甘氨酰替甘氨酸浸泡法在冷冻割断扫描电镜术中的应用
作者：江一平 赵玉珍 李向印 雷建章
单位：江一平 福建医科大学组织胚胎学教研室(福州 350004); 赵玉珍 李向印 雷建章 河北医科大学电镜中心(石家庄 050017)
关键词：显微镜检查，电子，扫描；冷冻割断；甘氨酰替甘氨酸；膜系结构；细胞骨架
福建医科大学学报990102 目的 运用甘氨酰替甘氨酸浸泡法对常规的DMSO法冷冻-割断扫描电镜制样技术加以改良。 方法 经过多聚甲醛-戊二醛预固定的组织冷冻割断，1%OsO4后固定，用甘氨酰替甘氨酸溶液代替常规的低浓度锇酸液浸泡作细胞基质软化。后续步骤按常规方法，扫描电镜观察。 结果 细胞内部膜系和丝状结构的超微形态保持完好，暴露明显，图像清晰，立体感强。各种膜系结构之间可见三维的丝状网络联系。 结论 醛类预固定-甘氨酰替甘氨酸浸泡法对细胞骨架的保存和显示较好，对膜系结构与细胞骨架间相互关系的研究可能有独到优势。
, 百拇医药
Observation on the Ultrastructure of Cell Freeze-fractured and Rinsed in Glycylglycine with Scanning Electron Microscopy
Jiang Yiping1, Zhao Yuzhen2, Li Xiangyin2,et al
(1.Department of Histology ＆ Embryology， Fujian Medical University，Fuzhou， 350004
2.Center of Electron Microscopy， Hebei Medical University， Shijiazhuang， 050017)
, http://www.100md.com
Objective To modified the conventional DMSO procedure of freeze-fracture for scanning electron microscopy(SEM) using glycylglycine(G-G) method which was developed by Pinto da Silva(1981). Methods Glutaraldehyde-polyformaldehyde fixed tissue block was frozen in liquid nitrogen and fractured. After thawed in PBS，the fractured blocks were postfixed with 1% OsO4 and rinsed in glycylglycine(G-G) for up to 24 h. Dehydrate and the succeeded steps were the same with ordinary method. Results The observation with SEM showed that both the membrane system (including cell surface) and the filament structure of the fractured cells were well preserved and excellent exposed. The picture attained with SEM was clear and steric. The three-dimensional filament network in cell plasma and its co-relation with nuclear， mitochondria and RER was viewed. Conclusion It might be more advantageous to the study on the relationship between membrane system and cytoskeleton using this modified method.
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Key words microscopy，electron，scanning； freeze-fracture； glycylglycine； membrane system； cytoskeleton
