血卟啉衍生物静脉注射后在皮肤中分布的实验研究
作者：王钺 崔成军 谢维佳 周慧珠 朱葆华
单位：王钺 崔成军 谢维佳 周慧珠 朱葆华(江苏省锡山市人民医院皮肤科214011)
关键词：血卟啉衍生物；皮肤；显微镜检查，荧光
中国激光医学杂志990108摘要
目的 探讨鲜红斑痣光动力学疗法中血卟啉衍生物(HpD)的理想剂量和理想照光时间。
方法 5组实验用新西兰白兔(每组6只)分别按2、3、5、7、10 mg/kg静脉注射HpD，采用快速冰冻切片技术，于荧光显微镜下观察不同时间HpD在真皮血管内、真皮血管外间质和表皮的分布情况。
结果 HpD在真皮浅层血管内出现时间，2、3 mg/kg二组为15 min，5、7、10 mg/kg三组为5 min；HpD在真皮血管外间质出现时间，各组依次为60、60、30、15、5 min；HpD在表皮出现时间，3、5、7、10 mg/kg各组依次为90、60、30、5 min，2 mg/kg组观察至120 min未出现。
, 百拇医药
结论 运用光动力学疗法治疗鲜红斑痣的剂量应掌握在3～5 mg/kg之间，注射完毕后即可开始照光，3 mg/kg时照光时间不宜超过90 min， 5 mg/kg时不宜超过60 min。
A Fluorescence Microscopic Observation on the Distribution of HpD in the Skin of Normal Rabbits
WANG Yue, CUI Chengjun, XIE Weijia, ZHOU Huizhu, ZHU Baohua
Department of Dermatology, People's Hospital of Xishan City, Jiangsu Province, Xishan 214011
ABSRTACT
, 百拇医药
Objective To seeking the proper dosage of hematoporphyrin derivative (HpD) and proper therapy time of photodynamic therapy of portwine stains.
Methords Six rabbits each in five groups received intraveneously injected 2, 3, 5, 7 and 10 mg/kg of HpD, respectively. 5, 15, 30, 60, 90 and 120 min later skin samples were taken from the dorsal area and cryosections were prepared. The HpD distribution in the dermal vasculature, dermal interstitial tissue and epidermis was examined by fluorescence microscopy. The wavelength of excitation light was 405 nm.
, 百拇医药
Results The time of appearance of HpD fluorescence in dermal superficial vasculature was 15 min in the 2 and 3 mg/kg groups and 5 min in the 5, 7 and 10 mg/kg groups. Appearance of fluorescence in dermal interstitial tissue was 60, 60, 30, 15 and 5 min in the 2, 3, 5, 7 and 10 mg/kg groups, respectively. The appearance of fluorescence in the epidermis was 90, 60, 30 and 5 min in the 3, 5, 7 and 10 mg/kg groups, respectively. No fluorescence at all was observed in the epidermis in the 2 mg/kg group up to 120 min after HpD injection.
, 百拇医药
Conclusions If photodynamic therapy is applied to treat the portwine stains, the proper dosage of HpD should be 3-5 mg/kg and the irradiation may be carried out immediately after i.v. injection of HpD. The exposure time should be limited to 90 minutes at the HpD dose of 3 mg/kg, or 60 min at the HpD dose of 5 mg/kg.
