乳腺癌患者外周血多项免疫指标的流式细胞仪检测及其临床意义
作者：杨金巧 赵俊玲 范伟
单位：华西医科大学附属第一医院
关键词：乳腺癌；流式细胞仪；免疫检测
华西医学990120 摘要：通过用流式细胞仪检测不同临床分期的乳腺癌患者术前术后外周血中多项免疫指标：CD+3 ，CD+4 ，CD+8 ，CD+19 ，CD+16的淋巴细胞及rδT细胞所占比例，了解不同临床分期的患者免疫功能状态及其术前术后的变化。结果表明：乳癌患者免疫功能普遍紊乱，特别是细胞免疫功能明显低下，临床分期越晚，这种表现越明显，而术后患者免疫功能有一定改善，因而，流式细胞仪测定上述多项免疫指标，对了解乳腺癌患者病情发展及预后转归有一定的临床意义。
, http://www.100md.com
〔中图分类号〕R737.9
〔文献标识码〕A
Immunodetections of Breast Cancer Patients by Flow Cytometry and Its
Clinical Significance
YANG Jin-giao，ZHAO Jun-ling，FAN Wei
First University Hospital，West China University of medical Sciences，Chengdu，610041.
Abstract：In order to compare the immune conditions of the patients with breast cancer at different clinical stages and the changes of immune conditions before and after operations，immunodetections were performed by FCM.The numbers of CD+3，CD+4，CD+8，CD+19，CD+16cells and rδT cells in the peripheral blood were determined.The results showed that the immune conditions of breast cancer patientsr were lower and in disorder，especially the cellular immunity.As in the progress of the disease，the changes were more distinctive.The immnue coditions had some improvement after operation.So，FCM analysis of immune conditions of breast cancer patients might have important clinical values in prognosis evaluation.
, 百拇医药
Key words：Breawt Cancer；FCM；Immunodetections
肿瘤患者往往有免疫功能状态紊乱和低下，而免疫功能状态在一定程度上可预示肿瘤的发展，预后〔1〕。近几年，随着新的对免疫功能检测手段的发展，对肿瘤患者可根据相应的免疫指标作出初步的预后判断，并指导治疗，观察转归，具有较大的临床意义〔2～4〕。本研究利用流式细胞仪(FCM)快速、灵活、定量的特点，检测了36例乳腺癌患者术前术后的外周血中T细胞亚群，B细胞，NK细胞功能及T细胞受体表达水平等免疫指标，并结合临床分期，综合分析了乳腺癌患者的免疫功能状态及其临床意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象：36例乳腺癌患者，经病理活检证实诊断。年龄31～74岁，平均年龄44岁；性别：女；病理类型为浸润性导管癌25例，粉刺癌2例，粘液腺癌4例，其它5例，36例患者包括临床各期病例；正常对照组为健康女性20人，20～50岁，平均年龄36.6岁。
, 百拇医药
1.2 实验材料：单克隆抗体均购于法国免疫公司，流式细胞仪购于美国Coulter公司。
1.3 检测方法：特异性单抗免疫荧光检测，检测条件：取血1小时内处理完成，室温，肝素浓度50u/ml。
2 结果