扫描电子显微镜技术(SEM)是对细胞表面超微结构进行三维观察的优异手段。但在观察细胞内部结构时，需采用特殊方法割断组织块，以暴露内部结构。目前已建立了多种割断法[1,2]，其中DMSO法和ODO法以结构保存和暴露良好、方法稳定通用而被公认为迄今最理想的技术，得到国内外普遍推广应用[1～3]，成为常规制样技术。然而，该法通常要求对新鲜组织直接锇酸固定，若经醛类预先固定则往往软化效果不好，导致断裂面立体感不强，对于已经用醛类预先固定保存的病理标本作回顾性研究，或远离电镜实验室，不便用OsO4直接固定-连续制样而不得不用醛类预固定的标本，其效果不太理想。此外，该法需多步使用昂贵的锇酸，制样成本较高。为克服上述缺点，笔者对常规DMSO程序中的软化步骤加以改良，并对其结果做初步观察分析。
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1 材料与方法
成年健康小鼠、金黄地鼠按常规取材、2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定；组织块移入经液氮预冷的冷冻割断台(日本，Eiko TF-1)上使成冻珠，用预冷的螺丝刀对准组织块中段将冻珠敲裂成二块；取出组织块复温解冻；入PBS清洗3遍，每遍10 min；1%OsO4后固定，4℃，1.0 h；PBS清洗同前；移入含0.001 mol/L甘氨酰替甘氨酸(glycylglycine，G-G，中科院上海生化所出品)的0.31 mol/L PB中，于室温浸泡24～30 h；清洗后入 2% 单宁酸浸泡>2 h，双蒸水洗，常规脱水，CO2临界点干燥(日本，Hitachi，HCP-2)；离子溅射镀膜(日本，Eiko，IB-3)；日立S-520或S-450 扫描电镜观察。
2 结 果
经上述方法制备的样品在扫描电镜下观察，可见组织块割断面粗糙不平，组织或细胞内部结构暴露明显，立体感强，清晰度好。以下从组织内部固有表面结构和细胞割断面内部结构两方面加以描述。
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2.1 组织内部固有表面结构
经冷冻割断后，组织块内部某些中空性结构如肺泡腔、肾小囊、血管腔等被割裂开而暴露出固有的内表面(图1～4)。对肾小体的断裂面观察，可见足细胞突起包裹于毛细血管外形成的裂孔膜立体图像，足细胞胞体和各级突起均十分清晰，断裂的毛细血管内皮细胞腔面布满窗孔，横断面上有足细胞突起附着形成的城垛状外观(图1)。肺断裂开后可见导气部和呼吸部各种表面结构均保持完好。肺泡Ⅰ型上皮腔面较平坦光滑；Ⅱ型上皮呈球状突出于腔面，其上布满微绒毛，细胞周边部较密集，中央部较稀疏并可见若干大小不等的凹孔，似为Ⅱ型细胞分泌表面活性物质后形成的分泌孔(图2)。肝细胞游离面，肝血窦内皮被揭去，部分肝细胞也被割断。肝细胞游离面有许多短小微绒毛，略呈零乱状，许多微绒毛末端膨大呈小球状，似为胞吐过程(图3)。
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图1 金黄地鼠肾小球割断面. PL:肾小囊壁层; PO:足细胞; PP:初级突起; SP:次级突起; TP:三级突起; Cap:毛细血管; ↑:内皮窗孔. 图2 小鼠肺泡割断面. CⅠ:肺泡Ⅰ型上皮; CⅡ:肺泡Ⅱ型上皮. 图3 小鼠肝细胞血窦面和割断面. N:细胞核. 图4 图3局部放大. Mi:线粒体; NPI:核染色质; RER:粗面内质网; *:核内膜,核外膜; ↑:丝状结构.
2.2 细胞割断面内部结构
经冷冻割断-甘氨酰替甘氨酸(G-G)浸泡处理后的组织，电镜下见细胞割断面呈不同程度的浮雕图像。大多数割断面于G-G浸泡24 h以后，胞质内可溶性成分被浸软并洗脱，使细胞器得到充分的立体显露而结构仍然保持良好。被割断的肺Ⅱ型上皮细胞(CⅡ)，胞质内除可见细胞核、粗面内质网等细胞器外，细胞近游离部存在许多大小不等的圆或椭圆形泡状结构，泡腔内无内容物(图2)。个别空泡状结构与细胞表面凹孔相通。胞质内未见板层小体。从分布和形态上判断，这些空泡状结构可能就是丢失了内容物的板层小体。在肝细胞血窦面的割断面，断面凹凸不平，细胞器十分丰富，粗面内质网(RER)尤为发达，多呈囊泡状(图3，4)。胞核的外、内膜均有局部割断，从而暴露出平坦光滑的内膜和粗糙的核质。核外膜与粗面内质网上附着大量的核糖体。胞质内散布着大量的细丝状结构，在细胞核与各种细胞器之间交织成网络状。有些丝状结构交织成网覆盖于核外膜上，另一些则在核与RER之间或RER囊泡之间形成走行方向不一的连接(图4)。
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3 讨 论
