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编号:10222938
陶瓷样异种骨复合骨髓异位成骨的实验研究△
http://www.100md.com 《中国修复重建外科杂志》 1999年第1期
     作者:李彦林 杨志明

    单位:华西医科大学附属第一医院骨科(四川成都,610041)

    关键词:陶瓷样异种骨;骨髓;复合移植;异位成骨

    中国修复重建外科杂志/990112 【摘 要】 目的 了解陶瓷样异种骨(CXB)与骨髓(BM)复合移植的成骨作用。方法 将CXB与BM复合及单纯CXB植入兔的骶棘肌内,术后2、4、8、12、16及24周取出植入材料作组织学及组织化学检查,观察植入材料的成骨作用。结果 CXB与BM复合植入后2周开始有软骨和新骨生成,以后软骨逐渐钙化成骨,8周时出现髓腔,并随植入时间的延长,新骨生成增多,成骨更为典型。而单纯CXB植入后无新骨或软骨形成。结论 CXB与BM复合移植通过骨传导、骨诱导及提供成骨细胞或成软骨细胞而成骨,是一种理想的骨移植替代材料,可望在临床上用于骨缺损的修复。

    CERAMIC-LIKE XENOGENEIC BONE COMBINING WITH BONE MARROW
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    Li Yanlin, Yang Zhiming. Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu Sichuan, P.R. China 610041. E-mail: orthop @ public.cd.sc.cn

    【Abstract】 Objective This experimental study was aim to investigate the osteogenesis of ceramic-like xengeneic bone (CXB) combining with bone marrow (BM). Methods The CXB combining BM was implanted into the sacrospinalis muscle of rabbits, and CXB implanted alone was used as control. Eighteen Japanese rablits with longear were used. The size of CXB was 5 mm×5 mm×5 mm, and the implanted materials were taken out at 2、 4、 8、 12、 16 and 24 weeks after implantation. The histological and histochemical characteristics were investigated. Results There existed cartilage and new bone in the groups of CXB combining BM in 2 weeks. Later, be cartilage turned out to the bone and in eight weeks the medullary cavity appeared. However, as the time went on, new bone formation increased and typical osteogenesis could be found. While in the groups of CXB alone, no formation of new bone or cartilage was found. Conclusion The implantation of CXB combined with BM could result in new bone formation in the way of osteoconduation, osteoinduction, and providing, osteoblasts or chondroblasts. It could be an ideal bone substitute, and its clinical use in future seemed very hopeful.
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    【Key words】 Ceramic-like xenogeneic bone Bone marrow Composite transplantation Heterotopic osteogenesisThe Research is Supported by the Natural Sciences Foundation of China.

    研制理想的骨移植替代材料至今仍是骨科领域的一个重要课题。目前国内外研究的主要方向是将一些具有成骨或诱导成骨能力的物质与具有传导成骨能力的载体进行复合移植,从而能更好地修复骨缺损。我们将具有传导成骨的陶瓷样异种骨(ceramiclike xenogeneic bone, CXB)携带具有成骨作用的骨髓(bone marrow, BM)进行复合移植,对其成骨作用进行探讨,为临床应用提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 CXB的制备
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    按文献[1]的方法制备CXB,将制得的CXB(共72块,每块为5 mm×5 mm×5 mm)常规消毒后备用。

    1.2 实验动物及方法

    健康成年日本大耳白兔共18只,每只体重2.0~2.5 kg,雌雄不拘。随机分为六个组,即术后2、4、8、12、16及24周,每组3只,将各组兔用1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉后,局部除毛,无菌条件下,每只于两侧骶棘肌的近头侧和尾侧拟作四个小切口,切开背部皮肤,钝性分开骶棘肌,形成四个肌袋,用盐水纱布保护切口,用16号骨穿针于股骨大转子处抽取红骨髓1.0~1.5 ml,将此骨髓浸透两块CXB,分别植入左侧两肌袋内,作为实验侧;另两块不含骨髓的CXB分别植入右侧两肌袋内,作为对照侧。缝合肌膜以固定植入材料,常规缝合切口,术后肌肉注射抗生素,预防切口感染。动物常规饲养,定期处死作相关检查。