2.1 乳腺癌患者外周血T细胞亚群的分布及T细胞受体表达水平的比较，见表1。
表1.乳腺癌患者外周血T细胞亚群及T细胞受体表达水平的比较
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
, 百拇医药
CD+4/CD+8
rδT(%)
rδT/CD+3
正常对照
68.23±11.99
41.53±11.09
27.30±10.77
1.56±0.63
5.20±2.11
0.08±0.03
, http://www.100md.com
乳癌患者
55.26±14.75
26.18±9.34
28.45±10.27
1.11±0.78
4.82±2.98
0.09±0.04
P值
<0.001
<0.001
>0.5
<0.01
, http://www.100md.com
>0.05
>0.05
可见，乳腺癌患者T细胞总数及CD+4亚群均明显低于正常对照组，且有统计学意义；CD+4/CD+8比值也明显下降，甚至有61.11%(22/36)的患者出现CD4/CD8倒置现象，而rδΤ细胞虽然有轻度下降，而rδΤ/CO3有轻度升高，但均无统计学意义。
2.2 乳腺癌患者外周血B细胞(CD+19)的分布情况比较：正常对照组为14.02±4.52，乳腺癌组为18.5±10.68，P<0.05，有统计学意义。
2.3 乳腺癌患者外周血NK细胞(CD+16，CD+56)的分布情况比较(表2)。
, 百拇医药
表2.乳腺癌患者外周血CD+16，CD+56及CD+16+CD+56NK细胞分布的比较
CD+16(%)
CD+56(%)
CD+16+CD+56(%)
正常对照
17.78±7.22
17.11±6.52
, http://www.100md.com
34.89±8.43
乳癌患者
15.58±10.08
15.92±10.56
32.80±11.23
P值
>0.05
>0.05
>0.05
上表说明，患者CD+16及CD+56NK细胞均有不同程度的降低，但与正常对照组相比其下降并无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.4 术前术后上述各项指标的变化(表3)。表3.术前术后多项免疫指标的变化比较
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD+4/CD+8
rδT(%)
CD+56(%)
术前
, 百拇医药
55.26±14.75
26.18±9.34
28.45±10.27
1.11±0.78
4.82±2.98
15.92±10.56
术后
60.32±9.88
54±10.01
27.23±8.20
1.46±0.86
5.01±2.24
, 百拇医药
16.08±9.98
P值
<0.05
<0.01
>0.05
<0.05
>0.05
>0.05
*：说明：本表为简明起见，术前术后的原始数据未列出，但实际上采用了配对资料t检验的统计方法
结果表明，术后患者CD+3，CD+4的细胞水平及CD4/CD8均有统计学意义上的升高，而rδΤ细胞及CD+56NK细胞有轻度升高，但无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.5 临床分期与各项免疫指标变化的关系(见表4)。
表4.临床分期与各项免疫指标变化的关系，直接列出比较的P值 细胞类型分布
CD+3(%)
CD+4(%)
CD4/CD+8
rδT/CD3
CD+56
临床分期
Ⅰ和Ⅱ期
, 百拇医药
P>0.05
P<0.05
P<0.05
P>0.05
P>0.05
Ⅰ和Ⅲ期
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P>0.05
P>0.05
Ⅰ和Ⅳ期
, http://www.100md.com P<0.01
P<0.001
P<0.001
P<0.05
P<0.05
Ⅱ和Ⅳ期
P>0.05
P<0.01
P<0.05
P>0.05
P>0.05
Ⅲ和Ⅳ期
P>0.05
, http://www.100md.com
P<0.05
P<0.05
P>0.05
P>0.05
可见，随临床分期不同，较敏感的CD+3，CD+4细胞比例，CD+4/CD+8等指标均有明显改变，越晚期患者，机体免疫功能紊乱状态，特别是T细胞亚群分布失调越严重，预后也越差。