用扫描电镜对组织和细胞内部超微结构进行立体观察时，对制样方法最重要的要求就是使组织细胞内部结构既保持完好又得到充分的显露。故一个好的实验程序应能满足以下条件：(1)使组织能尽量沿其内部固有界面裂开而不是直线切开；(2)组织和细胞内部的固有结构得到良好保存；(3)使内部可溶性成分溶解洗脱。目前已成为常规应用的二甲基亚砜(DMSO)法，采用具有冷冻保护作用的水溶性介质DMSO包埋组织并能避免冷冻时产生冰晶损伤结构。割断后用低浓度OsO4较长期浸泡，使膜系结构为主的细胞器得以保持固定而可溶性胞质则逐步溶解洗脱，从而较充分暴露出内部结构的立体形态，最终获得较理想的图像。因此该方法比其他割断法受到更好的推广应用。但由于存在前言中所述的某些缺点，该技术仍有改良的必要。
本研究移植了Pinto da Silva等[4]在冷冻蚀刻研究中的方法，采用了G-G溶液代替常规的低浓度锇酸液浸泡作细胞基质软化，其显示组织内部固有表面结构的图像(图1，2)，可以与DMSO法之图像[3]相媲美；对细胞割断面内部结构的保存基本完好。对细胞内部超微结构观察，可见各种细胞器均得到良好保存且立体显露良好，层次分明。其图像效果接近DMSO法。略有不同的是：(1)肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层小体的内容物丢失，其原因可能是样品割断前未经OsO4固定，因此小体内的脂类内容物呈流体状态，导致在割断后的清洗步骤中从割断面流失；(2)对肝细胞的观察发现，细胞内丝状结构很丰富并形成立体网络。这种情况在常规DMSO法制样时较难见到。在DMSO法中，组织只经过OsO4固定，割断后又经长期浸泡软化，微管、微丝等纤细的蛋白质性结构未能得到良好保护。而在本方法中，组织预先经醛类处理，蛋白质性结构得到良好固定，故细胞骨架保存较好，这是其优点所在。
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在割断的细胞剖面上能同时良好地显示膜系结构和细胞骨架，这对研究十分有利。本实验发现丝状结构交织成网覆盖于细胞核外膜上；而核膜与内质网之间和内质网囊泡之间也有复杂的丝状结构联系。这种现象提示，包括核在内的膜系细胞器的形态维持及其在细胞内的空间定位可能与细胞骨架有密切关系。宋今丹[5]报告，当微管被药物或低温解聚后，内质网膜系统在细胞内的分布状态发生改变，提示了内质网与微管之间的依存关系。本研究直接观察到在内质网囊泡之间具有细丝相连，其化学性质尚不清楚，但为进一步研究提供了基础。
DMSO法制样时，通常对新鲜组织直接进行OsO4固定而避免使用醛类固定剂。其原因在于DMSO的程序中，基质软化步骤是采用0.1%OsO4浸泡，使经过OsO4固定过的膜系结构保持完好而含蛋白质的基质在浸泡中被软化洗脱，从而使膜系结构得到充分暴露，呈现较强的浮雕感。若组织经醛类预先固定，则较难溶去基质而使膜系结构不能充分显露。Pinto da Silva等用G-G来浸泡割断后的组织并进行劈裂后标记-复型[3]。笔者将这一方法移植于本研究，细胞内结构暴露良好，说明G-G具有软化基质作用，其原理可能与G-G能中止和对抗醛类的固定作用有关。
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由于本方法减少了OsO4的使用次数，因此显著降低成本，具有很好的实用性，尤其是本方法比较有利于观察细胞内丝状结构，具有独特优点，值得进一步研究和推广应用。然而，本研究发现，经此方法制样，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层小体的内容物丢失，提示其对可溶性脂质的保存不利，需要在应用中进一步改进或在选用中加以考虑。
参考文献
[1]田中敬一, 永谷隆(编)，李文镇(译). 图解扫描电子显微镜-生物样品制备. 北京:科学出版社, 1984:60
[2]应国华(主编). 医学生物学电镜技术与细胞超微结构. 香港:香港现代出版社, 1993:59～72
[3]王仲涛(主编).组织和细胞扫描电镜图谱. 北京:人民卫生出版社, 1986
[4]Pinto da Silva P,Kan FWK. Label-fracture,a method for high resolution labeling of cell surface. J Cell Biol, 1984;99:1156
[5]宋今丹.整装培养细胞的内质网膜系统研究. 电子显微学报, 1991;10:355
(收稿：1998-09-08 修回：1998-11-05), http://www.100md.com
