AA患者免疫抑制治疗前后骨髓基质生长的变化
作者：郑以州 李莉 张益枝 孙娟 陈桂彬 储榆林
单位：中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院
关键词：贫血，再生障碍性 免疫抑制治疗 成纤维样祖细胞集落 形成单位
临床血液学杂志990101
摘要 目的：探讨免疫抑制治疗(IST)前后再生障碍性贫血 (AA)患者骨髓基质细胞生长缺陷及IST后其恢复的程度及上述变化与IST疗效间关系。方法： 采用改良的Gartner-Kaplan液体培养法，动态观察80例接受IST的AA患者骨髓成纤维细胞样 祖细胞集落形成单位(CFU-F)的数量变化。结果：IST前仅5例患者CFU-F数量正常，余75例 患者CFU-F生长严重缺陷或无生长；有CFU-F生长者疗效优于无CFU-F生长者，但差异无显 著性(P>0.05)。IST后获基本治愈者骨髓CFU-F数量增加最为显著(P<0.01 )，缓解者及明显进步者CFU-F数量亦增加，但差异不显著(P>0.05)。结论：AA 确是一组异质性疾病，IST可部分纠正其基质生长缺陷。
, http://www.100md.com
Changes of Bone Marrow Colonies of Colony Forming Unit-fibroblastlike (CFU-F) of Patients with Aplastic Anemia in Pre-/Post-immunosuppressive Thera py
Zheng Yizhou,Li Li,Zhang Yizhi,et al
Institute of Hematology and Blood Diseases Hospitals,CAMS and PUMC 3000 26
Abstract Objective:To investigate the degrees of bon e marrow stroma growth impairment of patients with aplastic anemia (AA) in pre- /post-immunosuppressive therapy (IST),and their correlations with clinical resp onses.Methods:Serial changes of bone marrow colonies of colony forming unit-fib roblastlike (CFU-F) of patients with AA were observed by using the technique of stroma cultures established by Gartner and Kaplan with slight modifications.Res ults:Before IST colonies of CFU-F from only 5 patients were normal,and the colo nies of CFU-F in decreased severely or even absent for the rest;the response ra te of AA patients with CFU-F formation was higher than that of those without CF U-F Formation but not significantly;after IST colonies of CFU-F in creased in significantly from those patients achiveve complete remission and parial remissi on Also they no significant as compared with nonresponsive patients.Conclusions: AA is pathophysiologically heterogenous,after IST its bone marrow stroma growth impairment may be partly corrected.
, 百拇医药
Key words Anemia,aplastic Immunosuppressive therapy Colony forming uint-fibroblast-like
