大肠癌组织中PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白的表达及其意义
作者：彭绍华 杨剑锋 谢平平
单位：湖南医学高等专科学校(长沙 410006)
关键词：结肠肿瘤；癌；蛋白质P53；抗原类，肿瘤
湖南医学990106 Bcl-2基因是一个阻遏细胞凋亡基因，其编码的Bcl-2蛋白能阻止细胞凋亡，该蛋白的异常表达与恶性肿瘤发生发展及预后有密切关系[1，2]。P53为肿瘤抑制基因，该基因突变和其编码的P53蛋白过度表达与恶性肿瘤的生物学行为和预后有较密切的关系[3，4]。增殖细胞核抗原(PCNA)可反映细胞增殖活性，已证实PCNA定量高的恶性肿瘤恶性程度高和预后差[5，6]。本文应用ABC免疫化方法研究大肠癌组织中PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达，以探讨其生物学意义及其相互关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 标本 收集根治术大肠癌标本50例，结、直肠癌各25例；男性28例，女性22例，平均年龄47.5±6.9(25～70)岁。病理组织学类型包括高分化腺癌30例，低分化腺癌12例和未分化癌8例。50例大肠癌中已发生淋巴结转移者20例(40%)；临床上Dukes分期：A期10例，B期20例，C期20例。上述标本均常规石蜡连续切片，厚4μm。
1.1.2 主要试剂 鼠抗人PCNA、突变型P53和Bcl-2蛋白单克隆抗体均购自Dako公司，工作浓度分别为1∶30，1∶100和1∶100；生物素标记羊抗鼠IgG和ABC试剂购自Sigma公司；DAB为瑞士进口分装。
1.2 方法
①PCNA、P53蛋白，Bcl-2蛋白免疫组化染色：按常规ABC免疫组化法。②对照组：用0.01M PBS(pH 7.4)分别替代一抗(PCNA、Bcl-2蛋白和P53蛋白)作为每次染色的阴性对照；以正常胰腺导管上皮作为Bcl-2蛋白阳性对照；以替代对照有效的P53蛋白阳性表达胰腺癌作为P53蛋白的阳性对照。
, 百拇医药
1.3 结果评估
PCNA阳性细胞定量按Garcia评分法[5]评分为1分(≤25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)；Bcl-2蛋白阳性判断参照Joensun[2]标准，以切片中阳性细胞率≥10%为阳性病例，<10%为阴性；P53蛋白阳性病例判断按Pilotti标准[1]，切片中阳性细胞率≥1%为阳性病例，<1%为阴性。统计学处理采用t检验或χ2检验。
2 结果
2.1 PCNA和Bcl-2，P53蛋白在癌组织中分布特征
PCNA定位于胞核，Bcl-2蛋白定位于胞浆，P53蛋白定位于胞核，偶见胞浆着色。PCNA和Bcl-2，P53蛋白阳性细胞在同一切片不同区域的分布常不一致。50例大肠癌PCNA定量为2.20±1.07，Bcl-2蛋白阳性病例32例(64%)，P53蛋白阳性病例24例(48%)。
, 百拇医药
2.2 PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达与大肠癌组织学特征的关系
高分化腺癌病例PCNA评分低于未分化癌病例(t=6.9437，P<0.01)；P53蛋白阳性表达率分别低于低分化腺癌(χ2=4.7831，P<0.05)和未分化癌病例(P<0.01，四格表直接概率法)，两者比较差异均有显著性；但高分化腺癌病例Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于低分化腺癌病例(χ2=4.9267，P<0.05)和未分化癌病例(P<0.01，四格表直接概率法)，两者比较差异均有显著性。见表1。
表1 PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达与大肠癌组织学特征的关系 组织学特征
n
PCNA评分
Bcl-2
, 百拇医药
P53
(
±s)
+(%)
-
+(%)
-
高分化腺癌
30
1.83±0.92
25(83.3)
5
9(30)
, 百拇医药
21
低分化腺癌
12
2.33±1.07
6(50)
6
8(66.7)
4
未分化癌
8
3.77±0.75
1(12.5)
7
, 百拇医药
7(87.5)
1
2.3 PCNA评分和Bcl-2，P53蛋白表达与淋巴结转移和Dukes分期的关系
有淋巴结转移者的PCNA评分和P53蛋白阳性率均高于无淋巴结转移者(统计值分别t=4.5233，χ2=3.8595，均P<0.05)；Dukes C期大肠癌PNCA评分和P53蛋白阳性率均高于Dukes A期大肠癌(统计值分别为t=4.4810，P<0.01，P<0.05，直接概率法)，两者比较差异均有显著性；但Bcl-2蛋白表达与淋巴结转移和Dukes分期的关系与P53蛋白表达相反。见表2。