Key words Hematoporphyrin derivative; Skin; Microscopy, fluorescence
光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣已成功应用于临床[1,2]。为了进一步提高疗效，为临床治疗选择最佳血卟啉衍生物(HpD)剂量及最佳照光时间提供科学的参考依据，我们观察了家兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间皮肤中HpD的分布状况。
, 百拇医药
材料与方法
一、实验材料
1.实验动物 体重2.0 kg±0.13 kg(
±s)的新西兰白兔30只，雌雄不限。中国医学科学院皮肤病研究所动物室提供。
2.HpD 江苏武警总队医院提供，批号950310，含量5 mg/ml，-20℃避光保存。
3.仪器 日本Olympus BH-2型荧光显微镜，美国AO冰冻切片机。
二、实验方法
刮除兔背脊两侧兔毛，按注射剂量随机分为2 mg/kg组、3 mg/kg组、5 mg/kg组、7 mg/kg组、10 mg/kg组，共5组，每组6只。根据所定剂量于兔耳静脉快速推注HpD，推注开始起计时，分别于5、15、30、60、90、120 min在兔背中部脊柱两侧依次用4 mm角膜钻孔器钻取兔皮，立即以冷冻保护剂OCT包埋，迅速移入-20℃恒冷冻箱中切片，置于激发光波长为405 nm的荧光显微镜下观察HpD在真皮血管内、真皮血管外间质及表皮的分布状况。
, 百拇医药
三、观察标准
镜下观察HpD在波长为405 nm光源激发下可出现桔红色荧光[3]。
-：镜下未见桔红色荧光。
+：镜下见散在分布点状桔红色荧光，每个视野(×200)少于10点。
++：镜下见点状分布桔红色荧光每个视野大于10点，或见小片状桔红色荧光。
+++：镜下见弥漫分布桔红色荧光。
结果
2 mg/kg组：注射后5 min真皮深部血管内见桔红色荧光，15 min真皮浅层血管内见到荧光，60 min真皮血管外间质见点状荧光。
, 百拇医药
3 mg/kg组：注射后5 min真皮深部血管内见到荧光，15 min见于真皮浅层血管内，60 min出现于真皮血管外间质，90 min真皮间质及毛囊周围见小片荧光，表皮内见到点状分布。
5 mg/kg组：注射后5 min真皮深、浅层血管内均见荧光，30 min真皮血管外间质见有点状荧光，60 min真皮、表皮均见点状荧光。
7 mg/kg组：注射后5 min真皮深、浅血管内均出现荧光，15 min真皮血管外间质、毛囊周围见到小片状荧光，30 min出现于表皮。
10 mg/kg组：注射后5 min真皮和表皮均见片状荧光。
各组HpD荧光在真皮和表皮的分布状况见表1、2。
表1 新西兰白兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间HpD在真皮中的分布情况
, http://www.100md.com
Tab.1 The vascular and perivascular distribution of HpD in dermis at different times after i.v. injection of HpD in different doses HpD剂量
HpD dosage
(mg/kg)
兔数
rabbit number
HpD荧光强度
HpD fluorescence intensity
5 min
15 min
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30 min
60 min
90 min
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注：括号内数字为阳性兔数 The numbers in parentheses indicate the positive cases
表2 新西兰白兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间HpD在表皮中的分布情况
Tab.2 The distribution of HpD in epidermis at different times after i.v. injection of HpD in different doses HpD剂量
HpD dosage
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兔数
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HpD荧光强度
HpD fluorescence intensity
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注：括号内数字为阳性兔数 The numbers in parentheses indicate the positive cases讨论
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光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的机理，是静脉注射HpD后可在血液中形成较高浓度，一定时间内血管内外有较大的浓度差，皮肤血管内皮细胞吸收的HpD远远高于真皮血管外间质和表皮细胞，此时对患处给予适当剂量特定波长的激光照射，该处血管内皮细胞因吸收HpD较多可产生强烈光敏反应而变性坏死，真皮血管外间质与表皮细胞因不含或较少含有HpD，故不产生或仅产生轻微可恢复的光敏损伤，从而既有效地破坏畸形扩张的毛细血管网，又完好地保留覆盖其上的表皮及周围的真皮组织，实现治疗目的而不留瘢痕[4,5]。由此可知，除激光波长及功率外，HpD的剂量及恰当的照光时间亦是影响疗效的重要因素。本实验显示，HpD由真皮血管内向血管外间质及表皮的扩散速度与给药剂量有关，随着剂量的递增，进入真皮间质及表皮的速度相应加快，同一时间内HpD在真皮间质及表皮的分布范围相应扩大，荧光强度相应增加。如治疗中用药剂量过大，HpD迅速进入真皮血管外间质及表皮，会增加治疗的危险性；而剂量偏小，则不能引起足够的光敏反应来破坏患处畸形扩张的毛细血管网。本实验的结果提示，3～5 mg/kg是比较理想的剂量范围，这与顾瑛等[1]的报道大致相符。提示静脉注射完毕后即可开始照光，当HpD剂量为3 mg/kg时，照光时间不宜超过90 min；5 mg/kg时，照光时间不宜超过60 min。
, 百拇医药
致谢 本实验承中国医学科学院皮肤病研究所孙建方、曾学思教授指导，桑红桂技师协助，特此致谢。
参考文献
[1]顾瑛，李峻亨，江亿平，等.光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的临床研究. 附40例报告.中国激光医学杂志，1992, 1∶6-10.
[2]陈关金，石昌年，胡振昌，等.溴化亚铜脉冲激光光动力学疗法治疗鲜红斑痣.中华皮肤科杂志，1994, 27∶373-374.
[3]杨国亮.皮肤病学.上海：上海医科大学出版社，1992.559-562.
[5]顾瑛，李峻亨，江亿平，等.光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的机制探讨.中国激光医学杂志，1992, 3∶141-144.