3 讨论
3.1 一般认为，肿瘤免疫是以T细胞为核心，多种细胞及体液因素共同参与的宿主对肿瘤的抵抗消灭过程，T细胞是高度异质性群体，根据其表型和功能不同分为若干亚群，(TC，TS，TI，TH，TD)，根据其表面抗原受体不同分为2βT细胞的rδT细胞，通过对T细胞分化抗原(分化群，cluster of differentiation，CD)的研究，可以鉴定T细胞亚群，CD2和CD3是所有T细胞表面的共同标志，CD4和CD8分别存在于Ti/TH和Ts/Tc表面，CD4/CD8的比值不仅能直接反映出宿主T细胞亚群的紊乱状态，且一定程度上可间接了解机体细胞免疫功能情况〔1，5〕。T细胞受体rδ表型细胞是新近发现的T淋巴细胞亚群，在外周血淋巴细胞中所占比例虽然很小，(正常人该比例为3%～10%)，但通过对其分布，性质，功能，结构的较深入研究，发现rδT细胞可分泌多种细胞因子，且其抗原识别为MHC非限制性，在肿瘤免疫中具有广谱的重要的抗肿瘤效应。有研究表明：从肿瘤组织中分离出的rδT细胞对人乳腺癌MCF-1细胞株确实有明显的细胞毒性作用〔6，7〕。NK细胞是细胞免疫的非特异成份，其表面标志主要是CD16和CD56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降揭示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能相应下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞的作用〔1，5〕。CD19作为全B细胞表面标志，在B细胞活化后不消失，在外周血中的正常分布为8%～15%，通过CD+19B细胞的检测，可一定程度上反映出机体体液免疫功能状态〔1，5〕。
, 百拇医药
3.2 本研究的结果表明：①乳腺癌患者外周血中T细胞比例下降，以CD+4者为主，CD4/CD8下降明显，T细胞亚群分布严重失调，辅助性T细胞明显减少，说明患者伴有细胞免疫水平的明显降低。②手术对机体的免疫状态有一定程度的改善。③CD+19B细胞有相对的增多，因肿瘤免疫以T细胞为中心，因而体液免疫受抑制程度相对少些。④NK细胞在乳腺癌患者中无统计学意义的改变，可能因CD+16，CD+56NK细胞的数目变化与NK的活性之间的相关性受多种因素的影响，或因乳癌患者NK细胞改变不太明显，不过，在临床分期有明显早、晚之分时，CD+56NK细胞出现了较明显的差别，晚期患者较早期者数目下降，说明其细胞免疫功能相应下降。⑤临床分期越晚的患者，免疫功能状态越差。⑥rδT细胞在乳腺癌患者中无统计学意义的改变，可能因其含量少，检测手段不够敏感，或因研究例数尚少，未得出有意义结论，因而仍不能否定其在肿瘤免疫中的作用，而且，因从肿瘤中分离出的TIL所含的rδT细胞与外周血中者有不同的T细胞受体谱〔6〕，因而可能对肿瘤组织中rδT细胞的研究会更有意义。
, 百拇医药
3.3 机体的免疫功能状态低下虽不是肿瘤的发生始动因素，但一旦发生，机体免疫状态对肿瘤的发展，转归就具有重要的作用，肿瘤患者免疫功能较好者，预后相对较好，晚期或广泛转移者，往往免疫功能低下。因而，对免疫指标的检测有利于帮助判断病情，观察转归和指导治疗，具有一定的临床意义。
(本文曾蒙华西医科大学附一院肿瘤生物治疗中心和魏于全教授大力支持，特此致谢!)
参考文献
1.毕爱华，龚非力编：医学免疫学。北京：人民军医出版社，1995：12—248。
2.张鲁榕，孔宪涛，张浩等：流式细胞仪分析100例正常人T细胞亚群。上海免疫学杂志，1988；8(5)：367—368。
3.Vernon C，Maino A：Rapid flow cytonetric method for measuring lymphocyte subset activation.Cytometry，20(1)：127-133.
, http://www.100md.com
4.朱理玮，李克敏，薛承锐等：乳腺癌患者T细胞亚群变化的定量检测及其临床意义。中国肿瘤临床，1994；21(3)：209—213。
5.Gabriel.Introduction to medical immunolgy.USA.1991，583-589.