2.4 PCNA评分与Bcl-2，P53蛋白表达的关系
Bcl-2蛋白阳性病例PCNA评分低于阴性病例(t=2.1465，P<0.05)；而P53蛋白阳性病例PCNA评分高于阴性病例(t=3.1931，P<0.01)，见表3。表2 PCNA评分和Bcl-2，P53蛋白表达与淋巴转移Dukes分期的关系
, 百拇医药
类 别
n
PCNA评分
(
±s)
Bcl-2
P53
+(%)
-
+(%)
-
有转移
20
, 百拇医药
2.80±1.06
±10(50)
10
13(65)
7
无转移
30
1.80±0.88
22(73.3)
8
11(36.7)
19
Dukes分期
, http://www.100md.com
A
10
1.50±0.52
9(90)
1
2(20)
8
B
20
1.95±1.03
13(65)
7
9(45)
, 百拇医药
11
C
20
2.80±1.06
10(50)
10
13(65)
7
而且，发现18例Bcl-2蛋白阴性病例中有14例P53蛋白表达为阳性，32例Bcl-2蛋白阳性病例中仅10例P53蛋白表达阳性，两者存在密切负相关(P<0.005)。表3 PCNA评分与Bcl-2，P53蛋白表达的关系(±s) 蛋白表达
, 百拇医药
n
PCNA评分(±s)
Bcl-2阳性
32
2.00±0.98
Bcl-2阴性
18
2.56±1.15
P53阳性
24
2.58±1.02
, http://www.100md.com
P53阴性
26
1.85±1.04
3 讨论
应用应用PCNA单克隆抗体免疫组化研究细胞增殖状况，方法简单且阳性结果肯定，并且能对常规石蜡切片进行回顾性研究[5]。一些学者发现PCNA评分高的恶性肿瘤恶性程度和预后较差[5，6]。本文发现高分化腺癌组PCNA评分均数明显低于低分化腺癌组和未分化癌组，有淋巴结转移病例和Dukes分期C期病例PCNA评分明显高于无淋巴结转移病例和Dukes分期A或B期病例。提示PCNA评分高的大肠癌可能恶性度高和预后差，PCNA是反映大肠癌生物学行为和预后的重要标记物和预测因子。
Bcl-2蛋白能阻遏程序性细胞死亡(Programmed cell death即调亡)和延长细胞生命。Bcl-2蛋白在一些正常上皮细胞中表达，如皮肤、汗腺和胰腺导管上皮细胞等[7]。近年国外学者研究了Bcl-2蛋白在多种恶性肿瘤中表达，如乳腺癌[2]、恶性淋巴瘤[8]、甲状腺癌[1]等，发现Bcl-2蛋白主要作用于恶性肿瘤早期阶段，Bcl-2蛋白阳性表达的恶性肿瘤多恶性程度低和预后好[1，2，8]。本文发现高分化腺癌组Bcl-2蛋白阳性表达率高于低分化腺癌组和未分化癌组，且Bcl-2蛋白阳性表达者淋巴结转移率低和Dukes分期多为A期，其结果与上述文献报道较一致。
, http://www.100md.com
近年，国内、外学者较广泛地研究了突变型P53蛋白在多种恶性肿瘤中的表达及意义，发现一般良性病变和癌前病变不表达P53蛋白，有P53蛋白表达的恶性肿瘤多恶性度高和预后差[3，4]。本文发现高分化腺癌P53蛋白阳性表达率明显低于低分化腺癌组和未分化癌组，且P53蛋白阳性表达病例多伴淋巴结转移和多为Dukes分期C期，其结果与文献报道一致。提示P53蛋白可能是反映大肠癌生物学行为和预后的重要标记物。对大肠癌活检标本进行PCNA评分和Bcl-2及P53蛋白的检测对判断患者的预后和指导其治疗具有一定的意义。
Joensun等对乳腺癌的研究发现Bcl-2蛋白阳性表达与P53蛋白阳性表达、细胞增殖活性之间存在负相关[2]。Pilotti[1]等在甲状腺癌进行Bcl-2蛋白表达研究中也得出相似结论。本文发现Bcl-2蛋白阳性病例PCNA评分均数和P53蛋白阳性表达率明显低于Bcl-2蛋白阴性病例，且P53蛋白阳性病例PCNA评分均数明显高于P53蛋白阴性病例，与国外报道一致[1，2]。表明P53蛋白表达与细胞增殖有关，而Bcl-2蛋白以抑制细胞调亡而起作用但不刺激细胞增殖，其详细机理仍有待进一步探讨。 参考文献
, 百拇医药
[1] Pilotti S,Collini P,Rilke F,et al.Bcl-2 protein expression in carcinomas originating from the follicular epithelium of the thyroid gland.J Pathol,1994,172：337～342
[2] Joensuu H,Pylkanen L,Toikkqnen S.Bcl-2 protein expression and long-tern surviral in breast cancer.Am J Pathol,1994,145(5):1191～1198