再生障碍性贫血(AA)的特征是骨髓造血功能衰竭所致的全血 细胞减少，发病机理极为复杂，目前尚未完全明了〔1，2〕。大量临床及实验室研 究资料表明，骨髓基质细胞生长缺陷可能为其重要病理生理机制之一〔3〕，且严重 型AA(SAA)表现得尤为明显〔4〕。我院1992年1月～1997年1月追踪观察了80例接受免 疫抑制治疗(IST)AA患者的病情变化，定期复查患者IST前、后骨髓成纤维样细胞集落形成单 位(CFU-F)的变化，深入了解IST前AA患者骨髓基质细胞生长缺陷及IST后恢复程度，以探讨 上述变化与IST疗效间的关系，结果如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 80例初诊AA均为我院住院患者，男63 例，女17例，年龄6～63岁，中位年龄29岁。其中SAA 48例(SAA-Ⅰ型39例，SAA-Ⅱ型9例) ，慢性AA(CAA)32例。以20例健康献血员作为对照组，男8例，女12例，年龄18～51岁，中位 年龄34岁。
1.2 IST方案 ①SAA：马-抗淋巴细胞球蛋白(H-ALG ，法国Pasteur Merieux血清和疫苗公司产品)：10～15 mg/(kg.d)，+1～+5 d，溶于500～ 1 000 ml、0.9% NaCl溶液中，12～16 h内静脉输注；环孢霉素A(CsA，瑞士Sandoz公 司产品)：3～5 mg/(kg.d)，H-ALG后+31开始用，连续服用>6个月，根据血清肌酐及胆红 素浓度调节其剂量；为预防及减轻H-ALG近期毒副作用，从+1 d开始给予皮质类固醇，+1～ +5 d静脉输注地塞米松〔按泼尼松1 mg/(kg.d)剂量换算〕，+6 d改服用泼尼松并逐渐减量 ，若无明显H-ALG毒副作用，可于+30 d后停用泼尼松；所有患者于+6 d并用长效睾丸酮(TL D，瑞士Ciba-Geigy公司产品)，250 mg/次，肌注，每周2次，连续>6个月，以此作为基 础治疗。②CAA：CsA并用TLD治疗，剂量及疗程同上所述。
, 百拇医药
1.3 骨髓CFU-F培养 采用改良的Gartner-kaplan液 体培养法〔5〕，常规抽取肝素抗凝骨髓液3 ml，以Ficoll-Hypaque比重离心法分离 出骨髓单个核细胞(BMMNCs)，计数备用。培养基为IMDM，培养体系中含20%(V/V)胎牛血清(F CS)，10-4 mol/L甲基强的松龙(MP)，0.3%(W/V)左旋谷氨酰胺(L-Glu)，青霉素 -链霉素(PS)各100 U/ml和100 ng/ml，用25 ml塑料培养瓶(丹麦Nunclon公司产品)进行培 养(每瓶BMMNCs数为2.0×106)，置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。第14天 观察结果，经甲醇固定，瑞氏染液染色，以肉眼可见由成纤维样细胞形成的生长晕为集落(C FU-F)。
1.4 AA诊断及疗效标准 按全国统一标准确定AA诊断 及判断疗效〔6〕
, 百拇医药 1.5 统计学处理 各项指标均以
±s表 示；差异比较采用t检验；四格表资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 AA患者IST前及疗效评定时骨髓CFU-F数量的变化 所有患者于IST前均行骨髓CFU-F检测，IST后随访2～6年，于评定疗效时进行多次复查。 IST前仅5例患者骨髓CFU-F数量在正常范围内，其余患者CFU-F生长严重缺陷(22例)或无生 长(53例)；IST后上述患者CFU-F数量显著增多(P<0.01)，但仍显著低于正常对照 组(P<0.01)，且SAA与CAA两组患者间IST前、后CFU-F数量差异皆无显著性(表1) 。
表1 AA患者IST前及疗效评定时骨髓CFU -F(/2×106 BMMNCs)数量变化 骨髓来源
, 百拇医药
例数
CFU-F
(±s)
P值*
IST前
SAA组
48
2.9±1.9
<0.001
CAA组
32
3.5±2.4
, 百拇医药
<0.001
IST后
SAA组
48
9.5±9.2
<0.01
CAA组
32
11.4±11.3
<0.01
健康献血员
20
32.7±11.1
, 百拇医药
与健康献血员比较
2.2 AA患者IST疗效 80例AA患者疗效见表2。表2 AA患者临床疗效 组别
疗效(例数%)
总 有效
率(%)
基本治愈
缓解
明显进步
无效
SAA
14(29.2)
8(16.7)
, http://www.100md.com
7(14.6)
19(39.6)
60.4
CAA
7(21.9)
13(40.6)
5(15.6)
7(21.9)
78.1
合计
21(26.3)
21(26.3)
, http://www.100md.com
12(15.0)
26(32.5)
67.5
