组织工程中细胞与材料的粘附作用△
作者：秦廷武 杨志明 蔡绍皙 徐世荣 吴泽志
单位：1 华西医科大学附属第一医院骨科(成都，610041)；2 重庆大学生物工程研究院
关键词：细胞粘附；材料；组织工程
中国修复重建外科杂志/990111 【摘 要】 目的 探讨组织工程中细胞与材料粘附作用及其影响因素。方法 广泛查阅近期有关细胞与材料粘附作用的文献，综述了组织细胞与材料作用方面的研究工作。结果 细胞对材料的粘附特性不仅取决于材料本身，包括材料及其表面性质、表面修饰、表面形态、净电荷、孔隙率及降解速率，而且与细胞表面的分子表达及其材料的相互作用有关。结论 定量测定细胞与材料的粘附作用并了解其生物物理机制在组织工程学研究中十分重要。
INTERACTION OF CELL ADHESION TO MATERIALS IN TISSUE ENGINEERING
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Qin Tingwu*, Yang Zhiming, Cai Shaoxi, et al
. * Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu Sichuan, P.R. China 610041. E-mail: orthop ＠ public.cd.sc.cn
【Abstract】 Objective To investigate the adhesive interactions of cells with materials and the effects of material properties on cell adhesion in tissue engineering. Methods By looking up the recent literatures dealt with adhesive interactions of cells with materials and reviewing previous work on the adhesion of tissue-derived cells to materials.Results The adhesion characteristics of cells to materials not only depend on the nature of materials, including bulk and surface properties, surface modification, surface morphology, net charge, porosity and degradation rate, but also on the expression of cell surface molecules and their interaction with the material. Conclusion The quantitative measure and biophysical mechanisms of cell adhesion to materials might be very important in tissue engineering.
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【Key words】 Cell adhesion Materials Tissue engineering
This Research is Supported by the Natural Sciences Foundation of China, and by the Biomechanics and Rheology Open Laboratory Foundation of the State Education Ministry.
组织工程学是用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常和病理哺乳类动物组织的结构-功能关系， 以及研制生物代用品，以恢复、 维持或改善其功能的一门交叉学科[1]。组织工程学研究主要包括用于直接移植或体外器官制造的干细胞培养； 体外生成用于治疗目的的种子细胞、细胞衬里和器官；研制用于自体或异体细胞或器官生物的相容性材料，以制备可移植的人工活性材料或装置[2，3]。
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细胞与材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的粘附(adhesion)是基础[4]，细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[5]。无论在体外，还是体内，直接也是最先与组织细胞相接触并发生作用的是材料表面，因此细胞与材料表面的粘附相当重要，而且粘附特性的差异还将影响细胞的增殖、分化等一系列反应[6]。细胞与材料的粘附是组织工程必须研究的基本问题。它不仅可以为组织工程研究筛选出适于细胞发挥生理功能的胞外基质材料，而且为研究细胞与胞外基质相互作用的分子机制提供了重要的手段。现就组织工程中细胞与材料的粘附及其影响因素综述如下。
1 细胞与材料粘附的研究方法
为研究细胞与材料的粘附及各种因素对它的影响，必须有适当测量粘附特性的方法。细胞与材料的粘附力可分为两类：细胞与基质间形成粘附所需的力和使已形成粘附破坏所需的力，两者间有很大区别，但均可反映细胞与材料的粘附强度。下面介绍细胞与材料粘附的离体研究方法。
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1.1 沉淀法