6.于松涛，何维，巴德年：T细胞受体rδ表型淋巴细胞与肿瘤免疫。国外医学免疫学分册，1997；2：57—60。
7.Alam SM，Clark JS，Leech V et al：T cell receptor r/δ expression on Lymphocyte populations of breast cancer patients.Immunol Lett，1992；31(2)：279-283
(Received date：1998-07-27)
(1998-07-27收稿), 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院
关键词：乳腺癌；流式细胞仪；免疫检测
华西医学990120 摘要：通过用流式细胞仪检测不同临床分期的乳腺癌患者术前术后外周血中多项免疫指标：CD+3 ，CD+4 ，CD+8 ，CD+19 ，CD+16的淋巴细胞及rδT细胞所占比例，了解不同临床分期的患者免疫功能状态及其术前术后的变化。结果表明：乳癌患者免疫功能普遍紊乱，特别是细胞免疫功能明显低下，临床分期越晚，这种表现越明显，而术后患者免疫功能有一定改善，因而，流式细胞仪测定上述多项免疫指标，对了解乳腺癌患者病情发展及预后转归有一定的临床意义。
, http://www.100md.com
〔中图分类号〕R737.9
〔文献标识码〕A
Immunodetections of Breast Cancer Patients by Flow Cytometry and Its
Clinical Significance
YANG Jin-giao，ZHAO Jun-ling，FAN Wei
First University Hospital，West China University of medical Sciences，Chengdu，610041.
Abstract：In order to compare the immune conditions of the patients with breast cancer at different clinical stages and the changes of immune conditions before and after operations，immunodetections were performed by FCM.The numbers of CD+3，CD+4，CD+8，CD+19，CD+16cells and rδT cells in the peripheral blood were determined.The results showed that the immune conditions of breast cancer patientsr were lower and in disorder，especially the cellular immunity.As in the progress of the disease，the changes were more distinctive.The immnue coditions had some improvement after operation.So，FCM analysis of immune conditions of breast cancer patients might have important clinical values in prognosis evaluation.
, 百拇医药
Key words：Breawt Cancer；FCM；Immunodetections
肿瘤患者往往有免疫功能状态紊乱和低下，而免疫功能状态在一定程度上可预示肿瘤的发展，预后〔1〕。近几年，随着新的对免疫功能检测手段的发展，对肿瘤患者可根据相应的免疫指标作出初步的预后判断，并指导治疗，观察转归，具有较大的临床意义〔2～4〕。本研究利用流式细胞仪(FCM)快速、灵活、定量的特点，检测了36例乳腺癌患者术前术后的外周血中T细胞亚群，B细胞，NK细胞功能及T细胞受体表达水平等免疫指标，并结合临床分期，综合分析了乳腺癌患者的免疫功能状态及其临床意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象：36例乳腺癌患者，经病理活检证实诊断。年龄31～74岁，平均年龄44岁；性别：女；病理类型为浸润性导管癌25例，粉刺癌2例，粘液腺癌4例，其它5例，36例患者包括临床各期病例；正常对照组为健康女性20人，20～50岁，平均年龄36.6岁。
, 百拇医药