单位：江一平 福建医科大学组织胚胎学教研室(福州 350004); 赵玉珍 李向印 雷建章 河北医科大学电镜中心(石家庄 050017)
关键词：显微镜检查，电子，扫描；冷冻割断；甘氨酰替甘氨酸；膜系结构；细胞骨架
福建医科大学学报990102 目的 运用甘氨酰替甘氨酸浸泡法对常规的DMSO法冷冻-割断扫描电镜制样技术加以改良。 方法 经过多聚甲醛-戊二醛预固定的组织冷冻割断，1%OsO4后固定，用甘氨酰替甘氨酸溶液代替常规的低浓度锇酸液浸泡作细胞基质软化。后续步骤按常规方法，扫描电镜观察。 结果 细胞内部膜系和丝状结构的超微形态保持完好，暴露明显，图像清晰，立体感强。各种膜系结构之间可见三维的丝状网络联系。 结论 醛类预固定-甘氨酰替甘氨酸浸泡法对细胞骨架的保存和显示较好，对膜系结构与细胞骨架间相互关系的研究可能有独到优势。
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Observation on the Ultrastructure of Cell Freeze-fractured and Rinsed in Glycylglycine with Scanning Electron Microscopy
Jiang Yiping1, Zhao Yuzhen2, Li Xiangyin2,et al
(1.Department of Histology ＆ Embryology， Fujian Medical University，Fuzhou， 350004
2.Center of Electron Microscopy， Hebei Medical University， Shijiazhuang， 050017)
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Objective To modified the conventional DMSO procedure of freeze-fracture for scanning electron microscopy(SEM) using glycylglycine(G-G) method which was developed by Pinto da Silva(1981). Methods Glutaraldehyde-polyformaldehyde fixed tissue block was frozen in liquid nitrogen and fractured. After thawed in PBS，the fractured blocks were postfixed with 1% OsO4 and rinsed in glycylglycine(G-G) for up to 24 h. Dehydrate and the succeeded steps were the same with ordinary method. Results The observation with SEM showed that both the membrane system (including cell surface) and the filament structure of the fractured cells were well preserved and excellent exposed. The picture attained with SEM was clear and steric. The three-dimensional filament network in cell plasma and its co-relation with nuclear， mitochondria and RER was viewed. Conclusion It might be more advantageous to the study on the relationship between membrane system and cytoskeleton using this modified method.
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Key words microscopy，electron，scanning； freeze-fracture； glycylglycine； membrane system； cytoskeleton