将细胞悬液在涂有材料的培养皿中培养一定时间，然后洗脱未粘附的细胞，用显微镜计数，算出粘附于皿底的细胞所占百分比；也可用放射性同位素或荧光标记，进行放射性或荧光测量；还可通过测量细胞内某种酶的浓度或用染料与细胞内某种物质(如DNA)结合的量来对细胞进行计数。粘附在皿底的细胞越多，细胞与材料粘附能力越强。
沉淀法的优点是简便易行、测量迅速。但因其难于控制洗脱未粘细胞的力；同时，细胞粘附力受很多不可控制的实验条件影响，使得沉淀法测定的结果重复性差，误差大。为克服上述缺点，通常采用振动或离心方法对洗脱细胞的力进行定量，这样可以测量细胞与材料分开所需力的大小，如果在皿底预先涂以某些胞外基质蛋白，还可用此法测定细胞与这些蛋白质间的粘附力大小。
1.2 转盘法
将一个不锈钢圆盘浸于涂有材料的细胞培养皿介质中，并以一定角速度ω旋转，从而带动介质(粘滞系数为η)一起旋转。转动的介质将冲击粘附于培养皿底上的细胞，其冲击力F=ωrη/h，式中r为细胞与皿中心的距离，h为圆盘到皿底的高度。当ω、η和h固定时，皿底细胞所受力小大与其位置r有关。如果细胞所受介质冲击力F等于或大于其与皿底的粘附力时，即将从皿底脱落。因此，测出未脱细胞圆斑的半径r，则可算出细胞与皿底材料的粘附力。在皿底涂以某些胞外基质分子，包括纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)[7]、玻璃粘连蛋白(vitronectin, VN)[8]等，可以测出细胞与这些分子的粘附力。
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1.3 流室测定法
流室测定法用于测定液流中细胞与材料表面的粘附力。流室由两张显微载玻片构成，间距为a，间隙四周用密封胶或石蜡粘合。上面一片打两个孔，细胞悬液由一个小孔以恒定速率泵入小槽，泵入流量为Q，悬液从另一小孔排出。将流室置于一倒置显微镜载物台上，并使之保持37℃。常用流室具有矩形边界，长为l，宽为b，流室内(除入口、出口处的邻近区域外)的流场是均匀的，定常情况下室内细胞受的切应力为：τ=6 ηQ/(a2b)，式中η为细胞悬浮液粘滞系数。当η、a、b确定时，改变流量Q将得到不同切应力τ。通常研究某种切应力下细胞与材料的粘附特性，也可研究不同切应力下细胞的粘附特性。其方法是用录像带连续记录粘附于小室中心部分材料上的细胞数，将单位面积小室底面粘附的细胞数对时间作图，其斜率可作为细胞与材料粘附力大小的量度。1972年Gail等测定细胞在切应力作用前后单位面积小室底上粘附的细胞数，求出洗脱的细胞数占作用前细胞数的百分比，作为细胞与材料表面的粘附能力。在小室下面载玻片上预先涂以粘附分子，可测定细胞与这些分子的粘附性。
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1.4 微吸管吸吮法
上述各种测量细胞与材料粘附的方法有一共同特点，即只能用于测量大量细胞与基底材料粘附特性，不能测量单个细胞与材料的粘附力、脱附过程中细胞在材料表面上接触面积的变化，以及细胞的变形性等细胞力学参数，微吸管吸吮法可用于测量单个细胞的上述细胞力学参数。微吸管吸吮法是将具有毫米级内径的玻璃管加热，通过微管拉制器，制成微米量级的尖端，然后插入细胞培养室中，玻璃管的另一端与微型水箱连接，水箱又与一高灵敏度的压力传感器相连。通过上下调节水箱位置，可以得到适当的吸压，使细胞吸附于微吸管尖端。通过微操作控制器，可将微吸管尖端移到任意位置。在显微镜下移动吸有细胞的微吸管，使细胞向材料表面靠拢并发生粘附。然后再反方向移动微吸管，开始细胞将发生变形，随着毛细管的移动，细胞的形变增大，施加于细胞与材料接触部的力也将增大。当此力等于细胞与材料间粘附力时，细胞从材料表面分开，细胞逐渐恢复原状。因此细胞与材料间的粘附力可由下式求出：Fp=πR2PΔPsinθp，式中Rp为微吸管内半径，ΔP为微吸管内负压，θp为细胞与材料分开瞬间细胞在微吸管入口处细胞膜的切线方向与微吸管平面方向的夹角。
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如果水箱移动的间距为10 μm，将产生0.1 Pa(即10-6大气压)的压强变化。假设吸管尖端直径为2 μm，0.1 Pa的吸压相当于施加在细胞上的力是0.3×10-12 N。微吸管吸吮不仅可以产生并测量到这样小的吸压，而且易于标定，重复性好。采用微吸管吸吮法测量细胞粘附力时，假设细胞与吸管之间没有摩擦力(通常微吸管的表面涂有一层蛋白质)，同时还假设培养液流体粘性力相对于细胞自身的粘性力是可忽略的。使用时在材料表面预先涂以某些蛋白质，如粘附受体分子、FN[9]等，作为基质，研究细胞与它们的粘附力学行为。
2 细胞与材料粘附的生物物理基础
细胞与材料粘附能力的大小与细胞和材料表面的物理性质及化学性质有关。由二者表面物理性质所决定的粘附作用称为非特异粘附(nonspecific adhesion)；如果细胞粘附涉及二者表面分子之间的特异相互作用，则称为特异粘附(specific adhesion)，或称为细胞识别(cell recognition)。细胞与材料的粘附不仅是细胞表面性质的一种表现，而且是与细胞内部结构与功能变化密切相关的过程。
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2.1 细胞与材料的非特异粘附
2.1.1 静电斥力(electrostatic repulsions) 在细胞与材料的相互作用中，两个带有同种电荷的分子之间存在相互排斥力。对于两个相互平行的带电膜，利用库仑定律可算出两膜间相互作用的作用力和能量。由此可以算出细胞与材料彼此靠近时因表面电荷相互作用而产生的作用力和势能随二者间距而变化的规律。