1.2 实验材料：单克隆抗体均购于法国免疫公司，流式细胞仪购于美国Coulter公司。
1.3 检测方法：特异性单抗免疫荧光检测，检测条件：取血1小时内处理完成，室温，肝素浓度50u/ml。
2 结果
2.1 乳腺癌患者外周血T细胞亚群的分布及T细胞受体表达水平的比较，见表1。
表1.乳腺癌患者外周血T细胞亚群及T细胞受体表达水平的比较
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
, 百拇医药
CD+4/CD+8
rδT(%)
rδT/CD+3
正常对照
68.23±11.99
41.53±11.09
27.30±10.77
1.56±0.63
5.20±2.11
0.08±0.03
, http://www.100md.com
乳癌患者
55.26±14.75
26.18±9.34
28.45±10.27
1.11±0.78
4.82±2.98
0.09±0.04
P值
<0.001
<0.001
>0.5
<0.01
, http://www.100md.com
>0.05
>0.05
可见，乳腺癌患者T细胞总数及CD+4亚群均明显低于正常对照组，且有统计学意义；CD+4/CD+8比值也明显下降，甚至有61.11%(22/36)的患者出现CD4/CD8倒置现象，而rδΤ细胞虽然有轻度下降，而rδΤ/CO3有轻度升高，但均无统计学意义。
2.2 乳腺癌患者外周血B细胞(CD+19)的分布情况比较：正常对照组为14.02±4.52，乳腺癌组为18.5±10.68，P<0.05，有统计学意义。
2.3 乳腺癌患者外周血NK细胞(CD+16，CD+56)的分布情况比较(表2)。
, 百拇医药
表2.乳腺癌患者外周血CD+16，CD+56及CD+16+CD+56NK细胞分布的比较
CD+16(%)
CD+56(%)
CD+16+CD+56(%)
正常对照
17.78±7.22
17.11±6.52
, http://www.100md.com
34.89±8.43
乳癌患者
15.58±10.08
15.92±10.56
32.80±11.23
P值
>0.05
>0.05
>0.05
上表说明，患者CD+16及CD+56NK细胞均有不同程度的降低，但与正常对照组相比其下降并无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.4 术前术后上述各项指标的变化(表3)。表3.术前术后多项免疫指标的变化比较
CD+3(%)
CD+4(%)
CD+8(%)
CD+4/CD+8
rδT(%)
CD+56(%)
术前
, 百拇医药
55.26±14.75
26.18±9.34
28.45±10.27
1.11±0.78
4.82±2.98
15.92±10.56
术后
60.32±9.88
54±10.01
27.23±8.20
1.46±0.86
5.01±2.24
, 百拇医药
16.08±9.98
P值
<0.05
<0.01
>0.05
<0.05
>0.05
>0.05
*：说明：本表为简明起见，术前术后的原始数据未列出，但实际上采用了配对资料t检验的统计方法
结果表明，术后患者CD+3，CD+4的细胞水平及CD4/CD8均有统计学意义上的升高，而rδΤ细胞及CD+56NK细胞有轻度升高，但无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.5 临床分期与各项免疫指标变化的关系(见表4)。
表4.临床分期与各项免疫指标变化的关系，直接列出比较的P值 细胞类型分布
CD+3(%)
CD+4(%)
CD4/CD+8
rδT/CD3
CD+56
临床分期
Ⅰ和Ⅱ期
, 百拇医药
P>0.05
P<0.05
P<0.05
P>0.05
P>0.05
Ⅰ和Ⅲ期
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P>0.05
P>0.05
Ⅰ和Ⅳ期
, http://www.100md.com P<0.01
P<0.001
P<0.001
P<0.05
P<0.05
Ⅱ和Ⅳ期
P>0.05
P<0.01
P<0.05
P>0.05
P>0.05
Ⅲ和Ⅳ期
P>0.05
, http://www.100md.com
P<0.05
P<0.05
P>0.05
P>0.05
可见，随临床分期不同，较敏感的CD+3，CD+4细胞比例，CD+4/CD+8等指标均有明显改变，越晚期患者，机体免疫功能紊乱状态，特别是T细胞亚群分布失调越严重，预后也越差。
3 讨论