扫描电子显微镜技术(SEM)是对细胞表面超微结构进行三维观察的优异手段。但在观察细胞内部结构时，需采用特殊方法割断组织块，以暴露内部结构。目前已建立了多种割断法[1,2]，其中DMSO法和ODO法以结构保存和暴露良好、方法稳定通用而被公认为迄今最理想的技术，得到国内外普遍推广应用[1～3]，成为常规制样技术。然而，该法通常要求对新鲜组织直接锇酸固定，若经醛类预先固定则往往软化效果不好，导致断裂面立体感不强，对于已经用醛类预先固定保存的病理标本作回顾性研究，或远离电镜实验室，不便用OsO4直接固定-连续制样而不得不用醛类预固定的标本，其效果不太理想。此外，该法需多步使用昂贵的锇酸，制样成本较高。为克服上述缺点，笔者对常规DMSO程序中的软化步骤加以改良，并对其结果做初步观察分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
成年健康小鼠、金黄地鼠按常规取材、2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定；组织块移入经液氮预冷的冷冻割断台(日本，Eiko TF-1)上使成冻珠，用预冷的螺丝刀对准组织块中段将冻珠敲裂成二块；取出组织块复温解冻；入PBS清洗3遍，每遍10 min；1%OsO4后固定，4℃，1.0 h；PBS清洗同前；移入含0.001 mol/L甘氨酰替甘氨酸(glycylglycine，G-G，中科院上海生化所出品)的0.31 mol/L PB中，于室温浸泡24～30 h；清洗后入 2% 单宁酸浸泡>2 h，双蒸水洗，常规脱水，CO2临界点干燥(日本，Hitachi，HCP-2)；离子溅射镀膜(日本，Eiko，IB-3)；日立S-520或S-450 扫描电镜观察。
2 结 果
经上述方法制备的样品在扫描电镜下观察，可见组织块割断面粗糙不平，组织或细胞内部结构暴露明显，立体感强，清晰度好。以下从组织内部固有表面结构和细胞割断面内部结构两方面加以描述。
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2.1 组织内部固有表面结构
经冷冻割断后，组织块内部某些中空性结构如肺泡腔、肾小囊、血管腔等被割裂开而暴露出固有的内表面(图1～4)。对肾小体的断裂面观察，可见足细胞突起包裹于毛细血管外形成的裂孔膜立体图像，足细胞胞体和各级突起均十分清晰，断裂的毛细血管内皮细胞腔面布满窗孔，横断面上有足细胞突起附着形成的城垛状外观(图1)。肺断裂开后可见导气部和呼吸部各种表面结构均保持完好。肺泡Ⅰ型上皮腔面较平坦光滑；Ⅱ型上皮呈球状突出于腔面，其上布满微绒毛，细胞周边部较密集，中央部较稀疏并可见若干大小不等的凹孔，似为Ⅱ型细胞分泌表面活性物质后形成的分泌孔(图2)。肝细胞游离面，肝血窦内皮被揭去，部分肝细胞也被割断。肝细胞游离面有许多短小微绒毛，略呈零乱状，许多微绒毛末端膨大呈小球状，似为胞吐过程(图3)。
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图1 金黄地鼠肾小球割断面. PL:肾小囊壁层; PO:足细胞; PP:初级突起; SP:次级突起; TP:三级突起; Cap:毛细血管; ↑:内皮窗孔. 图2 小鼠肺泡割断面. CⅠ:肺泡Ⅰ型上皮; CⅡ:肺泡Ⅱ型上皮. 图3 小鼠肝细胞血窦面和割断面. N:细胞核. 图4 图3局部放大. Mi:线粒体; NPI:核染色质; RER:粗面内质网; *:核内膜,核外膜; ↑:丝状结构.
2.2 细胞割断面内部结构
经冷冻割断-甘氨酰替甘氨酸(G-G)浸泡处理后的组织，电镜下见细胞割断面呈不同程度的浮雕图像。大多数割断面于G-G浸泡24 h以后，胞质内可溶性成分被浸软并洗脱，使细胞器得到充分的立体显露而结构仍然保持良好。被割断的肺Ⅱ型上皮细胞(CⅡ)，胞质内除可见细胞核、粗面内质网等细胞器外，细胞近游离部存在许多大小不等的圆或椭圆形泡状结构，泡腔内无内容物(图2)。个别空泡状结构与细胞表面凹孔相通。胞质内未见板层小体。从分布和形态上判断，这些空泡状结构可能就是丢失了内容物的板层小体。在肝细胞血窦面的割断面，断面凹凸不平，细胞器十分丰富，粗面内质网(RER)尤为发达，多呈囊泡状(图3，4)。胞核的外、内膜均有局部割断，从而暴露出平坦光滑的内膜和粗糙的核质。核外膜与粗面内质网上附着大量的核糖体。胞质内散布着大量的细丝状结构，在细胞核与各种细胞器之间交织成网络状。有些丝状结构交织成网覆盖于核外膜上，另一些则在核与RER之间或RER囊泡之间形成走行方向不一的连接(图4)。
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3 讨 论