2.3 AA患者骨髓CFU-F数量与IST疗效间关系 ①AA患 者IST前骨髓CFU-F数量与疗效间关系：80例AA患者中，IST前27例有CFU-F生长，有效例数 为21例(77.8%)；53例无CFU-F生长，有效例数33例(62.3%)，前组有效率高于后组 ，但两组间有效率差异无显著性(P>0.05)。②IST后SAA患者骨髓CFU-F数量变化 与其疗效间关系：IST后上述患者骨髓CFU-F数量恢复不完全。进一步分析发现，其CFU-F 数量增加与其疗效呈等级相关(表3)。有效各组中基本治愈组CFU-F数量显著高于缓解组及 明显进步组(P<0.01)(表3)。表3 IST后AA患者骨髓CFU-F(/2×106 BMMNCs)数量与其疗效关系 疗效分组
, 百拇医药
例数
CFU-F
(±s)
P值
基本治愈组
21
17.6±8.5
<0.001
缓解组
21
, 百拇医药
7.4±6.3
>0.05
明显进步组
12
9.1±8.6
>0.05
无效组
26
5.2±5.1
与无效组比较
3 讨论
骨髓基质细胞通过直接作用、分泌胞外基质(ECM)及释放造血细胞生长因子(HGFs) ，支持和调节造血细胞生长发育，与骨髓造血功能密切相关。正常情况下基质细胞功能随造 血的需求发生相应生理性变化。既往大量研究结果表明，AA骨髓造血功能衰竭可能由造血微 环境中基质细胞功能缺陷所致。最近Nissen等〔4〕研究发现短期(2周)CFU-F培养更 能真实确切反映骨髓造血微环境的基质细胞生长及造血支持能力，应用短期液体体外培养技 术，该作者观察到仅3/54例AA患者基质细胞体外生长良好。我们研究同样证实，仅5/80例AA 患者骨髓CFU-F数量在正常范围，绝大多数患者IST前骨髓CFU-F生长严重缺陷甚或不生长 。尽管目前尚无直接证据表明单一基质细胞功能缺陷可导致骨髓造血功能衰竭，但多数学者 认为，对于AA(尤其是SAA)患者，基质细胞功能缺陷可进一步加重病情。目前研究表明，ALG 治疗SAA主要疗愈机制之一在于其免疫刺激效应，即其具有类似植物血凝素(PHA)。但较之更 强的致丝裂原效应，可刺激骨髓基质细胞合成及释放某些HGFs，如白细胞介素(IL)-3、粒 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。我们亦观察到有CFU-F生长者对IST疗效优于无CFU -F生长者(尽管两者间差异无显著性)，此从另一侧面反映了AA病理生理机制方面高度异质 性及ALG疗效机制的复杂性。
, 百拇医药
IST后有效AA患者骨髓造血功能恢复往往不完全，此与其CFU-F持续性生长不良是否有关目 前尚不十分清楚，但疗效愈好(基本治愈者)其CFU-F数量增加愈显著。Nissen等〔4〕 研究发现，IST后基质细胞生长持续缺陷者更易复发：1/25例基质细胞生长正常者复发， 而9/29例基质细胞生长严重缺陷者复发，说明基质细胞对维持IST后持续缓解极为重要。鉴 于此，如何进一步提高伴有基质细胞缺陷AA患者临床疗效是摆在临床研究人员面前的重要课 题。我们临床研究结果证明，加用重组人HGFs(rhu HGFs)，如重组人GM-CSF (rhu GM-CSF )、重组人促红细胞生成素(rhu EPO)等可显著提高本病疗效，1年基本治愈约83.3%， 其远期疗效有待于进一步随访观察〔7〕。
邮政编码：天津市，300026
参考文献
[1] Yong NS.Aplastic anemia.Lancet,1995,346:228
, http://www.100md.com
[2] 李睿，郑以州，储榆林.再生障碍性贫血病理机制研究新进展.国外医学输血及血 液学分册，1997，20(3)：129
[3] 姜学英，杨少光，邢风楼，等.再生障碍性贫血患者骨髓中成纤维样细胞祖细胞 的变化.天津医药，1988，15(4)：138
[4] Nissen C,Wodnar-Filipowice A,Slonicka-Krieger M,et al.Persist ent growth impairment of bone marrow stroma after antilymphocyte globulin treatm ent for severe aplastic anaemia and its association with relapse.Eur J Haematol, 1995;55(4):255
[5] Gartner S,Kaplan H.Long-term culture of human bone marrow cells.Proc Natl Acad Sci USA,1980,7(12):4756
[6] 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998.33
[7] 邵宗鸿，储榆林，张益枝，等.ALG、CsA并用GM-CSF、EPO治疗严重型再生障碍 性贫血初步观察.中华血液学杂志，1996，17(4)：176