[3] Isola J,Visakorpi T,Hkli k,et al.Association of over expression of tumor suppressor protein P53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patient.J Natl Cancer Inst,1992,84:1109～1114
, 百拇医药
[4] 蔡德巍，高长泽，王能进.C-myc基因和P53蛋白在肝细胞癌中的表达.中华病理学杂志，1994，23(2)：100～103
[5] Garcia RL,Coltrera MD,Gown AN.Analysis of proliferating grade using anti-PCNA/cyxlin monoclonal antibodies in fixed,embeded tissue:comparison with flow cytometric analysis.Am J Pathol,1989,134:733～739
[6] Hall PA.Levison DA,Woods AL,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) immunolocalization in paraffin sections:an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms.J Pathol,1990,162:285～294
, 百拇医药
[7] Lu QL,Pousson R,Wong L,et al.Bcl-2 expression in adult and embryonic non-hematopoietic tissues.J Pathol,1993,169:431～437
[8] Villuendas R,Riris MA,Orradre JL,et al.Different Bcl-2 protein expression in hight grade B-cell lymphomas derived from lymph node of mucosa-associated lymphoid tissue.Am J Pathol,1991,139:989～993
(19980624 收稿), 百拇医药
单位：湖南医学高等专科学校(长沙 410006)
关键词：结肠肿瘤；癌；蛋白质P53；抗原类，肿瘤
湖南医学990106 Bcl-2基因是一个阻遏细胞凋亡基因，其编码的Bcl-2蛋白能阻止细胞凋亡，该蛋白的异常表达与恶性肿瘤发生发展及预后有密切关系[1，2]。P53为肿瘤抑制基因，该基因突变和其编码的P53蛋白过度表达与恶性肿瘤的生物学行为和预后有较密切的关系[3，4]。增殖细胞核抗原(PCNA)可反映细胞增殖活性，已证实PCNA定量高的恶性肿瘤恶性程度高和预后差[5，6]。本文应用ABC免疫化方法研究大肠癌组织中PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达，以探讨其生物学意义及其相互关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
1.1.1 标本 收集根治术大肠癌标本50例，结、直肠癌各25例；男性28例，女性22例，平均年龄47.5±6.9(25～70)岁。病理组织学类型包括高分化腺癌30例，低分化腺癌12例和未分化癌8例。50例大肠癌中已发生淋巴结转移者20例(40%)；临床上Dukes分期：A期10例，B期20例，C期20例。上述标本均常规石蜡连续切片，厚4μm。
1.1.2 主要试剂 鼠抗人PCNA、突变型P53和Bcl-2蛋白单克隆抗体均购自Dako公司，工作浓度分别为1∶30，1∶100和1∶100；生物素标记羊抗鼠IgG和ABC试剂购自Sigma公司；DAB为瑞士进口分装。
1.2 方法
①PCNA、P53蛋白，Bcl-2蛋白免疫组化染色：按常规ABC免疫组化法。②对照组：用0.01M PBS(pH 7.4)分别替代一抗(PCNA、Bcl-2蛋白和P53蛋白)作为每次染色的阴性对照；以正常胰腺导管上皮作为Bcl-2蛋白阳性对照；以替代对照有效的P53蛋白阳性表达胰腺癌作为P53蛋白的阳性对照。
, 百拇医药
1.3 结果评估
PCNA阳性细胞定量按Garcia评分法[5]评分为1分(≤25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)；Bcl-2蛋白阳性判断参照Joensun[2]标准，以切片中阳性细胞率≥10%为阳性病例，<10%为阴性；P53蛋白阳性病例判断按Pilotti标准[1]，切片中阳性细胞率≥1%为阳性病例，<1%为阴性。统计学处理采用t检验或χ2检验。
