结晶紫复红墨汁荚膜染色法
作者：杨宗琪 张凤鸣 夏建平
单位：川北医学院微生物教研室 637007
关键词：
川北医学院学报/990177 荚膜染色在细菌学染色中是较难掌握的一种技术，荚膜不易着色，着色后也极易脱色，不易保存。现有的多种方法经笔者实践后均觉不太理想，经过反复摸索，建立结晶紫复红墨汁荚膜染色法，操作简便，又易保存。
1 材料与方法
1.1 材料 ①菌种：本室保存的Ⅲ型肺炎球菌。②小白鼠：本院动物室提供。③固定液：甲醛。④结晶紫液：结晶紫酒精饱和液20ml加于1%草酸铵水溶液80ml中即成。⑤碘液：碘化钾2g溶于少量蒸馏水中，加入碘片1g使其溶解，再加蒸馏水至300ml即成。⑥95%酒精。⑦石炭酸复红液：硷性复红酒精饱和液3ml加于3%石炭酸水溶液97ml中即成。⑧墨汁：新华墨汁，rpm3500 30min取上清经双层定性滤纸过滤后备用。
1.2 方法
1.2.1 荚膜诱导 将在血平板上37℃ 24h生长良好的Ⅲ型肺炎球菌用无菌生理盐水(N.S)洗下，注入一只小白鼠腹腔0.3ml，待小白鼠濒临死亡前注入无菌N.S 1ml于腹腔内，轻揉腹部，抽取腹腔液注入另一只小白鼠腹腔，反复3次。
1.2.2 制片 待小鼠濒临死亡前脱臼法处死，解剖暴露出腹腔，用镊子夹往肠管顺、反时针方向在载玻片同一部位涂1cm2左右的涂膜，自然干燥。
1.2.3 固定 滴甲醛液数滴盖住涂膜，作用8min左右，水洗。
1.2.4 染色 ①滴加结晶紫液数滴于涂膜，染色80 S，水洗。②媒染：滴加碘液数滴，60 S后水洗。③分色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片40 S左右，水洗。④复染：滴加石炭酸复红液数滴，50 S后水洗。⑤负染：自然干燥后用毛笔沾取墨汁，顺、反方向涂于涂膜上各一圈，自然干燥，油镜镜检。
2 结果
油镜下肺炎球菌菌体染成紫红色，菌体外为一淡红色的荚膜区，荚膜外是灰黑色的背景，三种颜色的区别十分明显。经每年数次作为示教片使用，至今已15年，仍然清晰可辨。
3 讨论
荚膜由多糖类衍生物组成，与染料的结合力很弱，不易着色。通过反复实验，笔者发现经甲醛处理的荚膜较易着色，其机理不清楚，可能是甲醛改变了荚膜的化学结构，形成了一种易着色的物质，亦可能是经甲醛处理的荚膜渗透性增加，染料易进入，其机理有待进一步研究。
墨汁负染，使背景着色，菌体、荚膜、背景之间形成鲜明的对比，便于观察。值得注意的是，在腹腔组织液涂片与墨汁涂片时，必须顺、反方向各涂一圈。因涂膜干燥后，涂膜收缩，荚膜与外周组织液和墨汁间将形成与涂片方向有关的不规则空白区，造成荚膜观察的失真，顺、反方向涂片可基本解决此不足。
笔者用此法对新型隐球菌荚膜进行染色，荚膜着色过深，菌体与荚膜的颜色反差不大，但将95%酒精改为3%盐酸酒精，时间缩短成20 S，取得了较好的染色效果。
(收稿日期：1999-01-08), 百拇医药
单位：川北医学院微生物教研室 637007
关键词：
川北医学院学报/990177 荚膜染色在细菌学染色中是较难掌握的一种技术，荚膜不易着色，着色后也极易脱色，不易保存。现有的多种方法经笔者实践后均觉不太理想，经过反复摸索，建立结晶紫复红墨汁荚膜染色法，操作简便，又易保存。
1 材料与方法
1.1 材料 ①菌种：本室保存的Ⅲ型肺炎球菌。②小白鼠：本院动物室提供。③固定液：甲醛。④结晶紫液：结晶紫酒精饱和液20ml加于1%草酸铵水溶液80ml中即成。⑤碘液：碘化钾2g溶于少量蒸馏水中，加入碘片1g使其溶解，再加蒸馏水至300ml即成。⑥95%酒精。⑦石炭酸复红液：硷性复红酒精饱和液3ml加于3%石炭酸水溶液97ml中即成。⑧墨汁：新华墨汁，rpm3500 30min取上清经双层定性滤纸过滤后备用。
1.2 方法
1.2.1 荚膜诱导 将在血平板上37℃ 24h生长良好的Ⅲ型肺炎球菌用无菌生理盐水(N.S)洗下，注入一只小白鼠腹腔0.3ml，待小白鼠濒临死亡前注入无菌N.S 1ml于腹腔内，轻揉腹部，抽取腹腔液注入另一只小白鼠腹腔，反复3次。
1.2.2 制片 待小鼠濒临死亡前脱臼法处死，解剖暴露出腹腔，用镊子夹往肠管顺、反时针方向在载玻片同一部位涂1cm2左右的涂膜，自然干燥。
1.2.3 固定 滴甲醛液数滴盖住涂膜，作用8min左右，水洗。
1.2.4 染色 ①滴加结晶紫液数滴于涂膜，染色80 S，水洗。②媒染：滴加碘液数滴，60 S后水洗。③分色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片40 S左右，水洗。④复染：滴加石炭酸复红液数滴，50 S后水洗。⑤负染：自然干燥后用毛笔沾取墨汁，顺、反方向涂于涂膜上各一圈，自然干燥，油镜镜检。
2 结果
油镜下肺炎球菌菌体染成紫红色，菌体外为一淡红色的荚膜区，荚膜外是灰黑色的背景，三种颜色的区别十分明显。经每年数次作为示教片使用，至今已15年，仍然清晰可辨。
3 讨论
荚膜由多糖类衍生物组成，与染料的结合力很弱，不易着色。通过反复实验，笔者发现经甲醛处理的荚膜较易着色，其机理不清楚，可能是甲醛改变了荚膜的化学结构，形成了一种易着色的物质，亦可能是经甲醛处理的荚膜渗透性增加，染料易进入，其机理有待进一步研究。
墨汁负染，使背景着色，菌体、荚膜、背景之间形成鲜明的对比，便于观察。值得注意的是，在腹腔组织液涂片与墨汁涂片时，必须顺、反方向各涂一圈。因涂膜干燥后，涂膜收缩，荚膜与外周组织液和墨汁间将形成与涂片方向有关的不规则空白区，造成荚膜观察的失真，顺、反方向涂片可基本解决此不足。
笔者用此法对新型隐球菌荚膜进行染色，荚膜着色过深，菌体与荚膜的颜色反差不大，但将95%酒精改为3%盐酸酒精，时间缩短成20 S，取得了较好的染色效果。
(收稿日期：1999-01-08), 百拇医药