2.1.2 立体结构稳定性产生的斥力 当细胞与材料相互作用时，因细胞表面大分子空间结构改变而产生的相互作用力称为立体结构稳定性产生的斥力，即近距位阻力(short-range steric repulsions)。通常细胞表面被覆着一层糖链，这些糖链有一定的柔韧性。每个糖链由若干个刚性片断组成，每个片断均可相对于邻近的片断旋转，由此产生糖链的不同构型。此构型的自由能由细胞与材料相互作用的自由能之和决定。当细胞与材料彼此作用时，细胞表面多糖构型自由能产生变化，相应的位阻力改变。当细胞逐渐靠近材料时，细胞外衣部分既有重叠又有压缩，导致糖链局部浓度增加，每一条糖链均因压缩而使其自由空间减少，导致两者总的自由能增加。因此，由糖链空间结构稳定性而产生的斥力增加，位阻力增大。
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2.1.3 范德瓦耳斯力 在细胞与材料相互作用时，它们的运动如果不受限制，将相互吸引。这是由于一个分子电荷的位置或运动与另一个分子电荷的位置或运动是相互关联的，由此而产生的力即范德瓦耳斯力(van der waals force)，其大小与距离的六次方成反比。若将相互作用的细胞膜设想为一定厚度的平板(在很小的局部，这一假设可以成立)。可以看到，除非两者非常靠近，细胞与材料间非特异的范德瓦耳斯力相互吸引总是远小于静电斥力和立体稳定性所产生的斥力。因此，如果没有某种原因使细胞与材料间的斥力减少或使其克服，单靠范德瓦耳斯力不足以形成细胞与材料的粘附。细胞的重力、运动、细胞或材料表面的某些特性都可能成为克服细胞斥力的原因。
2.2 细胞与材料的特异性粘附
以上已述及细胞与材料的非特异相互作用。实际上，在组织工程研究中，细胞的粘附过程涉及分子之间的特异结合。以下讨论目前研究较多的粘附分子(存在于细胞表面的与粘附作用有关的分子)介导的细胞与材料的特异性粘附(如特异性抗原与受体的相互作用)。确定细胞表面的某种分子是否参与细胞粘附，通常采用两种方法：①制备该分子的抗体(单抗或多抗)，用抗体的Fab段阻断该分子的抗原部分，然后观察这种处理对细胞粘附的影响；②用克隆化的cDNA转染细胞，借以了解各种表面蛋白在细胞粘附中的作用[10]。
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2.2.1 钙粘附蛋白 钙粘附蛋白(cadherins)是钙依赖的嗜同种抗体的细胞粘附受体，它是一种分子量为120 000～140 000(120～140 kDa)的糖蛋白，在固体类组织发育过程中起细胞识别和分类作用。每个钙粘附蛋白分子均包括一个前序列区，一个细胞外区，一个跨膜区和一个胞浆区。在低钙条件下，粘附破坏，细胞分离。钙粘附蛋白可参与细胞跨膜转导过程和细胞的生长调控。钙粘附蛋白可能通过蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)调控细胞的生长。如果激活PKC，可促进粘附连接的形成。因此，细胞粘附不仅是细胞与其基质间的机械聚集或附着过程，而且可能触发细胞内的一系列变化。钙粘附蛋白介导的粘附，必须与胞浆蛋白和肌动蛋白微丝形成复合物[11]。
2.2.2 固有粘附蛋白 固有粘附蛋白(integrins)是存在于细胞与基质连接处与粘附有关的蛋白，它们参与细胞与基质间的粘附。这是一类跨膜蛋白，由α和β两个亚单位构成。它们能识别细胞外的基质分子，如FN、层粘连蛋白(laminin, LN)以及各种胶原，并与之特异结合，因此实际上作为这些基质蛋白的膜受体。很多固有粘附蛋白所识别的肽中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列。在胞浆内固有粘附蛋白通过踝蛋白(talin)、粘胶蛋白(tenascin)等与肌动蛋白丝连接。固有粘附蛋白和踝蛋白中的酪氨酸均可被磷酸化，这种磷酸化可能对细胞粘附的形成和维持有重要影响。因此，固有粘附蛋白及其相关蛋白中酪氨酸对细胞粘附具有重要作用，细胞可通过这些酪氨酸的磷酸化对这些蛋白加以修饰，从而调节细胞粘附。
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2.2.3 Ig超家族粘附分子 Ig超家族粘附分子(Ig super family)是一个分子的大家族。其共同特点是分子上有一个免疫球蛋白折叠或免疫球蛋白区。该区由100个左右的氨基酸残基构成，其中有两个半胱氨酸，每个半胱氨酸附近的氨基酸残基都是保守的，从而形成一个特殊的三维结构。这个结构由两个折片组成，呈球形。每个β折片中有3～4个β链，每个链有5～10个氨基酸残基，这组分子参与细胞不依赖于钙的粘附过程。
3 细胞与材料粘附作用的影响因素
细胞与材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程，因而受多种因素的影响。从细胞生物学角度，细胞代谢状态、细胞与材料接触时间、细胞的疏水性、细胞表面电荷以及细胞表面膜分子的侧向运动与细胞表面膜的柔韧性等，都将不同程度地影响细胞与材料的粘附作用。我们仅从组织工程学角度，讨论材料特性对细胞粘附作用的影响。
3.1 材料表面物理性质
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一般情况下，细胞在中等湿润的材料表面粘附性最强。在多数材料表面上，细胞的粘附要求有血清存在，粘附的最适条件与蛋白质在材料表面的吸附能力有关。