    1.3 观察方法
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    1.3.1 一般情况 术后各组动物的活动、进食及伤口愈合情况。

    1.3.2 组织学检查 将取出的植入材料用10%福尔马林液固定,常规石蜡制片,片厚约5 μm,HE染色,光镜观察并摄像记录。

    1.3.3 定量判断 为判断植入物成骨程度,参考Burwell所订标准,并结合组织学检查,拟出以下5个等级:0分 0~9%新骨形成;1分 10%~24%新骨形成;2分 25%~49%新骨形成;3分 50%~74%新骨形成;4分 75%~100%新骨形成。新骨形成百分数指占原植入物的百分数。因对照侧皆无新骨形成,按评分标准皆为0分,计算新骨形成比例意义不大,故未作评估。实验侧在不同时间均有新骨形成,故将每一标本连续作5张切片,HE染色后光镜下观察,计算新骨形成百分数的均值后,再按上述标准评分并记录。

    1.3.4 组织化学染色检查 将上述实验侧的标本制成5 μm厚切片,分别进行Masson染色、AB/AF染色[2]和碱性磷酸酶(ALP)染色[3],光镜观察并摄像记录。
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    2 结果

    2.1 一般情况

    术后各组动物的活动及进食均正常,伤口无红肿、渗液等炎性反应,Ⅰ期愈合。

    2.2 组织学检查

    实验侧 术后2~4周,可见血管和纤维组织长满CXB各个间隙,并可见大量梭形间充质细胞,其间有很多软骨细胞条索和团块,还可见片块状新骨(图1)。术后8~12周,新骨形成增多,骨髓腔开始形成,骨小梁尚不典型(图2)。术后16~24周,骨组织结构呈板层状,有的呈壳样,髓腔和骨小梁典型,形成典型的松质骨结构(图3),植入的CXB大部分被降解,为新骨组织所替代。

    对照侧 术后2~24周,可见血管和纤维组织由外逐渐向CXB内部间隙生长,随时间的延长,CXB大部分被降解吸收,为纤维组织替代,未见新骨组织生成(图4)。
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    2.3 定量判断

    各组实验侧的植入物成骨程度评分结果见附表。从附表可见,随着植入时间的延长,复合移植物成骨程度增加。

    附表 CXB与BM复合移植成骨程度评分结果

    Tab The osteogenic scores of CXB combined with BM implantation

    时间(周)Time (weeks)

    2

    4

    8

    12

    16
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    24

    分数

    0、1、2

    0、1、2

    2、2、2

    3、3、2

    3、3、3

    3、4、3

    Score

    0、1、1

    2、1、2

    3、2、2

    3、3、2
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    3、4、3

    4、4、3

    均值

    0.83

    1.33

    2.17

    2.67

    3.17

    3.50

    Average
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    图1 实验侧术后2周(HE ×100) 镜下可见很多软骨细胞条索和团块生成及大量梭形间充质细胞 图2 实验侧术后12周(HE ×100) 镜下可见有髓腔形成,内含有造血和脂肪细胞,骨小梁尚不典型 图3 实验侧术后24周(HE ×100) 镜下可见形成典型的松质骨结构 图4 对照侧术后24周(HE ×100) 镜下可见大部分CXB被降解吸收,为纤维组织替代,无新骨形成

    Fig 1 At the experimental side, two weeks after operation (HE ×100) Many pieces of cartilage cells and spindle-shaped mesenchymal cells were found, by light microscope Fig 2 At the experimental side, twelve weeks after operation (HE ×100) Medullary cavity had formed, which contained hemoblasts and adipocytes, but the trabculae was not typical, by light microscope Fig 3 At the experimental side, twenty-four weeks after operation (HE ×100) The typical cancellous bone had formed, by light microscope Fig 4 At the control side, twenty-four weeks after operation (HE ×100) A large part of CXB was degraded, resorbed and replaced by fibrous tissue, but there was'not any new formed bone, by light mocroscope
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    2.4 组织化学染色检查

