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编号:10222752
HCV 5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达
http://www.100md.com 《中华微生物学和免疫学杂志》 1999年第1期
     作者:王小红 王升启 李梦东 朱宝珍

    单位:王小红 李梦东(400038 重庆,第三军医大学西南医院全军传染病中心);王升启(联系人,北京,100850);朱宝珍 (军事医学科学院放射医学研究所)

    关键词:肝炎病毒;丙型;荧光素酶;pHCV-luc09;HepG2肝癌细胞

    中华微生物学和免疫学杂志990105 【 摘要 】 目的 构建HCV 5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒,并在HepG2细胞中表达。 方法 通过PCR扩增,获得中国人HCV基因组5'非编码区(noncoding region, NCR)完整序列与C区部分序列的目的基因片段(5'NCR-C片段)。将此片段插入pGL3荧光素酶报告载体的荧光素酶基因起始密码上游,构建受5'NCR 片段调控的荧光素酶表达质粒。应用脂质体介导基因转染技术将8个质粒转染HepG2肝癌细胞。 结果 经鉴定获得8个均为正向插入的阳性克隆。序列分析结果表明插入片段与中国人HCV(Ⅱ型)序列基本一致,其荧光素酶基因起始密码子已去除且未改变编码框。有一个质粒能够表达荧光素酶活性,其绝对值达1141.9±151.1 mV,是pGL3报告载体荧光素酶活性的20%。 结论 当质粒1μg、Lipofectin 6μl,Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育4小时时可获得最佳转染效果。
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    Construction of the plasmid expressing luciferase controlled by HCV 5' NCR region and its expression in HepG2 cell WANG Xiaohong*, WANG Shengqi, LI Mengdong, et al. *Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038

    【 Abstract 】 Objective To establish an in vitro screening system for testing effects of antisense drugs targeting at 5'NCR-C of HCV genome. Methods In order to construct the plasmid expressing HCV-luciferase fusion RNA, the target gene fragment(5'NCR-C) composed of intact 5'NCR and partial C region of Chinese HCV genome was obtained with PCR amplification and was inserted into pGL3 luciferase reporter vector in which the start codon of luciferase gene had been deleted. The structure and function of constructed plasmid were confirmed by PCR, DNA sequencing and liposome-mediated transient expression in HepG2 cells. Results DNA sequencing showed that the inserted sequence of the constructed plasmid was the same as that of Chinese HCV genome, the start codon of luciferase gene was deleted and the reading frame of luciferase gene was not changed. The HepG2 cells transfected with constructed plasmid could express luciferase activity which was up to (1141.9±151.1)MV and reached 20% of the luciferase activity of pGL3 reporter vector. The best transfection efficiency was obtained with the plasmid 1μg, Lipofectin 6μl and 4 hours incubation of Lipofectin-plasmid complexes with cells. Conclusions The results showed that the author successfully constructed the plasmid expressing luciferase gene controlled by HCV 5'NCR and established an in vitro testing system for screening HCV-RNA 5'NCR and C gene specific nucleic acid drugs.
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    【 Subject words 】 Hepatitis C Virus Luciferase pHCV-luc09 HepG2 cells

    丙型肝炎病毒(HCV),是输血后肝炎的主要致病因子。HCV感染后,60%的感染者发展为慢性肝病,其中20%在10年内发展为肝硬化。HCV感染还与肝细胞癌的发生密切相关,目前α-干扰素是最常用的抗HCV药物,但有效率仅为(10~25)%。由于缺乏合适的HCV感染小动物模型及细胞模型,从而限制了抗HCV药物的评价。随着分子生物学技术及反义核酸技术的发展,从基因水平探索特异性抗HCV药物已成为可能。国外已有HCV全长序列或部分序列体外转染培养细胞建立药物评价系统的研究报道〔1-4〕,但定量困难。国内尚未见这方面的资料。本研究旨在构建HCV 5'NCR调控荧光素酶表达的质粒,建立一种针对HCV基因的特异性反义药物体外定量评价系统,为反义核酸药物抗HCV研究创造条件。

    材料与方法
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    1.HCV-RNA 5'NCR-C区片段制备(图1)