[5]Dougherty TJ, Gomer CJ, Weishaupt KR. Energetics and efficiency of photoinactivation of murine tumor cells containing hematoporphyrin. Cancer Res, 1976, 36:2330-2333.
(收稿日期：1998-02-01), 百拇医药
单位：王钺 崔成军 谢维佳 周慧珠 朱葆华(江苏省锡山市人民医院皮肤科214011)
关键词：血卟啉衍生物；皮肤；显微镜检查，荧光
中国激光医学杂志990108摘要
目的 探讨鲜红斑痣光动力学疗法中血卟啉衍生物(HpD)的理想剂量和理想照光时间。
方法 5组实验用新西兰白兔(每组6只)分别按2、3、5、7、10 mg/kg静脉注射HpD，采用快速冰冻切片技术，于荧光显微镜下观察不同时间HpD在真皮血管内、真皮血管外间质和表皮的分布情况。
结果 HpD在真皮浅层血管内出现时间，2、3 mg/kg二组为15 min，5、7、10 mg/kg三组为5 min；HpD在真皮血管外间质出现时间，各组依次为60、60、30、15、5 min；HpD在表皮出现时间，3、5、7、10 mg/kg各组依次为90、60、30、5 min，2 mg/kg组观察至120 min未出现。
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结论 运用光动力学疗法治疗鲜红斑痣的剂量应掌握在3～5 mg/kg之间，注射完毕后即可开始照光，3 mg/kg时照光时间不宜超过90 min， 5 mg/kg时不宜超过60 min。
A Fluorescence Microscopic Observation on the Distribution of HpD in the Skin of Normal Rabbits
WANG Yue, CUI Chengjun, XIE Weijia, ZHOU Huizhu, ZHU Baohua
Department of Dermatology, People's Hospital of Xishan City, Jiangsu Province, Xishan 214011
ABSRTACT
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Objective To seeking the proper dosage of hematoporphyrin derivative (HpD) and proper therapy time of photodynamic therapy of portwine stains.
Methords Six rabbits each in five groups received intraveneously injected 2, 3, 5, 7 and 10 mg/kg of HpD, respectively. 5, 15, 30, 60, 90 and 120 min later skin samples were taken from the dorsal area and cryosections were prepared. The HpD distribution in the dermal vasculature, dermal interstitial tissue and epidermis was examined by fluorescence microscopy. The wavelength of excitation light was 405 nm.
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Results The time of appearance of HpD fluorescence in dermal superficial vasculature was 15 min in the 2 and 3 mg/kg groups and 5 min in the 5, 7 and 10 mg/kg groups. Appearance of fluorescence in dermal interstitial tissue was 60, 60, 30, 15 and 5 min in the 2, 3, 5, 7 and 10 mg/kg groups, respectively. The appearance of fluorescence in the epidermis was 90, 60, 30 and 5 min in the 3, 5, 7 and 10 mg/kg groups, respectively. No fluorescence at all was observed in the epidermis in the 2 mg/kg group up to 120 min after HpD injection.
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Conclusions If photodynamic therapy is applied to treat the portwine stains, the proper dosage of HpD should be 3-5 mg/kg and the irradiation may be carried out immediately after i.v. injection of HpD. The exposure time should be limited to 90 minutes at the HpD dose of 3 mg/kg, or 60 min at the HpD dose of 5 mg/kg.