(1998-08-31 收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院
关键词：贫血，再生障碍性 免疫抑制治疗 成纤维样祖细胞集落 形成单位
临床血液学杂志990101
摘要 目的：探讨免疫抑制治疗(IST)前后再生障碍性贫血 (AA)患者骨髓基质细胞生长缺陷及IST后其恢复的程度及上述变化与IST疗效间关系。方法： 采用改良的Gartner-Kaplan液体培养法，动态观察80例接受IST的AA患者骨髓成纤维细胞样 祖细胞集落形成单位(CFU-F)的数量变化。结果：IST前仅5例患者CFU-F数量正常，余75例 患者CFU-F生长严重缺陷或无生长；有CFU-F生长者疗效优于无CFU-F生长者，但差异无显 著性(P>0.05)。IST后获基本治愈者骨髓CFU-F数量增加最为显著(P<0.01 )，缓解者及明显进步者CFU-F数量亦增加，但差异不显著(P>0.05)。结论：AA 确是一组异质性疾病，IST可部分纠正其基质生长缺陷。
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Changes of Bone Marrow Colonies of Colony Forming Unit-fibroblastlike (CFU-F) of Patients with Aplastic Anemia in Pre-/Post-immunosuppressive Thera py
Zheng Yizhou,Li Li,Zhang Yizhi,et al
Institute of Hematology and Blood Diseases Hospitals,CAMS and PUMC 3000 26
Abstract Objective:To investigate the degrees of bon e marrow stroma growth impairment of patients with aplastic anemia (AA) in pre- /post-immunosuppressive therapy (IST),and their correlations with clinical resp onses.Methods:Serial changes of bone marrow colonies of colony forming unit-fib roblastlike (CFU-F) of patients with AA were observed by using the technique of stroma cultures established by Gartner and Kaplan with slight modifications.Res ults:Before IST colonies of CFU-F from only 5 patients were normal,and the colo nies of CFU-F in decreased severely or even absent for the rest;the response ra te of AA patients with CFU-F formation was higher than that of those without CF U-F Formation but not significantly;after IST colonies of CFU-F in creased in significantly from those patients achiveve complete remission and parial remissi on Also they no significant as compared with nonresponsive patients.Conclusions: AA is pathophysiologically heterogenous,after IST its bone marrow stroma growth impairment may be partly corrected.
, 百拇医药
Key words Anemia,aplastic Immunosuppressive therapy Colony forming uint-fibroblast-like