    图1 HCV 5'NCR调控荧光素酶表达质粒的构建

    Fig 1. Construction of plasmid expressing luciferase controlled by HCV 5'NCR

    (1) 模板:pHCV376(军事医学科学院王升启博士构建),含有HCV RNA 5'NCR及C区部分序列(第25~400nt)。

    (2) 引物设计与合成:根据中国人HCV基因组〔5〕(Ⅱ型)序列,设计合成一对引物,上游引物H1(5'GCATCAAGCTTGCCAGCCCCCGATTGGGG
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    GCGACACTCCACCATGAATCA 3',50个nt)含有HindⅢ酶切位点及HCV基因组1~39位核苷酸(nt),下游引物H2(5'AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCG

    GCGGTTG3,49个nt)位于HCV 基因组第419~386位核苷酸,引物采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。

    (3) PCR扩增:反应体系20μl,含10×PCR缓冲液2μl(Promega公司产品),dNTPs 0.2mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L,引物H1及H2各0.1μg,pHCV376 0.1μl,Taq酶0.5U(Promega公司产品),石蜡油20μl。PCR反应条件为94℃变性30秒;72℃延伸40秒;60℃退火10秒;循环35次后72℃延伸10分钟。扩增产物采用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离,并用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化。纯化产物用Klenow大片段(华美生物工程公司)处理后进行纯化及 HindⅢ酶切。
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    2. 质粒构建: 如图1所示,将pGL3载体采用NcoI(Promega)酶切,绿豆核酸酶(华美生物工程公司)削平,再用HindⅢ酶切。每次酶切后均用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提及乙醇沉淀。最后用0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化,去除切割下的小片段。载体与5NCR-C片段的连接及转化参照《分子克隆》,插入片段与载体的摩尔比为 6∶1,感受态细胞为Promega公司产品。

    3. 克隆鉴定

    (1) PCR鉴定:在pGL3 control vector上5'NCR-C插入片段两侧各合成1条引物,上游引物G1序列为5'AGAAGTAGTGAGGAGGCTT T3'(20nt),下游引物G2序列为5'AGAATGGCGCCGGGCCTTTC3' (20nt) ,用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。采用不同的引物组合进行菌体PCR扩增鉴定。载体引物G1-G2组合,鉴定是否为阳性克隆。载体5'端引物G1与插入片段3'端引物H2组合及载体3'端引物G2与插入片段3'端引物H2组合,鉴定插入片段的方向。
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    (2)序列分析:采用Promega公司Wizard minipreps DNA purification system及fmol DNA sequencing system 按说明书操作进行质粒提取和序列分析。

    4. 质粒在HepG2细胞中的表达

    (1) 细胞培养:HepG2肝癌细胞由军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛研究员惠赠。采用DMEM培养基(含10%小牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml),在37℃,5% CO2条件下进行培养及传代。

    (2) 质粒转染:HepG2肝癌细胞接种于24孔板(Costar),0.5×105/孔,(70~80)%细胞融合后,采用脂质体Lipofectin(1mg/ml,Life Technologies公司产品)试剂盒进行转染并按说明书操作。每次实验均做双孔。
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    (3) 荧光素酶活性检测:采用荧光素酶测定试剂盒(Luciferase assay system,Promega)及推荐的操作步骤进行。化学发光仪为 LKB公司的 Wallac 1250 Luminometer,输出值为毫伏(mV)。

    (4) 转染条件的优化:取不同剂量(2~10μl)的Lipofectin及pHCV-luc09质粒1μg混合后与细胞一起孵育5小时进行转染,以确定Lipofectin的最佳浓度。取不同浓度pHCV-luc09质粒(0.25~4μg)及Lipofectin 6μl,混合后孵育5小时转染,以确定最佳质粒浓度。采用不同孵育时间(2~12小时)及pHCV-luc09质粒1μg和Lipofectin 6μl进行转染,以确定最佳孵育时间。

    结 果

    1.HCV RNA 5'NCR-C片段的特异性:根据设计的引物,PCR产物(5'NCR- C片段)的扩增长度为430bp,实际扩增片段经琼脂糖电泳分析与设计长度一致(图2),由此获得含有5'NCR 完整序列及C区5'端25个密码子的目的基因片段,其上游含有HindⅢ酶切位点。
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    图2 HCV 5'NCR-C片段的PCR扩增

    Fig 2. PCR amplification of HCV 5'NCR-C fragment

    A.DNA marker(pBR344/HinfⅠ)

    B.PCR product

    2. HCV RNA 5'NCR-C片段克隆的鉴定

    阳性克隆鉴定:转化菌落共35个;分别挑取少许菌体进行PCR扩增;阳性克隆的限制扩增片段长度为509bp;结果显示,8个克隆扩增出与设计长度一致的阳性条带即509bp条带(图3)。