材料表面电荷量影响组织粘附性。在无血清时，细胞在带正电荷的表面上的粘附增加。在实际中，用于组织培养的聚苯乙烯(tissue-culture polystyrene, TCPS)，经辉光放电或硫酸处理，提高表面带电基团数，从而改善了细胞的粘附特性。粘附性极差的聚羟乙基丙烯酸树脂(polyhydroxy-ethylmethacrylate, pHEMA)经硫酸处理，可提高内皮细胞在材料表面的粘附特性。用射频技术将血浆沉积在TCPS表面，成纤维细胞和成肌细胞的粘附性增加。
3.2 材料表面化学性质
3.2.1 合成聚合物 细胞与聚合物表面的粘附特性依赖于表面的化学性质。1978年Folkman等在含有TCPS和不同浓度的pHEMA表面上培养细胞，结果表明，随着pHEMA含量增多，细胞粘附性和伸展性均下降。研究表明，不同聚合物表面对细胞的粘附乃至功能具有很大影响。这在组织工程中，对于不同聚合物的筛选具有特别重要的意义。
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3.2.2 材料的生物可降解性 聚乳酸(polyactic acid, PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)及二者共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)因其良好的生物相容性常用于制作细胞培养基底，软骨细胞能在多孔的PGA或PLA泡沫中发生增殖并分泌葡萄糖氨基聚糖[12]。培养在PLGA基底上的鼠肝细胞，4天后便有白蛋白分泌。新生鼠成骨细胞可粘附于PLA、PGA及PLGA基底上并合成胶原[13]。
其它生物可降解聚合物也影响细胞的粘附。成骨细胞种植于含有侧链基团的聚偶联氮(polyphosphazenes)表面上，其细胞增殖与聚合物降解速率和侧基化学性质有关[14]。成纤维细胞和肝细胞粘附于含有各种功能基团的聚磷酯表面上。成纤维细胞能在含有酪氨酸的聚碳酸酯和多芳基化合物表面上发生粘附并增殖。
生物降解性聚合物在组织工程中的重要应用，是利用其降解特性，表面不断更新，为组织细胞提供不断变化的粘附和生长界面。
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3.2.3 蛋白质吸附 来自培养基或培养细胞自身分泌的蛋白质，吸附在聚合物表面，将改变材料表面的化学性质，进而影响细胞与材料的粘附。实际中为确定某种蛋白质吸附对细胞粘附的影响，常用纯化的蛋白溶液预涂于表面进行研究，以此代表在体时材料表面吸附有一层蛋白质的情况。众多研究发现，细胞粘附和伸展同吸附在各种材料表面上的FN有关。细胞在材料表面的粘附、迁移依赖于预涂粘附蛋白[15]，以及蛋白质介导的细胞粘附抑制剂的浓度[16]。
3.3 材料表面修饰
3.3.1 固定蛋白质 材料表面修饰(surface modification)影响细胞的粘附。材料表面加入化学基团，如羟基；改变材料表面的湿润度，提高粘附蛋白对材料表面的吸附能力，进而影响细胞的粘附。将胶原类蛋白质固定在材料表面上，设计出接近组织中的条件反应界面[17]。将蛋白质加入聚合物单体中混合反应，或将蛋白质与聚合物溶剂混合，用胶原和其它胞外基质分子制成水凝胶。
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3.3.2 固定多肽类物质 在组织工程中，常将一些小的生物活性功能基团固定在材料表面，以研究其对细胞粘附的影响。这些活性基团包括寡肽、糖类或糖脂。某些短链氨基酸序列、细胞表面受体可影响细胞粘附。细胞对固定有RGD的底物的粘附可被可溶性RGD竞争性抑制，说明细胞粘附受RGD敏感的细胞粘附受体所调节。
由于RGD是介导细胞与胞外基质粘附的多肽链，在材料表面直接固定RGD，制成受体专门性材料，可以促进受体介导的细胞对材料的粘附来提高其生物相容性。RGD可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自发形成一分子层，为与受体介导的细胞反应提供了位点，进而促进细胞粘附、伸展[18]。由于RGD独特的生物学特性，RGD正广泛用于固定在不可降解的高分子材料(聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等)表面，以及生物可降解材料(如PLA等)表面[19]。
3.3.3 固定氨基酸及其衍生物 对某些细胞，材料表面固定基本氨基酸单分子聚合物，如聚赖氨酸和聚鸟氨酸，可以提高细胞的粘附性。通过共介结合氨基基团也影响细胞的粘附。在聚合物表面固定糖类物质，影响细胞粘附。碳酸酯用来固定在聚丙烯酰胺表面，使细胞易于粘附、生长。
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3.3.4 固定细胞生长因子 在材料表面固定生长因子，可以通过引发细胞粘附来促进细胞生长。胰岛素与粘附蛋白类(如FN、胶原)共同固定，诱导产生协同作用，使胰岛素活性增加。1992年Ito等发现，不同生长因子对细胞粘附和生长的影响有一定的特异性。白蛋白、γ-球蛋白缺乏促进细胞粘附、伸展和生长的活性，其原因在于成纤维细胞缺乏与之相互作用的受体。胰岛素有较高促细胞生长能力，FN有较高促细胞粘附能力，二者共同固定于材料表面，产生协同作用可增加胰岛素的活性。
3.4 材料表面几何性质
材料表面粗糙时，会使细胞与材料接触的表面积增加，以促进细胞在材料表面上的湿润作用[20]，从而影响细胞的粘附强度。材料表面存在微小的刻痕或其它微结构时，细胞粘附性增强[21]。通常细胞沿着表面纤维或刻痕取向粘附，形成接触引导(contact guidance)。成纤维细胞在表面微结构为1～8 μm时，细胞沿小凹槽定向排列。细胞粘附程度取决于凹槽的深度和间距。不同细胞在相同微结构表面粘附性不同[22]。