    2.4.1 Masson染色 该染色可清楚显示复合移植物植入后早期活跃的骨软骨诱导成骨反应。无活力的CXB植骨支架呈桔红色,其特征为骨陷窝空虚,移植物孔洞及周围诱导产生的软骨灶呈深蓝色,软骨钙化为新骨组织后呈深红色,易于识别。术后2~4周,实验侧植入材料周围及间隙内可见大量血管和纤维组织长入,其间有大量呈条索状或片块状的软骨组织生成,偶可见少许骨组织(图5);术后8~12周,实验侧植入材料周围及间隙内软骨有部分钙化成骨组织,并可见髓腔(图6);术后16~24周,实验侧植入材料周围和间隙内的软骨已大部分钙化形成骨组织,骨小梁、髓腔典型,有的已形成典型松质骨结构(图7)。整个过程随着植入时间的延长,其成骨是由软骨逐渐钙化形成骨组织,且时间越长,成骨愈典型。

    2.4.2 AB/AF染色 该阳性染色定位于正向软骨细胞分化的间充质细胞、幼稚软骨细胞、成熟软骨细胞和肥大软骨细胞周围基质中的酸性粘多糖,并且阳性染色随着软骨细胞分化成熟而增强。切片内呈深紫色者为强硫酸化酸性粘多糖,呈紫色者为弱硫酸化酸性粘多糖,呈蓝色者为羧基化酸性粘多糖。术后2~4周,实验侧植入物中的酸性粘多糖染色最强(图8),以后随植入时间的延长,软骨逐渐钙化形成骨组织,酸性粘多糖阳性染色区逐渐减少或消失。
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    2.4.3 ALP染色 术后2~4周,实验侧植入材料中的ALP阳性颗粒稀疏地分布于幼稚软骨细胞的胞核之间,细胞外基质中的ALP活性很弱。当软骨细胞成熟肥大时,其胞核、胞浆和细胞外基质中的ALP阳性颗粒汇集成粗大的团块状(图9)。以后随着软骨细胞钙化成骨组织,ALP活性随之减少或消失。

    图5 实验侧术后2周(Masson染色 ×100) 镜下可见有大量片块状软骨生成,并可见大量血管纤维组织 图6 实验侧术后12周(Masson染色 ×100) 镜下可见部分软骨已钙化成骨组织,并可见髓腔形成 图7 实验侧术后16周(Masson染色 ×100) 镜下可见软骨已大部分钙化成骨组织 图8 实验侧术后4周(AB/AF染色 ×100) 镜下可见随着软骨细胞分化成熟,酸性粘多糖染色最强 图9 CXB与BM植入后4周(ALP染色 ×100) 镜下可见成熟的软骨组织中ALP活性较强
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    Fig 5 At the experimental side, two weeks after operation (Masson ×100) Many pieces of cartilage had formed, many blood vessels and fibrious tissue were found, by light mocroscope Fig 6 At the experimental side, twelve weeks after operation (Masson ×100)A part of cartilage had been calcified into bone tissue, and medullary cavity had formed, by light mocroscope Fig 7 At the experimental side, sixteen weeks after operation (Masson ×100) A large part of cartilage had been calcified into bone tissue, by light mocroscope Fig 8 At the experimental side, four weeks after operation (AB/AF ×100) The acid mucopolysaccharides stained most strongly when the cartilage cells differentiated mature, by light mocroscope Fig 9 Four weeks after CXB combined with BM implantation (ALP ×100) The ALP activity of the mature cartilage tissue was very strong, by light microscope
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    3 讨论