2 结果
2.1 PCNA和Bcl-2，P53蛋白在癌组织中分布特征
PCNA定位于胞核，Bcl-2蛋白定位于胞浆，P53蛋白定位于胞核，偶见胞浆着色。PCNA和Bcl-2，P53蛋白阳性细胞在同一切片不同区域的分布常不一致。50例大肠癌PCNA定量为2.20±1.07，Bcl-2蛋白阳性病例32例(64%)，P53蛋白阳性病例24例(48%)。
, 百拇医药
2.2 PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达与大肠癌组织学特征的关系
高分化腺癌病例PCNA评分低于未分化癌病例(t=6.9437，P<0.01)；P53蛋白阳性表达率分别低于低分化腺癌(χ2=4.7831，P<0.05)和未分化癌病例(P<0.01，四格表直接概率法)，两者比较差异均有显著性；但高分化腺癌病例Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于低分化腺癌病例(χ2=4.9267，P<0.05)和未分化癌病例(P<0.01，四格表直接概率法)，两者比较差异均有显著性。见表1。
表1 PCNA定量和Bcl-2，P53蛋白表达与大肠癌组织学特征的关系 组织学特征
n
PCNA评分
Bcl-2
, 百拇医药
P53
(
±s)+(%)
-
+(%)
-
高分化腺癌
30
1.83±0.92
25(83.3)
5
9(30)
, 百拇医药
21
低分化腺癌
12
2.33±1.07
6(50)
6
8(66.7)
4
未分化癌
8
3.77±0.75
1(12.5)
7
, 百拇医药
7(87.5)
1
2.3 PCNA评分和Bcl-2，P53蛋白表达与淋巴结转移和Dukes分期的关系
有淋巴结转移者的PCNA评分和P53蛋白阳性率均高于无淋巴结转移者(统计值分别t=4.5233，χ2=3.8595，均P<0.05)；Dukes C期大肠癌PNCA评分和P53蛋白阳性率均高于Dukes A期大肠癌(统计值分别为t=4.4810，P<0.01，P<0.05，直接概率法)，两者比较差异均有显著性；但Bcl-2蛋白表达与淋巴结转移和Dukes分期的关系与P53蛋白表达相反。见表2。
2.4 PCNA评分与Bcl-2，P53蛋白表达的关系
Bcl-2蛋白阳性病例PCNA评分低于阴性病例(t=2.1465，P<0.05)；而P53蛋白阳性病例PCNA评分高于阴性病例(t=3.1931，P<0.01)，见表3。表2 PCNA评分和Bcl-2，P53蛋白表达与淋巴转移Dukes分期的关系
, 百拇医药
类 别
n
PCNA评分
(
±s)Bcl-2
P53
+(%)
-
+(%)
-
有转移
20
, 百拇医药
2.80±1.06
±10(50)
10
13(65)
7
无转移
30
1.80±0.88
22(73.3)
8
11(36.7)
19
Dukes分期
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A
10
1.50±0.52
9(90)
1
2(20)
8
B
20
1.95±1.03
13(65)
7
9(45)
, 百拇医药
11
C
20
2.80±1.06
10(50)
10
13(65)
7
而且，发现18例Bcl-2蛋白阴性病例中有14例P53蛋白表达为阳性，32例Bcl-2蛋白阳性病例中仅10例P53蛋白表达阳性，两者存在密切负相关(P<0.005)。表3 PCNA评分与Bcl-2，P53蛋白表达的关系(
±s) 蛋白表达, 百拇医药
n
PCNA评分(
±s)Bcl-2阳性
32
2.00±0.98
Bcl-2阴性
18
2.56±1.15
P53阳性
24
2.58±1.02
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P53阴性
26
1.85±1.04
3 讨论
应用应用PCNA单克隆抗体免疫组化研究细胞增殖状况，方法简单且阳性结果肯定，并且能对常规石蜡切片进行回顾性研究[5]。一些学者发现PCNA评分高的恶性肿瘤恶性程度和预后较差[5，6]。本文发现高分化腺癌组PCNA评分均数明显低于低分化腺癌组和未分化癌组，有淋巴结转移病例和Dukes分期C期病例PCNA评分明显高于无淋巴结转移病例和Dukes分期A或B期病例。提示PCNA评分高的大肠癌可能恶性度高和预后差，PCNA是反映大肠癌生物学行为和预后的重要标记物和预测因子。
