织nm23、CD44V表达量明显高于正常胃粘膜组织，并发现nm23表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移及组织学分级呈负相关，CD44V表达与淋巴结转移呈正相关。提示这一方法可作为胃癌术前估计预后的一项指标。
分类号 R735.2
, 百拇医药
恶性肿瘤的发生、发展及转移不仅与癌基因、抑癌基因相关，而且与调控基因的表达有关。在肿瘤转移机制研究中，尤以促进转移发生的转移基因和控制转移发生的转移抑制基因的研究引人注目。本研究应用流式细胞分析技术(FCM)测定内镜活检组织中肿瘤转移抑制基因nm23、肿瘤转移基因CD44V在胃癌中的表达，旨在探明其与胃癌生物学行为的关系，并寻求一种术前判定胃癌浸润、转移并了解预后的基因检测手段。
1 材料和方法
1.1 材料来源
50例胃癌取自胃镜活检组织并经病理证实，10例正常胃粘膜组织作为对照。取下各组织分别用70%酒精固定，低温(4℃)保存，供FCM检测。
1.2 试剂
鼠抗人nm23蛋白单克隆抗体，鼠抗人CD44V蛋白单克隆抗体(均为美国Snata Cruz公司产品)。
, 百拇医药
1.3 方法
固定后的标本用生理盐水反复冲洗搓网法制备单细胞悬液，采用间接免疫荧光标记法，用1∶100稀释的nm23、CD44V蛋白单克隆抗体对细胞进行免疫荧光染色，37℃水溶30min，离心洗涤后加入羊抗鼠FITC-IgG染色，37℃水溶30min，离心洗涤，400目筛网过滤后即可上机检测。
1.4 流式细胞分析
采用美国BD公司生产的流式细胞仪FACS-420型，光源为2W氩离子激光器，工作功率为300mV，分别进行单参数分析，测定前以鸡红细胞作为标准细胞样品调整仪器的变异系数值在5%以内。测定数据和图形输入HP-300 Consort 30计算机，应用相应的软件程序进行资料处理。
1.5 nm23、CD44V基因蛋白表达的定量分析
, 百拇医药
按照Morkve等[1]提出的荧光指数(Fluorescence Index,FI)表示nm23、CD44V的相对含量：
1.6 统计方法
采用t检验、χ2检验分析方法。
2 结果
2.1 胃癌组织和正常粘膜nm23、CD44V蛋白定量表达的比较
本组检测结果显示胃癌组织nm23、CD44V蛋白表达值明显高于正常粘膜表达值，具有显著性差异(P<0.01)见表1。
表1 胃癌组织和正常粘膜nm23、CD44V蛋白定量表的比较(
±s) 组 别, 百拇医药
例 数
nm23(FI)
CD44V(FI)
胃癌组织
50
1.25±0.19
1.52±0.20
正常组织
10
1.07±0.05
, 百拇医药
1.09±0.05
注：
P<0.012.2 胃癌组织nm23、CD44V蛋白定量表达与临床病理的关系
nm23蛋白表达值在组织分化Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ级分别为(1.28±0.21)和(1.19±0.16)，具有统计学差异(P<0.05)；浸润深度在m-Sm和Pm-S分别为(1.40±0.16)和(1.21±0.17)，有淋巴结转移组(1.16±0.13)与无淋巴结转移组(1.34±0.20)，两组相比均有显著性差异(P<0.01)见表2。
CD44V蛋白表达值在淋巴结转移组(1.66±0.16)，明显高于无淋巴结转移组的(1.47±0.13)，具有显著性差异(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
表2 胃癌组织nm23、CD44V蛋白定量表达与临床病理的关系(
±s) 类别例数
nm23(FI)
CD44V(FI)
大体类型
限局性
36
1.26±0.19
1.54±0.21
浸润性
, 百拇医药
14
1.21±0.20
1.52±0.19
组织学分级
Ⅰ～Ⅱ级
32
1.28±0.212)
1.54±0.19
Ⅲ级
18
1.19±0.16
1.55±0.18
, http://www.100md.com
浸润深度
m-Sm
11
1.40±0.161)
1.56±0.25
Pm-S
39
1.21±0.17
1.49±0.18
淋巴结转移
阴性
24
, 百拇医药
1.34±0.201)
1.47±0.131)
阳性
26
1.16±0.13
1.66±0.16
注：1)P<0.01
2)P<0.05
m-粘膜层， Sm-粘膜下层， Pm-固有肌层， S-浆膜层
nm23、CD44V蛋白表达值与患者年龄、性别无关。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤转移是非常复杂的病变过程，涉及多种癌基因和抗癌基因的表达与调控，nm23基因是目前研究较为广泛的肿瘤转移抑制基因，该基因位于染色体17q21，3，编码17KD蛋白，分布于细胞核和细胞质中，nm23基因蛋白产物促进细胞中微管的聚合，影响肿瘤细胞对周围组织及基质的附着能力，从而影响癌转移过程。已有研究表明[2]，nm23表达的改变与多种肿瘤的转移有关，但不同的肿瘤其表达水平各异。
本研究采用FCM检测胃癌组织nm23基因蛋白的表达值较正常对照明显增高，与Nakayama所测结果一致[3]。本组结果未显示nm23与大体类型的相关性，而显示与肿瘤的组织学分级、浸润深度呈负相关，淋巴结转移组与非转移组相比，nm23表达量明显下降，这与Kodera[4]研究结果相同，说明nm23基因表达降低参与了胃癌的转移和浸润过程，可提示病情进展，对预后判断有参考价值。
, 百拇医药
CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜粘蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞、血液细胞和上皮细胞表面都能检测到它的表达。作为细胞表面粘附分子，其主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连，能与透明质酸酶结合，是一种与肿瘤发生及转移有关的基因。人类CD44基因位于11号染色体短臂上，至少有20个外显子，按表达方式分为两种类型：标准型CD44S和变异型CD44V，研究表明[5]具有转移能力的癌细胞主要表达CD44V，而非转移的癌细胞和正常组织则表达CD44S。
本组对50例胃癌组织检测结果显示CD44V表达值明显高于正常对照，具有显著性差异，说明在胃癌中存在CD44V基因的高表达，在淋巴结转移组其表达值也明显高于非转移组，表明CD44V表达与胃癌转移呈正相关，而在组织学分级、大体类型和浸润深度方面未显示相关性。
, 百拇医药
总之，胃癌发生、发展、浸润和转移过程中，存在多基因的共同调控，nm23、CD44V基因的表达与胃癌发展及转移密切相关。利用胃镜活检组织检测nm23、CD44V基因对于术前判断肿瘤的浸润深度、淋巴结转移提供理论依据，并可作为判断患者预后的有价值的分子生物学指标。
参考文献
1 Morkve O,Leaerum OD.Flow cytometry measurement of p21,p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissues from bronchial carcinoma.Cytometry,1991；12:438
2 黎怀星.nm23基因与肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：73
, 百拇医药
3 Nakayama H,yasui W.Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas.Jan J Cancer Res,1993;84:184
4 Kodera Y,Isobe K,Yamauchi M.Expression of nm23-H RNA levels in human gastric cancer tissues.Cancer,1994;73:259
5 金顺钱，张 伟.CD44的变异性表达和肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：58
(1998-09-21收稿 张熙纯审稿), http://www.100md.com