再生障碍性贫血(AA)的特征是骨髓造血功能衰竭所致的全血 细胞减少，发病机理极为复杂，目前尚未完全明了〔1，2〕。大量临床及实验室研 究资料表明，骨髓基质细胞生长缺陷可能为其重要病理生理机制之一〔3〕，且严重 型AA(SAA)表现得尤为明显〔4〕。我院1992年1月～1997年1月追踪观察了80例接受免 疫抑制治疗(IST)AA患者的病情变化，定期复查患者IST前、后骨髓成纤维样细胞集落形成单 位(CFU-F)的变化，深入了解IST前AA患者骨髓基质细胞生长缺陷及IST后恢复程度，以探讨 上述变化与IST疗效间的关系，结果如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 80例初诊AA均为我院住院患者，男63 例，女17例，年龄6～63岁，中位年龄29岁。其中SAA 48例(SAA-Ⅰ型39例，SAA-Ⅱ型9例) ，慢性AA(CAA)32例。以20例健康献血员作为对照组，男8例，女12例，年龄18～51岁，中位 年龄34岁。
1.2 IST方案 ①SAA：马-抗淋巴细胞球蛋白(H-ALG ，法国Pasteur Merieux血清和疫苗公司产品)：10～15 mg/(kg.d)，+1～+5 d，溶于500～ 1 000 ml、0.9% NaCl溶液中，12～16 h内静脉输注；环孢霉素A(CsA，瑞士Sandoz公 司产品)：3～5 mg/(kg.d)，H-ALG后+31开始用，连续服用>6个月，根据血清肌酐及胆红 素浓度调节其剂量；为预防及减轻H-ALG近期毒副作用，从+1 d开始给予皮质类固醇，+1～ +5 d静脉输注地塞米松〔按泼尼松1 mg/(kg.d)剂量换算〕，+6 d改服用泼尼松并逐渐减量 ，若无明显H-ALG毒副作用，可于+30 d后停用泼尼松；所有患者于+6 d并用长效睾丸酮(TL D，瑞士Ciba-Geigy公司产品)，250 mg/次，肌注，每周2次，连续>6个月，以此作为基 础治疗。②CAA：CsA并用TLD治疗，剂量及疗程同上所述。
, 百拇医药
1.3 骨髓CFU-F培养 采用改良的Gartner-kaplan液 体培养法〔5〕，常规抽取肝素抗凝骨髓液3 ml，以Ficoll-Hypaque比重离心法分离 出骨髓单个核细胞(BMMNCs)，计数备用。培养基为IMDM，培养体系中含20%(V/V)胎牛血清(F CS)，10-4 mol/L甲基强的松龙(MP)，0.3%(W/V)左旋谷氨酰胺(L-Glu)，青霉素 -链霉素(PS)各100 U/ml和100 ng/ml，用25 ml塑料培养瓶(丹麦Nunclon公司产品)进行培 养(每瓶BMMNCs数为2.0×106)，置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。第14天 观察结果，经甲醇固定，瑞氏染液染色，以肉眼可见由成纤维样细胞形成的生长晕为集落(C FU-F)。
1.4 AA诊断及疗效标准 按全国统一标准确定AA诊断 及判断疗效〔6〕
, 百拇医药 1.5 统计学处理 各项指标均以
±s表 示；差异比较采用t检验；四格表资料采用χ2检验。2 结果
2.1 AA患者IST前及疗效评定时骨髓CFU-F数量的变化 所有患者于IST前均行骨髓CFU-F检测，IST后随访2～6年，于评定疗效时进行多次复查。 IST前仅5例患者骨髓CFU-F数量在正常范围内，其余患者CFU-F生长严重缺陷(22例)或无生 长(53例)；IST后上述患者CFU-F数量显著增多(P<0.01)，但仍显著低于正常对照 组(P<0.01)，且SAA与CAA两组患者间IST前、后CFU-F数量差异皆无显著性(表1) 。
表1 AA患者IST前及疗效评定时骨髓CFU -F(/2×106 BMMNCs)数量变化 骨髓来源
, 百拇医药
例数
CFU-F
(
±s)P值*
IST前
SAA组
48
2.9±1.9
<0.001
CAA组
32
3.5±2.4
, 百拇医药
<0.001
IST后
SAA组
48
9.5±9.2
<0.01
CAA组
32
11.4±11.3
<0.01
健康献血员
20
32.7±11.1
, 百拇医药
与健康献血员比较
2.2 AA患者IST疗效 80例AA患者疗效见表2。表2 AA患者临床疗效 组别
疗效(例数%)
总 有效
率(%)
基本治愈
缓解
明显进步
无效
SAA
14(29.2)
8(16.7)
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7(14.6)
19(39.6)
60.4
CAA
7(21.9)
13(40.6)
5(15.6)
7(21.9)
78.1
合计
21(26.3)
21(26.3)
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12(15.0)
26(32.5)
67.5