用扫描电镜对组织和细胞内部超微结构进行立体观察时，对制样方法最重要的要求就是使组织细胞内部结构既保持完好又得到充分的显露。故一个好的实验程序应能满足以下条件：(1)使组织能尽量沿其内部固有界面裂开而不是直线切开；(2)组织和细胞内部的固有结构得到良好保存；(3)使内部可溶性成分溶解洗脱。目前已成为常规应用的二甲基亚砜(DMSO)法，采用具有冷冻保护作用的水溶性介质DMSO包埋组织并能避免冷冻时产生冰晶损伤结构。割断后用低浓度OsO4较长期浸泡，使膜系结构为主的细胞器得以保持固定而可溶性胞质则逐步溶解洗脱，从而较充分暴露出内部结构的立体形态，最终获得较理想的图像。因此该方法比其他割断法受到更好的推广应用。但由于存在前言中所述的某些缺点，该技术仍有改良的必要。
本研究移植了Pinto da Silva等[4]在冷冻蚀刻研究中的方法，采用了G-G溶液代替常规的低浓度锇酸液浸泡作细胞基质软化，其显示组织内部固有表面结构的图像(图1，2)，可以与DMSO法之图像[3]相媲美；对细胞割断面内部结构的保存基本完好。对细胞内部超微结构观察，可见各种细胞器均得到良好保存且立体显露良好，层次分明。其图像效果接近DMSO法。略有不同的是：(1)肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层小体的内容物丢失，其原因可能是样品割断前未经OsO4固定，因此小体内的脂类内容物呈流体状态，导致在割断后的清洗步骤中从割断面流失；(2)对肝细胞的观察发现，细胞内丝状结构很丰富并形成立体网络。这种情况在常规DMSO法制样时较难见到。在DMSO法中，组织只经过OsO4固定，割断后又经长期浸泡软化，微管、微丝等纤细的蛋白质性结构未能得到良好保护。而在本方法中，组织预先经醛类处理，蛋白质性结构得到良好固定，故细胞骨架保存较好，这是其优点所在。
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在割断的细胞剖面上能同时良好地显示膜系结构和细胞骨架，这对研究十分有利。本实验发现丝状结构交织成网覆盖于细胞核外膜上；而核膜与内质网之间和内质网囊泡之间也有复杂的丝状结构联系。这种现象提示，包括核在内的膜系细胞器的形态维持及其在细胞内的空间定位可能与细胞骨架有密切关系。宋今丹[5]报告，当微管被药物或低温解聚后，内质网膜系统在细胞内的分布状态发生改变，提示了内质网与微管之间的依存关系。本研究直接观察到在内质网囊泡之间具有细丝相连，其化学性质尚不清楚，但为进一步研究提供了基础。
DMSO法制样时，通常对新鲜组织直接进行OsO4固定而避免使用醛类固定剂。其原因在于DMSO的程序中，基质软化步骤是采用0.1%OsO4浸泡，使经过OsO4固定过的膜系结构保持完好而含蛋白质的基质在浸泡中被软化洗脱，从而使膜系结构得到充分暴露，呈现较强的浮雕感。若组织经醛类预先固定，则较难溶去基质而使膜系结构不能充分显露。Pinto da Silva等用G-G来浸泡割断后的组织并进行劈裂后标记-复型[3]。笔者将这一方法移植于本研究，细胞内结构暴露良好，说明G-G具有软化基质作用，其原理可能与G-G能中止和对抗醛类的固定作用有关。
, http://www.100md.com
由于本方法减少了OsO4的使用次数，因此显著降低成本，具有很好的实用性，尤其是本方法比较有利于观察细胞内丝状结构，具有独特优点，值得进一步研究和推广应用。然而，本研究发现，经此方法制样，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层小体的内容物丢失，提示其对可溶性脂质的保存不利，需要在应用中进一步改进或在选用中加以考虑。
参考文献
[1]田中敬一, 永谷隆(编)，李文镇(译). 图解扫描电子显微镜-生物样品制备. 北京:科学出版社, 1984:60
[2]应国华(主编). 医学生物学电镜技术与细胞超微结构. 香港:香港现代出版社, 1993:59～72
[3]王仲涛(主编).组织和细胞扫描电镜图谱. 北京:人民卫生出版社, 1986
[4]Pinto da Silva P,Kan FWK. Label-fracture,a method for high resolution labeling of cell surface. J Cell Biol, 1984;99:1156
[5]宋今丹.整装培养细胞的内质网膜系统研究. 电子显微学报, 1991;10:355
(收稿：1998-09-08 修回：1998-11-05), http://www.100md.com