3.1 一般认为，肿瘤免疫是以T细胞为核心，多种细胞及体液因素共同参与的宿主对肿瘤的抵抗消灭过程，T细胞是高度异质性群体，根据其表型和功能不同分为若干亚群，(TC，TS，TI，TH，TD)，根据其表面抗原受体不同分为2βT细胞的rδT细胞，通过对T细胞分化抗原(分化群，cluster of differentiation，CD)的研究，可以鉴定T细胞亚群，CD2和CD3是所有T细胞表面的共同标志，CD4和CD8分别存在于Ti/TH和Ts/Tc表面，CD4/CD8的比值不仅能直接反映出宿主T细胞亚群的紊乱状态，且一定程度上可间接了解机体细胞免疫功能情况〔1，5〕。T细胞受体rδ表型细胞是新近发现的T淋巴细胞亚群，在外周血淋巴细胞中所占比例虽然很小，(正常人该比例为3%～10%)，但通过对其分布，性质，功能，结构的较深入研究，发现rδT细胞可分泌多种细胞因子，且其抗原识别为MHC非限制性，在肿瘤免疫中具有广谱的重要的抗肿瘤效应。有研究表明：从肿瘤组织中分离出的rδT细胞对人乳腺癌MCF-1细胞株确实有明显的细胞毒性作用〔6，7〕。NK细胞是细胞免疫的非特异成份，其表面标志主要是CD16和CD56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降揭示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能相应下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞的作用〔1，5〕。CD19作为全B细胞表面标志，在B细胞活化后不消失，在外周血中的正常分布为8%～15%，通过CD+19B细胞的检测，可一定程度上反映出机体体液免疫功能状态〔1，5〕。
, 百拇医药
3.2 本研究的结果表明：①乳腺癌患者外周血中T细胞比例下降，以CD+4者为主，CD4/CD8下降明显，T细胞亚群分布严重失调，辅助性T细胞明显减少，说明患者伴有细胞免疫水平的明显降低。②手术对机体的免疫状态有一定程度的改善。③CD+19B细胞有相对的增多，因肿瘤免疫以T细胞为中心，因而体液免疫受抑制程度相对少些。④NK细胞在乳腺癌患者中无统计学意义的改变，可能因CD+16，CD+56NK细胞的数目变化与NK的活性之间的相关性受多种因素的影响，或因乳癌患者NK细胞改变不太明显，不过，在临床分期有明显早、晚之分时，CD+56NK细胞出现了较明显的差别，晚期患者较早期者数目下降，说明其细胞免疫功能相应下降。⑤临床分期越晚的患者，免疫功能状态越差。⑥rδT细胞在乳腺癌患者中无统计学意义的改变，可能因其含量少，检测手段不够敏感，或因研究例数尚少，未得出有意义结论，因而仍不能否定其在肿瘤免疫中的作用，而且，因从肿瘤中分离出的TIL所含的rδT细胞与外周血中者有不同的T细胞受体谱〔6〕，因而可能对肿瘤组织中rδT细胞的研究会更有意义。
, 百拇医药
3.3 机体的免疫功能状态低下虽不是肿瘤的发生始动因素，但一旦发生，机体免疫状态对肿瘤的发展，转归就具有重要的作用，肿瘤患者免疫功能较好者，预后相对较好，晚期或广泛转移者，往往免疫功能低下。因而，对免疫指标的检测有利于帮助判断病情，观察转归和指导治疗，具有一定的临床意义。
(本文曾蒙华西医科大学附一院肿瘤生物治疗中心和魏于全教授大力支持，特此致谢!)
参考文献
1.毕爱华，龚非力编：医学免疫学。北京：人民军医出版社，1995：12—248。
2.张鲁榕，孔宪涛，张浩等：流式细胞仪分析100例正常人T细胞亚群。上海免疫学杂志，1988；8(5)：367—368。
3.Vernon C，Maino A：Rapid flow cytonetric method for measuring lymphocyte subset activation.Cytometry，20(1)：127-133.
, http://www.100md.com
4.朱理玮，李克敏，薛承锐等：乳腺癌患者T细胞亚群变化的定量检测及其临床意义。中国肿瘤临床，1994；21(3)：209—213。
5.Gabriel.Introduction to medical immunolgy.USA.1991，583-589.
6.于松涛，何维，巴德年：T细胞受体rδ表型淋巴细胞与肿瘤免疫。国外医学免疫学分册，1997；2：57—60。
7.Alam SM，Clark JS，Leech V et al：T cell receptor r/δ expression on Lymphocyte populations of breast cancer patients.Immunol Lett，1992；31(2)：279-283
(Received date：1998-07-27)
(1998-07-27收稿), 百拇医药