Key words Hematoporphyrin derivative; Skin; Microscopy, fluorescence
光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣已成功应用于临床[1,2]。为了进一步提高疗效，为临床治疗选择最佳血卟啉衍生物(HpD)剂量及最佳照光时间提供科学的参考依据，我们观察了家兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间皮肤中HpD的分布状况。
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材料与方法
一、实验材料
1.实验动物 体重2.0 kg±0.13 kg(
±s)的新西兰白兔30只，雌雄不限。中国医学科学院皮肤病研究所动物室提供。2.HpD 江苏武警总队医院提供，批号950310，含量5 mg/ml，-20℃避光保存。
3.仪器 日本Olympus BH-2型荧光显微镜，美国AO冰冻切片机。
二、实验方法
刮除兔背脊两侧兔毛，按注射剂量随机分为2 mg/kg组、3 mg/kg组、5 mg/kg组、7 mg/kg组、10 mg/kg组，共5组，每组6只。根据所定剂量于兔耳静脉快速推注HpD，推注开始起计时，分别于5、15、30、60、90、120 min在兔背中部脊柱两侧依次用4 mm角膜钻孔器钻取兔皮，立即以冷冻保护剂OCT包埋，迅速移入-20℃恒冷冻箱中切片，置于激发光波长为405 nm的荧光显微镜下观察HpD在真皮血管内、真皮血管外间质及表皮的分布状况。
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三、观察标准
镜下观察HpD在波长为405 nm光源激发下可出现桔红色荧光[3]。
-：镜下未见桔红色荧光。
+：镜下见散在分布点状桔红色荧光，每个视野(×200)少于10点。
++：镜下见点状分布桔红色荧光每个视野大于10点，或见小片状桔红色荧光。
+++：镜下见弥漫分布桔红色荧光。
结果
2 mg/kg组：注射后5 min真皮深部血管内见桔红色荧光，15 min真皮浅层血管内见到荧光，60 min真皮血管外间质见点状荧光。
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3 mg/kg组：注射后5 min真皮深部血管内见到荧光，15 min见于真皮浅层血管内，60 min出现于真皮血管外间质，90 min真皮间质及毛囊周围见小片荧光，表皮内见到点状分布。
5 mg/kg组：注射后5 min真皮深、浅层血管内均见荧光，30 min真皮血管外间质见有点状荧光，60 min真皮、表皮均见点状荧光。
7 mg/kg组：注射后5 min真皮深、浅血管内均出现荧光，15 min真皮血管外间质、毛囊周围见到小片状荧光，30 min出现于表皮。
10 mg/kg组：注射后5 min真皮和表皮均见片状荧光。
各组HpD荧光在真皮和表皮的分布状况见表1、2。
表1 新西兰白兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间HpD在真皮中的分布情况
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Tab.1 The vascular and perivascular distribution of HpD in dermis at different times after i.v. injection of HpD in different doses HpD剂量
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表2 新西兰白兔静脉注射不同剂量HpD后不同时间HpD在表皮中的分布情况
Tab.2 The distribution of HpD in epidermis at different times after i.v. injection of HpD in different doses HpD剂量
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光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的机理，是静脉注射HpD后可在血液中形成较高浓度，一定时间内血管内外有较大的浓度差，皮肤血管内皮细胞吸收的HpD远远高于真皮血管外间质和表皮细胞，此时对患处给予适当剂量特定波长的激光照射，该处血管内皮细胞因吸收HpD较多可产生强烈光敏反应而变性坏死，真皮血管外间质与表皮细胞因不含或较少含有HpD，故不产生或仅产生轻微可恢复的光敏损伤，从而既有效地破坏畸形扩张的毛细血管网，又完好地保留覆盖其上的表皮及周围的真皮组织，实现治疗目的而不留瘢痕[4,5]。由此可知，除激光波长及功率外，HpD的剂量及恰当的照光时间亦是影响疗效的重要因素。本实验显示，HpD由真皮血管内向血管外间质及表皮的扩散速度与给药剂量有关，随着剂量的递增，进入真皮间质及表皮的速度相应加快，同一时间内HpD在真皮间质及表皮的分布范围相应扩大，荧光强度相应增加。如治疗中用药剂量过大，HpD迅速进入真皮血管外间质及表皮，会增加治疗的危险性；而剂量偏小，则不能引起足够的光敏反应来破坏患处畸形扩张的毛细血管网。本实验的结果提示，3～5 mg/kg是比较理想的剂量范围，这与顾瑛等[1]的报道大致相符。提示静脉注射完毕后即可开始照光，当HpD剂量为3 mg/kg时，照光时间不宜超过90 min；5 mg/kg时，照光时间不宜超过60 min。
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致谢 本实验承中国医学科学院皮肤病研究所孙建方、曾学思教授指导，桑红桂技师协助，特此致谢。
参考文献
[1]顾瑛，李峻亨，江亿平，等.光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的临床研究. 附40例报告.中国激光医学杂志，1992, 1∶6-10.
[2]陈关金，石昌年，胡振昌，等.溴化亚铜脉冲激光光动力学疗法治疗鲜红斑痣.中华皮肤科杂志，1994, 27∶373-374.
[3]杨国亮.皮肤病学.上海：上海医科大学出版社，1992.559-562.
[5]顾瑛，李峻亨，江亿平，等.光动力学疗法选择性治疗鲜红斑痣的机制探讨.中国激光医学杂志，1992, 3∶141-144.
[5]Dougherty TJ, Gomer CJ, Weishaupt KR. Energetics and efficiency of photoinactivation of murine tumor cells containing hematoporphyrin. Cancer Res, 1976, 36:2330-2333.
(收稿日期：1998-02-01), 百拇医药