2.3 AA患者骨髓CFU-F数量与IST疗效间关系 ①AA患 者IST前骨髓CFU-F数量与疗效间关系：80例AA患者中，IST前27例有CFU-F生长，有效例数 为21例(77.8%)；53例无CFU-F生长，有效例数33例(62.3%)，前组有效率高于后组 ，但两组间有效率差异无显著性(P>0.05)。②IST后SAA患者骨髓CFU-F数量变化 与其疗效间关系：IST后上述患者骨髓CFU-F数量恢复不完全。进一步分析发现，其CFU-F 数量增加与其疗效呈等级相关(表3)。有效各组中基本治愈组CFU-F数量显著高于缓解组及 明显进步组(P<0.01)(表3)。表3 IST后AA患者骨髓CFU-F(/2×106 BMMNCs)数量与其疗效关系 疗效分组
, 百拇医药
例数
CFU-F
(
±s)P值
基本治愈组
21
17.6±8.5
<0.001
缓解组
21
, 百拇医药
7.4±6.3
>0.05
明显进步组
12
9.1±8.6
>0.05
无效组
26
5.2±5.1
与无效组比较
3 讨论
骨髓基质细胞通过直接作用、分泌胞外基质(ECM)及释放造血细胞生长因子(HGFs) ，支持和调节造血细胞生长发育，与骨髓造血功能密切相关。正常情况下基质细胞功能随造 血的需求发生相应生理性变化。既往大量研究结果表明，AA骨髓造血功能衰竭可能由造血微 环境中基质细胞功能缺陷所致。最近Nissen等〔4〕研究发现短期(2周)CFU-F培养更 能真实确切反映骨髓造血微环境的基质细胞生长及造血支持能力，应用短期液体体外培养技 术，该作者观察到仅3/54例AA患者基质细胞体外生长良好。我们研究同样证实，仅5/80例AA 患者骨髓CFU-F数量在正常范围，绝大多数患者IST前骨髓CFU-F生长严重缺陷甚或不生长 。尽管目前尚无直接证据表明单一基质细胞功能缺陷可导致骨髓造血功能衰竭，但多数学者 认为，对于AA(尤其是SAA)患者，基质细胞功能缺陷可进一步加重病情。目前研究表明，ALG 治疗SAA主要疗愈机制之一在于其免疫刺激效应，即其具有类似植物血凝素(PHA)。但较之更 强的致丝裂原效应，可刺激骨髓基质细胞合成及释放某些HGFs，如白细胞介素(IL)-3、粒 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。我们亦观察到有CFU-F生长者对IST疗效优于无CFU -F生长者(尽管两者间差异无显著性)，此从另一侧面反映了AA病理生理机制方面高度异质 性及ALG疗效机制的复杂性。
, 百拇医药
IST后有效AA患者骨髓造血功能恢复往往不完全，此与其CFU-F持续性生长不良是否有关目 前尚不十分清楚，但疗效愈好(基本治愈者)其CFU-F数量增加愈显著。Nissen等〔4〕 研究发现，IST后基质细胞生长持续缺陷者更易复发：1/25例基质细胞生长正常者复发， 而9/29例基质细胞生长严重缺陷者复发，说明基质细胞对维持IST后持续缓解极为重要。鉴 于此，如何进一步提高伴有基质细胞缺陷AA患者临床疗效是摆在临床研究人员面前的重要课 题。我们临床研究结果证明，加用重组人HGFs(rhu HGFs)，如重组人GM-CSF (rhu GM-CSF )、重组人促红细胞生成素(rhu EPO)等可显著提高本病疗效，1年基本治愈约83.3%， 其远期疗效有待于进一步随访观察〔7〕。
邮政编码：天津市，300026
参考文献
[1] Yong NS.Aplastic anemia.Lancet,1995,346:228
, http://www.100md.com
[2] 李睿，郑以州，储榆林.再生障碍性贫血病理机制研究新进展.国外医学输血及血 液学分册，1997，20(3)：129
[3] 姜学英，杨少光，邢风楼，等.再生障碍性贫血患者骨髓中成纤维样细胞祖细胞 的变化.天津医药，1988，15(4)：138
[4] Nissen C,Wodnar-Filipowice A,Slonicka-Krieger M,et al.Persist ent growth impairment of bone marrow stroma after antilymphocyte globulin treatm ent for severe aplastic anaemia and its association with relapse.Eur J Haematol, 1995;55(4):255
[5] Gartner S,Kaplan H.Long-term culture of human bone marrow cells.Proc Natl Acad Sci USA,1980,7(12):4756
[6] 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998.33
[7] 邵宗鸿，储榆林，张益枝，等.ALG、CsA并用GM-CSF、EPO治疗严重型再生障碍 性贫血初步观察.中华血液学杂志，1996，17(4)：176
(1998-08-31 收稿), 百拇医药