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具有“峰”和“谷”样结构的表面也影响细胞粘附性质。2～15 μm的聚二甲基硅氧烷表面微结构能最大限度地使巨噬细胞发生粘附。表面均匀分布有4 μm2或25 μm2的“峰”更适于成纤维细胞粘附，但100 μm2的“峰”或4、25及100 μm2的“谷”都不适于成纤维细胞粘附。
3.5 表面特化结构
采用微晶图技术(microlithographic technique)，在材料表面制成具有确定尺寸、形状及图案的粘附和非粘附区域，其中具有粘附性的特化区域称为粘附微岛(adhesive micro-islands)，可供单个细胞发生粘附。通过对粘附微岛大小改变及岛内修饰，可以控制细胞在材料表面上的粘附和伸展面积。对较小的粘附微岛(约500 μm2)，细胞能发生粘附但不能伸展；而对较大的粘附微岛(4 000 μm2)，细胞发生粘附和伸展的程度与单层培养没有差别。实验观察到，原代培养在具有特化结构表面上的鼠肝细胞，优先粘附到有FN裱衬的岛上，且细胞被岛的形状所限制，不能向周围非粘附性区域伸展[23]。通过表面化学修饰技术，可使特化结构表面带上有机功能基团或配体来实现表面构图[24]，也可使其具有各种程度的表面电荷、湿润性、表面自由能及对蛋白质吸附力[25]。这种方法为实现在细胞大规模培养中控制细胞粘附、形状及功能提供了一种新途径。特化结构表面提供了一种特有的能力以很高的密度来培养细胞，同时又可使每个细胞与邻近细胞相隔开，并使它们各自处于一个预先决定的位置。显然，把培养形成的具有预定形状与图形的细胞片层应用于组织工程中显得极其有价值。
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△ 国家自然科学基金(39830100)重点项目、国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室开放课题基金(98J01)资助课题
4 参考文献
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组织工程学是用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常和病理哺乳类动物组织的结构-功能关系， 以及研制生物代用品，以恢复、 维持或改善其功能的一门交叉学科[1]。组织工程学研究主要包括用于直接移植或体外器官制造的干细胞培养； 体外生成用于治疗目的的种子细胞、细胞衬里和器官；研制用于自体或异体细胞或器官生物的相容性材料，以制备可移植的人工活性材料或装置[2，3]。
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细胞与材料的相互作用是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的粘附(adhesion)是基础[4]，细胞必须与材料发生适当的粘附，才能进行迁移、分化和增殖[5]。无论在体外，还是体内，直接也是最先与组织细胞相接触并发生作用的是材料表面，因此细胞与材料表面的粘附相当重要，而且粘附特性的差异还将影响细胞的增殖、分化等一系列反应[6]。细胞与材料的粘附是组织工程必须研究的基本问题。它不仅可以为组织工程研究筛选出适于细胞发挥生理功能的胞外基质材料，而且为研究细胞与胞外基质相互作用的分子机制提供了重要的手段。现就组织工程中细胞与材料的粘附及其影响因素综述如下。
1 细胞与材料粘附的研究方法
为研究细胞与材料的粘附及各种因素对它的影响，必须有适当测量粘附特性的方法。细胞与材料的粘附力可分为两类：细胞与基质间形成粘附所需的力和使已形成粘附破坏所需的力，两者间有很大区别，但均可反映细胞与材料的粘附强度。下面介绍细胞与材料粘附的离体研究方法。
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1.1 沉淀法
将细胞悬液在涂有材料的培养皿中培养一定时间，然后洗脱未粘附的细胞，用显微镜计数，算出粘附于皿底的细胞所占百分比；也可用放射性同位素或荧光标记，进行放射性或荧光测量；还可通过测量细胞内某种酶的浓度或用染料与细胞内某种物质(如DNA)结合的量来对细胞进行计数。粘附在皿底的细胞越多，细胞与材料粘附能力越强。
沉淀法的优点是简便易行、测量迅速。但因其难于控制洗脱未粘细胞的力；同时，细胞粘附力受很多不可控制的实验条件影响，使得沉淀法测定的结果重复性差，误差大。为克服上述缺点，通常采用振动或离心方法对洗脱细胞的力进行定量，这样可以测量细胞与材料分开所需力的大小，如果在皿底预先涂以某些胞外基质蛋白，还可用此法测定细胞与这些蛋白质间的粘附力大小。
1.2 转盘法
将一个不锈钢圆盘浸于涂有材料的细胞培养皿介质中，并以一定角速度ω旋转，从而带动介质(粘滞系数为η)一起旋转。转动的介质将冲击粘附于培养皿底上的细胞，其冲击力F=ωrη/h，式中r为细胞与皿中心的距离，h为圆盘到皿底的高度。当ω、η和h固定时，皿底细胞所受力小大与其位置r有关。如果细胞所受介质冲击力F等于或大于其与皿底的粘附力时，即将从皿底脱落。因此，测出未脱细胞圆斑的半径r，则可算出细胞与皿底材料的粘附力。在皿底涂以某些胞外基质分子，包括纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)[7]、玻璃粘连蛋白(vitronectin, VN)[8]等，可以测出细胞与这些分子的粘附力。
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1.3 流室测定法