    图3 阳性克隆的PCR鉴定
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    Fig 3. Identification of positive clones by PCR

    M.DNA marker(pBR344/HinfⅠ)

    克隆方向鉴定:采用引物G1与H2,G2与H2组合对8个阳性克隆进行菌体PCR扩增。G1与H2组合的扩增片段长度为469bp,出现阳性条带为正向插入,阴性结果为反向插入;G2与H2组合的扩增片段长度为464bp,出现阳性条带为反向插入,阴性结果为正向插入。实际结果表明,8个阳性克隆均为正向插入,这与所设计的定向克隆相一致。

    序列分析鉴定:分别提取两个质粒(pHCV-luc09)及(pHCV-luc13)进行序列分析。结果表明,pHCV-luc09的插入片段5'NCR-C序列与中国人HCV序列一致,但其3'端缺失了15个核苷酸,5'NCR-C片段第419位核苷酸C取代了A,两端与载体连接处序列与所设计的相一致,即荧光素酶基因的起始密码子被去除。而pHCV-luc13的插入片段5'NCR-C 3'端缺失20个核苷酸。
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    质粒在HepG2细胞中的表达: 8个阳性克隆提取的质粒分别转染HepG2肝癌细胞,通过化学发光的方法检测荧光素酶活性的表达。结果表明,8个质粒中仅有一个质粒能够表达荧光素酶活性,称为pHCV-luc09,其绝对值达1141.9(151.1mV(细胞对照为0.11±0.02mV)(图4),是pGL3报告载体荧光素酶活性的20%,其余7个质粒基本上不表达荧光素酶活性。当质粒用量为1μg,Lipofectin用量为6μl,Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育4小时时,pHCV-luc09在HepG2细胞中可获得最佳转染效果,此时酶活性测定值最高可达1126.8mV。

    图4 pHCV-luc09与pGL3荧光素酶在HepG2细胞中的表达

    Fig 4. Luciferase expression of pHCV-luc09 and pGL3 in HepG2 cells
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    1.HepG2 cells(0.11±0.12)

    2.pHCV-luc09(1 141.9±151.1)

    3.pGL3(5 716.0±435.1)

    讨 论

    HCV基因组为一单链正股RNA,长约9.4kb,核苷酸序列已确定,基因构成为5'NCR-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-NCR3。不同分离株的核苷酸序列分析表明,HCV基因组具有高度变异的特征;不同国家,不同地区HCV基因组存在明显的异质性;根据同源性差异大小,HCV基因组至少分为6型〔6〕 。研究表明,在HCV基因组中,5'NCR是最保守的区域,由319~341个核苷酸组成,形成稳定的二级结构,含有帽非依赖性mRNA翻译所必需的内在核糖体结合位点(IRES)。HCV RNA的5'NCR对HCV RNA的复制与翻译可能具有重要的调控作用〔7〕
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    本实验获得的质粒pHCV-luc09经序列分析证实,插入的5'NCR-C片段与中国人HCV序列一致,尽管5'NCR-C片段3'端缺失了15个核苷酸且有一个核苷酸突变,由于缺失的核苷酸数目是3的倍数,突变的核苷酸位于密码子的第三位,因此5'NCR-C片段与荧光素酶基因融合且未改变荧光素酶基因的编码框;而质粒pHCV-luc13序列分析表明,其5'NCR-C插入片段3'端缺失了20个核苷酸,由此可知,pHCV-luc13不能表达荧光素酶活性是其荧光素酶基因编码框发生了变化。结果也提示在这个质粒构建过程中,严格控制Klenow大片段的反应条件很重要。

    pHCV-luc09在HepG2细胞中的表达水平不及pGL3高,这可能由于外源基因片段的插入及pHCV-luc09荧光素酶活性表达依赖于插入片段的起始密码子所致。pHCV-luc09在HepG2细胞中较高的荧光素酶表达水平对药物的抑制活性评价是必要的,表达水平越高越能反映药物的活性抑制强度。基因在细胞内表达水平往往与基因表达载体、细胞及特定的转染试剂以及基因转染的效率等有关。脂质体浓度、质粒用量及Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育时间是转染效率的重要因素,故对上述条件进行了优化。在最佳的转染条件下,pHCV-luc09荧光素酶活性测定值最高可达1 126.8mV。
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    本课题受国家“863”、国家自然科学基金及总后卫生部“9.5”重点课题基金资助

    参考文献

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    (收稿:1997-09-26 修回:1998-02-24), http://www.100md.com