    3.1 异位骨化模型的评价

    异位骨化具有正位骨化的所有形态和代谢特性,包括骨髓形成[4]。实验性异位成骨是研究骨形成及骨代谢最有用的方法[5],而肌袋模型是常用的异位成骨模型之一,主要由于肌肉组织内含有很多间充质细胞,肌组织内对诱导物质(骨形态发生蛋白)产生应答的细胞多,诱导形成的新骨量就多;其次,肌肉内含有丰富的血液供应,移植到肌组织内的具有成骨能力的细胞易成活,从而能很好地成骨;第三,肌肉组织在正常条件下不形成骨组织,若采用适当方法使肌内成骨,则容易解释新骨形成的细胞来源。我们采用兔肌内植入,结果发现单纯植入CXB未见新骨形成,而CXB复合BM植入则有新骨形成,说明骨形成的细胞来源于骨髓。

    3.2 CXB植入对局部成骨的作用

    1966年Burwell研究发现,未复合自体骨髓的除去有机质的骨植入鼠的背部肌肉内无新骨形成,认为除去有机质的骨不具有骨诱导能力。在我们的实验中,将单纯CXB植入兔的骶棘肌内,术后2~24周的组织学观察发现虽然有毛细血管和纤维组织长入CXB内,但无新骨形成,而CXB复合BM后移植则有新骨形成。说明CXB无成骨或诱导成骨作用,可能仅为新骨的生长提供支架,发挥传导成骨作用。
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    3.3 CXB与BM复合移植的成骨作用

    在我们的实验中,将CXB与BM复合异位移植后2周有软骨和新骨形成,以后软骨逐渐钙化成骨,8周时出现髓腔,并随时间的延长,成骨量增多,成骨更典型,而单纯CXB植入则无新骨或软骨形成。我们认为,CXB与BM复合移植的成骨能力来源于红骨髓中的细胞成分:一方面,移植后骨髓中的成骨细胞和成软骨细胞直接形成骨和软骨;另一方面,骨髓中未分化的间充质细胞在各种诱导因子或刺激因子的作用下,向成骨或成软骨细胞分化,进而形成骨或软骨[6]。CXB作为复合移植的支架,其天然多孔网状结构具有宽大的内部空间和表面积,吸入或容纳大量骨髓,使植入局部有较高的骨髓细胞浓度,为骨髓成骨提供有利场所和条件,发挥着传导成骨作用。因此,CXB与BM复合移植通过骨传导、骨诱导及提供成骨或成软骨细胞而成骨。

    3.4 CXB与BM复合移植的应用前景

    CXB的原材料来源广泛,其制备条件要求不高,又具有天然的网状孔隙系统,解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙交通及孔径大小等方面的制作难题[1],而骨髓采集方便、安全、创伤小及供区无明显并发症等优点,将两者复合移植,既能为成骨提供成骨细胞和诱导物质,又能为骨生长提供支架。因此,CXB与BM复合移植是一种较理想的骨移植材料,有可能用于各种良性肿瘤或瘤样病变清除后形成的骨缺损修复。
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    △ 国家自然科学基金(39830100)重点项目资助课题

    4 参考文献

    [1] 李彦林,曾才铭,王宏邦等.陶瓷样异种骨的制备及复合骨髓移植成骨的实验研究.中国修复重建外科杂志,1998;12(2):94

    [2] 凌启波编著.实用病理特殊染色和组化技术.广州:广东高等教育出版社,1989:228~229

    [3] 吴世祥,刘瑞萱.脱钙骨石蜡切片钙钴法碱性磷酸酶染色.中国肿瘤临床,1992;19(1):47

    [4] Wlodarski KH. Heterotopic bone marrow formation in xenogeneic implants of insoluble bone matrix gelatin. Clin Orthop, 1982;171(11):210

    [5] Ekelund A, Brosjo O, Nilsson OS. Experimental induction of heterotopic bone. Clin Orthop, 1991;263(2):102

    [6] Goshima J, Goldberg VM, Caplan AI. The osteogenic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop, 1991;262(1):298, 百拇医药