Bcl-2蛋白能阻遏程序性细胞死亡(Programmed cell death即调亡)和延长细胞生命。Bcl-2蛋白在一些正常上皮细胞中表达，如皮肤、汗腺和胰腺导管上皮细胞等[7]。近年国外学者研究了Bcl-2蛋白在多种恶性肿瘤中表达，如乳腺癌[2]、恶性淋巴瘤[8]、甲状腺癌[1]等，发现Bcl-2蛋白主要作用于恶性肿瘤早期阶段，Bcl-2蛋白阳性表达的恶性肿瘤多恶性程度低和预后好[1，2，8]。本文发现高分化腺癌组Bcl-2蛋白阳性表达率高于低分化腺癌组和未分化癌组，且Bcl-2蛋白阳性表达者淋巴结转移率低和Dukes分期多为A期，其结果与上述文献报道较一致。
, http://www.100md.com
近年，国内、外学者较广泛地研究了突变型P53蛋白在多种恶性肿瘤中的表达及意义，发现一般良性病变和癌前病变不表达P53蛋白，有P53蛋白表达的恶性肿瘤多恶性度高和预后差[3，4]。本文发现高分化腺癌P53蛋白阳性表达率明显低于低分化腺癌组和未分化癌组，且P53蛋白阳性表达病例多伴淋巴结转移和多为Dukes分期C期，其结果与文献报道一致。提示P53蛋白可能是反映大肠癌生物学行为和预后的重要标记物。对大肠癌活检标本进行PCNA评分和Bcl-2及P53蛋白的检测对判断患者的预后和指导其治疗具有一定的意义。
Joensun等对乳腺癌的研究发现Bcl-2蛋白阳性表达与P53蛋白阳性表达、细胞增殖活性之间存在负相关[2]。Pilotti[1]等在甲状腺癌进行Bcl-2蛋白表达研究中也得出相似结论。本文发现Bcl-2蛋白阳性病例PCNA评分均数和P53蛋白阳性表达率明显低于Bcl-2蛋白阴性病例，且P53蛋白阳性病例PCNA评分均数明显高于P53蛋白阴性病例，与国外报道一致[1，2]。表明P53蛋白表达与细胞增殖有关，而Bcl-2蛋白以抑制细胞调亡而起作用但不刺激细胞增殖，其详细机理仍有待进一步探讨。 参考文献
, 百拇医药
[1] Pilotti S,Collini P,Rilke F,et al.Bcl-2 protein expression in carcinomas originating from the follicular epithelium of the thyroid gland.J Pathol,1994,172：337～342
[2] Joensuu H,Pylkanen L,Toikkqnen S.Bcl-2 protein expression and long-tern surviral in breast cancer.Am J Pathol,1994,145(5):1191～1198
[3] Isola J,Visakorpi T,Hkli k,et al.Association of over expression of tumor suppressor protein P53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patient.J Natl Cancer Inst,1992,84:1109～1114
, 百拇医药
[4] 蔡德巍，高长泽，王能进.C-myc基因和P53蛋白在肝细胞癌中的表达.中华病理学杂志，1994，23(2)：100～103
[5] Garcia RL,Coltrera MD,Gown AN.Analysis of proliferating grade using anti-PCNA/cyxlin monoclonal antibodies in fixed,embeded tissue:comparison with flow cytometric analysis.Am J Pathol,1989,134:733～739
[6] Hall PA.Levison DA,Woods AL,et al.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) immunolocalization in paraffin sections:an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms.J Pathol,1990,162:285～294
, 百拇医药
[7] Lu QL,Pousson R,Wong L,et al.Bcl-2 expression in adult and embryonic non-hematopoietic tissues.J Pathol,1993,169:431～437
[8] Villuendas R,Riris MA,Orradre JL,et al.Different Bcl-2 protein expression in hight grade B-cell lymphomas derived from lymph node of mucosa-associated lymphoid tissue.Am J Pathol,1991,139:989～993
(19980624 收稿), 百拇医药