流室测定法用于测定液流中细胞与材料表面的粘附力。流室由两张显微载玻片构成，间距为a，间隙四周用密封胶或石蜡粘合。上面一片打两个孔，细胞悬液由一个小孔以恒定速率泵入小槽，泵入流量为Q，悬液从另一小孔排出。将流室置于一倒置显微镜载物台上，并使之保持37℃。常用流室具有矩形边界，长为l，宽为b，流室内(除入口、出口处的邻近区域外)的流场是均匀的，定常情况下室内细胞受的切应力为：τ=6 ηQ/(a2b)，式中η为细胞悬浮液粘滞系数。当η、a、b确定时，改变流量Q将得到不同切应力τ。通常研究某种切应力下细胞与材料的粘附特性，也可研究不同切应力下细胞的粘附特性。其方法是用录像带连续记录粘附于小室中心部分材料上的细胞数，将单位面积小室底面粘附的细胞数对时间作图，其斜率可作为细胞与材料粘附力大小的量度。1972年Gail等测定细胞在切应力作用前后单位面积小室底上粘附的细胞数，求出洗脱的细胞数占作用前细胞数的百分比，作为细胞与材料表面的粘附能力。在小室下面载玻片上预先涂以粘附分子，可测定细胞与这些分子的粘附性。
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1.4 微吸管吸吮法
上述各种测量细胞与材料粘附的方法有一共同特点，即只能用于测量大量细胞与基底材料粘附特性，不能测量单个细胞与材料的粘附力、脱附过程中细胞在材料表面上接触面积的变化，以及细胞的变形性等细胞力学参数，微吸管吸吮法可用于测量单个细胞的上述细胞力学参数。微吸管吸吮法是将具有毫米级内径的玻璃管加热，通过微管拉制器，制成微米量级的尖端，然后插入细胞培养室中，玻璃管的另一端与微型水箱连接，水箱又与一高灵敏度的压力传感器相连。通过上下调节水箱位置，可以得到适当的吸压，使细胞吸附于微吸管尖端。通过微操作控制器，可将微吸管尖端移到任意位置。在显微镜下移动吸有细胞的微吸管，使细胞向材料表面靠拢并发生粘附。然后再反方向移动微吸管，开始细胞将发生变形，随着毛细管的移动，细胞的形变增大，施加于细胞与材料接触部的力也将增大。当此力等于细胞与材料间粘附力时，细胞从材料表面分开，细胞逐渐恢复原状。因此细胞与材料间的粘附力可由下式求出：Fp=πR2PΔPsinθp，式中Rp为微吸管内半径，ΔP为微吸管内负压，θp为细胞与材料分开瞬间细胞在微吸管入口处细胞膜的切线方向与微吸管平面方向的夹角。
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如果水箱移动的间距为10 μm，将产生0.1 Pa(即10-6大气压)的压强变化。假设吸管尖端直径为2 μm，0.1 Pa的吸压相当于施加在细胞上的力是0.3×10-12 N。微吸管吸吮不仅可以产生并测量到这样小的吸压，而且易于标定，重复性好。采用微吸管吸吮法测量细胞粘附力时，假设细胞与吸管之间没有摩擦力(通常微吸管的表面涂有一层蛋白质)，同时还假设培养液流体粘性力相对于细胞自身的粘性力是可忽略的。使用时在材料表面预先涂以某些蛋白质，如粘附受体分子、FN[9]等，作为基质，研究细胞与它们的粘附力学行为。
2 细胞与材料粘附的生物物理基础
细胞与材料粘附能力的大小与细胞和材料表面的物理性质及化学性质有关。由二者表面物理性质所决定的粘附作用称为非特异粘附(nonspecific adhesion)；如果细胞粘附涉及二者表面分子之间的特异相互作用，则称为特异粘附(specific adhesion)，或称为细胞识别(cell recognition)。细胞与材料的粘附不仅是细胞表面性质的一种表现，而且是与细胞内部结构与功能变化密切相关的过程。
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2.1 细胞与材料的非特异粘附
2.1.1 静电斥力(electrostatic repulsions) 在细胞与材料的相互作用中，两个带有同种电荷的分子之间存在相互排斥力。对于两个相互平行的带电膜，利用库仑定律可算出两膜间相互作用的作用力和能量。由此可以算出细胞与材料彼此靠近时因表面电荷相互作用而产生的作用力和势能随二者间距而变化的规律。
2.1.2 立体结构稳定性产生的斥力 当细胞与材料相互作用时，因细胞表面大分子空间结构改变而产生的相互作用力称为立体结构稳定性产生的斥力，即近距位阻力(short-range steric repulsions)。通常细胞表面被覆着一层糖链，这些糖链有一定的柔韧性。每个糖链由若干个刚性片断组成，每个片断均可相对于邻近的片断旋转，由此产生糖链的不同构型。此构型的自由能由细胞与材料相互作用的自由能之和决定。当细胞与材料彼此作用时，细胞表面多糖构型自由能产生变化，相应的位阻力改变。当细胞逐渐靠近材料时，细胞外衣部分既有重叠又有压缩，导致糖链局部浓度增加，每一条糖链均因压缩而使其自由空间减少，导致两者总的自由能增加。因此，由糖链空间结构稳定性而产生的斥力增加，位阻力增大。
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2.1.3 范德瓦耳斯力 在细胞与材料相互作用时，它们的运动如果不受限制，将相互吸引。这是由于一个分子电荷的位置或运动与另一个分子电荷的位置或运动是相互关联的，由此而产生的力即范德瓦耳斯力(van der waals force)，其大小与距离的六次方成反比。若将相互作用的细胞膜设想为一定厚度的平板(在很小的局部，这一假设可以成立)。可以看到，除非两者非常靠近，细胞与材料间非特异的范德瓦耳斯力相互吸引总是远小于静电斥力和立体稳定性所产生的斥力。因此，如果没有某种原因使细胞与材料间的斥力减少或使其克服，单靠范德瓦耳斯力不足以形成细胞与材料的粘附。细胞的重力、运动、细胞或材料表面的某些特性都可能成为克服细胞斥力的原因。
2.2 细胞与材料的特异性粘附
以上已述及细胞与材料的非特异相互作用。实际上，在组织工程研究中，细胞的粘附过程涉及分子之间的特异结合。以下讨论目前研究较多的粘附分子(存在于细胞表面的与粘附作用有关的分子)介导的细胞与材料的特异性粘附(如特异性抗原与受体的相互作用)。确定细胞表面的某种分子是否参与细胞粘附，通常采用两种方法：①制备该分子的抗体(单抗或多抗)，用抗体的Fab段阻断该分子的抗原部分，然后观察这种处理对细胞粘附的影响；②用克隆化的cDNA转染细胞，借以了解各种表面蛋白在细胞粘附中的作用[10]。
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2.2.1 钙粘附蛋白 钙粘附蛋白(cadherins)是钙依赖的嗜同种抗体的细胞粘附受体，它是一种分子量为120 000～140 000(120～140 kDa)的糖蛋白，在固体类组织发育过程中起细胞识别和分类作用。每个钙粘附蛋白分子均包括一个前序列区，一个细胞外区，一个跨膜区和一个胞浆区。在低钙条件下，粘附破坏，细胞分离。钙粘附蛋白可参与细胞跨膜转导过程和细胞的生长调控。钙粘附蛋白可能通过蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)调控细胞的生长。如果激活PKC，可促进粘附连接的形成。因此，细胞粘附不仅是细胞与其基质间的机械聚集或附着过程，而且可能触发细胞内的一系列变化。钙粘附蛋白介导的粘附，必须与胞浆蛋白和肌动蛋白微丝形成复合物[11]。
2.2.2 固有粘附蛋白 固有粘附蛋白(integrins)是存在于细胞与基质连接处与粘附有关的蛋白，它们参与细胞与基质间的粘附。这是一类跨膜蛋白，由α和β两个亚单位构成。它们能识别细胞外的基质分子，如FN、层粘连蛋白(laminin, LN)以及各种胶原，并与之特异结合，因此实际上作为这些基质蛋白的膜受体。很多固有粘附蛋白所识别的肽中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列。在胞浆内固有粘附蛋白通过踝蛋白(talin)、粘胶蛋白(tenascin)等与肌动蛋白丝连接。固有粘附蛋白和踝蛋白中的酪氨酸均可被磷酸化，这种磷酸化可能对细胞粘附的形成和维持有重要影响。因此，固有粘附蛋白及其相关蛋白中酪氨酸对细胞粘附具有重要作用，细胞可通过这些酪氨酸的磷酸化对这些蛋白加以修饰，从而调节细胞粘附。
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2.2.3 Ig超家族粘附分子 Ig超家族粘附分子(Ig super family)是一个分子的大家族。其共同特点是分子上有一个免疫球蛋白折叠或免疫球蛋白区。该区由100个左右的氨基酸残基构成，其中有两个半胱氨酸，每个半胱氨酸附近的氨基酸残基都是保守的，从而形成一个特殊的三维结构。这个结构由两个折片组成，呈球形。每个β折片中有3～4个β链，每个链有5～10个氨基酸残基，这组分子参与细胞不依赖于钙的粘附过程。
3 细胞与材料粘附作用的影响因素
细胞与材料的粘附是一个包括多因素的复杂过程，因而受多种因素的影响。从细胞生物学角度，细胞代谢状态、细胞与材料接触时间、细胞的疏水性、细胞表面电荷以及细胞表面膜分子的侧向运动与细胞表面膜的柔韧性等，都将不同程度地影响细胞与材料的粘附作用。我们仅从组织工程学角度，讨论材料特性对细胞粘附作用的影响。
3.1 材料表面物理性质
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一般情况下，细胞在中等湿润的材料表面粘附性最强。在多数材料表面上，细胞的粘附要求有血清存在，粘附的最适条件与蛋白质在材料表面的吸附能力有关。
材料表面电荷量影响组织粘附性。在无血清时，细胞在带正电荷的表面上的粘附增加。在实际中，用于组织培养的聚苯乙烯(tissue-culture polystyrene, TCPS)，经辉光放电或硫酸处理，提高表面带电基团数，从而改善了细胞的粘附特性。粘附性极差的聚羟乙基丙烯酸树脂(polyhydroxy-ethylmethacrylate, pHEMA)经硫酸处理，可提高内皮细胞在材料表面的粘附特性。用射频技术将血浆沉积在TCPS表面，成纤维细胞和成肌细胞的粘附性增加。
3.2 材料表面化学性质
3.2.1 合成聚合物 细胞与聚合物表面的粘附特性依赖于表面的化学性质。1978年Folkman等在含有TCPS和不同浓度的pHEMA表面上培养细胞，结果表明，随着pHEMA含量增多，细胞粘附性和伸展性均下降。研究表明，不同聚合物表面对细胞的粘附乃至功能具有很大影响。这在组织工程中，对于不同聚合物的筛选具有特别重要的意义。
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3.2.2 材料的生物可降解性 聚乳酸(polyactic acid, PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)及二者共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)因其良好的生物相容性常用于制作细胞培养基底，软骨细胞能在多孔的PGA或PLA泡沫中发生增殖并分泌葡萄糖氨基聚糖[12]。培养在PLGA基底上的鼠肝细胞，4天后便有白蛋白分泌。新生鼠成骨细胞可粘附于PLA、PGA及PLGA基底上并合成胶原[13]。
其它生物可降解聚合物也影响细胞的粘附。成骨细胞种植于含有侧链基团的聚偶联氮(polyphosphazenes)表面上，其细胞增殖与聚合物降解速率和侧基化学性质有关[14]。成纤维细胞和肝细胞粘附于含有各种功能基团的聚磷酯表面上。成纤维细胞能在含有酪氨酸的聚碳酸酯和多芳基化合物表面上发生粘附并增殖。
生物降解性聚合物在组织工程中的重要应用，是利用其降解特性，表面不断更新，为组织细胞提供不断变化的粘附和生长界面。
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3.2.3 蛋白质吸附 来自培养基或培养细胞自身分泌的蛋白质，吸附在聚合物表面，将改变材料表面的化学性质，进而影响细胞与材料的粘附。实际中为确定某种蛋白质吸附对细胞粘附的影响，常用纯化的蛋白溶液预涂于表面进行研究，以此代表在体时材料表面吸附有一层蛋白质的情况。众多研究发现，细胞粘附和伸展同吸附在各种材料表面上的FN有关。细胞在材料表面的粘附、迁移依赖于预涂粘附蛋白[15]，以及蛋白质介导的细胞粘附抑制剂的浓度[16]。
3.3 材料表面修饰
3.3.1 固定蛋白质 材料表面修饰(surface modification)影响细胞的粘附。材料表面加入化学基团，如羟基；改变材料表面的湿润度，提高粘附蛋白对材料表面的吸附能力，进而影响细胞的粘附。将胶原类蛋白质固定在材料表面上，设计出接近组织中的条件反应界面[17]。将蛋白质加入聚合物单体中混合反应，或将蛋白质与聚合物溶剂混合，用胶原和其它胞外基质分子制成水凝胶。
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3.3.2 固定多肽类物质 在组织工程中，常将一些小的生物活性功能基团固定在材料表面，以研究其对细胞粘附的影响。这些活性基团包括寡肽、糖类或糖脂。某些短链氨基酸序列、细胞表面受体可影响细胞粘附。细胞对固定有RGD的底物的粘附可被可溶性RGD竞争性抑制，说明细胞粘附受RGD敏感的细胞粘附受体所调节。
由于RGD是介导细胞与胞外基质粘附的多肽链，在材料表面直接固定RGD，制成受体专门性材料，可以促进受体介导的细胞对材料的粘附来提高其生物相容性。RGD可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自发形成一分子层，为与受体介导的细胞反应提供了位点，进而促进细胞粘附、伸展[18]。由于RGD独特的生物学特性，RGD正广泛用于固定在不可降解的高分子材料(聚对苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等)表面，以及生物可降解材料(如PLA等)表面[19]。
3.3.3 固定氨基酸及其衍生物 对某些细胞，材料表面固定基本氨基酸单分子聚合物，如聚赖氨酸和聚鸟氨酸，可以提高细胞的粘附性。通过共介结合氨基基团也影响细胞的粘附。在聚合物表面固定糖类物质，影响细胞粘附。碳酸酯用来固定在聚丙烯酰胺表面，使细胞易于粘附、生长。
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3.3.4 固定细胞生长因子 在材料表面固定生长因子，可以通过引发细胞粘附来促进细胞生长。胰岛素与粘附蛋白类(如FN、胶原)共同固定，诱导产生协同作用，使胰岛素活性增加。1992年Ito等发现，不同生长因子对细胞粘附和生长的影响有一定的特异性。白蛋白、γ-球蛋白缺乏促进细胞粘附、伸展和生长的活性，其原因在于成纤维细胞缺乏与之相互作用的受体。胰岛素有较高促细胞生长能力，FN有较高促细胞粘附能力，二者共同固定于材料表面，产生协同作用可增加胰岛素的活性。
3.4 材料表面几何性质
材料表面粗糙时，会使细胞与材料接触的表面积增加，以促进细胞在材料表面上的湿润作用[20]，从而影响细胞的粘附强度。材料表面存在微小的刻痕或其它微结构时，细胞粘附性增强[21]。通常细胞沿着表面纤维或刻痕取向粘附，形成接触引导(contact guidance)。成纤维细胞在表面微结构为1～8 μm时，细胞沿小凹槽定向排列。细胞粘附程度取决于凹槽的深度和间距。不同细胞在相同微结构表面粘附性不同[22]。
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具有“峰”和“谷”样结构的表面也影响细胞粘附性质。2～15 μm的聚二甲基硅氧烷表面微结构能最大限度地使巨噬细胞发生粘附。表面均匀分布有4 μm2或25 μm2的“峰”更适于成纤维细胞粘附，但100 μm2的“峰”或4、25及100 μm2的“谷”都不适于成纤维细胞粘附。
3.5 表面特化结构
采用微晶图技术(microlithographic technique)，在材料表面制成具有确定尺寸、形状及图案的粘附和非粘附区域，其中具有粘附性的特化区域称为粘附微岛(adhesive micro-islands)，可供单个细胞发生粘附。通过对粘附微岛大小改变及岛内修饰，可以控制细胞在材料表面上的粘附和伸展面积。对较小的粘附微岛(约500 μm2)，细胞能发生粘附但不能伸展；而对较大的粘附微岛(4 000 μm2)，细胞发生粘附和伸展的程度与单层培养没有差别。实验观察到，原代培养在具有特化结构表面上的鼠肝细胞，优先粘附到有FN裱衬的岛上，且细胞被岛的形状所限制，不能向周围非粘附性区域伸展[23]。通过表面化学修饰技术，可使特化结构表面带上有机功能基团或配体来实现表面构图[24]，也可使其具有各种程度的表面电荷、湿润性、表面自由能及对蛋白质吸附力[25]。这种方法为实现在细胞大规模培养中控制细胞粘附、形状及功能提供了一种新途径。特化结构表面提供了一种特有的能力以很高的密度来培养细胞，同时又可使每个细胞与邻近细胞相隔开，并使它们各自处于一个预先决定的位置。显然，把培养形成的具有预定形状与图形的细胞片层应用于组织工程中显得极其有价值。
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△ 国家自然科学基金(39830100)重点项目、国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室开放课题基金(98J01)资助课题
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