自体移植静脉内膜增生与内皮细胞vWf抗原表达
作者：钱济先 钱兆奇 黄耀添 王剑波
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所(钱济先，现为上海第二医科大学仁济医院血管外科)；安徽省宿县地区医院骨科(钱兆奇)；第四军医大学西京医院骨科(黄耀添)；第四军医大学西京医院病理科(王剑波)
关键词：
中华医学杂志990106 血管移植术后除内皮细胞外，中膜和外膜均可合成释放前列环素(PGI2) ，这给特异研究内皮细胞功能带来一定的局限性。自80年代以来，人们发现正常血管内皮细胞能合成Ⅷ因子，后被称之为von Willebrand factor(vWf)。迄今为止，有研究认为vWf仅由血管内皮细胞合成，因此，本实验采用vWF单抗在免疫组织化学及计算机辅助体视学基础上，探讨血管移植后内皮细胞形态及功能衍变及与内膜增生的量效关系。
一、材料与方法
, http://www.100md.com
1.动物分组及手术模型：健康中国本兔12只，雌雄不拘，体重(3.2±0.6) kg，用质量分数2.5%戊巴比妥钠(25 mg/kg 体重)肌注麻醉。切取双侧股静脉倒置移植到同侧股动脉，移植静脉长度为3.0 cm，确认移植血管通畅后，置于周围健康肌肉覆盖。术后1、2、4和16周分别取材，取材的部位在移植静脉的中份，标本立即置于质量分数为4%多聚甲醛固定，以备观察用。正常动脉(A)、静脉(V)作为对照组。
2.观察指标：(1)vWf免疫组织化学：vWf单抗购于珠海Dako(丹麦)基因科技公司，组织切片厚约5 μm，经脱蜡、水洗和酶消化后按免疫组织化学(ABC法)有关步骤进行。单抗的工作浓度为1/50。(2)阳性细胞指数的真彩扫描仪微机图像分析：阳性染色的组织切片经镜检确认后，置40×10倍下行显微摄影，每个标本选4个视野(所有资料均同批处理)。照片再经真彩扫描仪(Microtek Scanmaker E6,Taiwan)扫描后输入图像分析系统，根据阳性染色之色调行色彩分割， 再提取该色调在视野中的面积并计算阳性染色细胞(棕褐色)占整个新生内膜中面积的百分比(即为阳性细胞指数)，取平均值计算。
, 百拇医药
二、结果
正常A、V内皮细胞均可见较高的阳性抗原表达，术后1周移植血管内膜轻度增生，内皮细胞可见阳性染色(图1)，抗原表达主要在胞浆内，此期的阳性细胞主要位于内皮下层，仅个别阳性细胞位于移植静脉的中膜。阳性细胞指数为(8.91±0.30)%(图2)，与正常A、V相比差异有显著意义(P<0.05)。术后2周时未见明显的阳性细胞染色，仅于内皮细胞胞浆和细胞外基质可见极弱的阳性抗原表达。4～16周内膜增生明显，但未见阳性染色细胞。实验还发现，移植静脉内皮细胞形态发生了改变，呈现柱状垂直于或成角于血流方向的排列。
图1 术后1周转移血管内皮细胞vWF阳性染色呈褐色 ×320
图2 术后16周移植血管内膜增生明显不均匀 ×100
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三、讨论
完整的移植血管内膜是内皮细胞下层与血流间的生理生化屏障，对防止血小板附着、血栓形成及保证血流通畅具有重要意义[1]。物理和化学因素损伤血管内膜后，内皮细胞形态发生变化，不同于正常静脉内皮细胞，呈“小而圆”排列紊乱的状态，横断面呈近似于柱状成角于血流方向的排列。在本实验中观察到这种情况，说明移植静脉植入动脉血流环境后内皮细胞在形态上发生了改建，它的意义可能是抵御动脉血流的冲击而保持内膜的完整性。
不仅如此，内皮细胞功能也发生了改变，本实验结果显示移植静脉于术后1周在内皮细胞胞浆内仍可见vWf抗原表达，但术后2周即未见有明显的阳性染色细胞，说明移植血管于术后1周即逐渐丧失vWf蛋白合成的功能。Vlot等[2]应用离心结合测定法(Centrifugation binding assay)观察Ⅷ因子与vWf结合动力学，发现两者的结合是防止Ⅷ因子在血浆中迅速降解的必要条件，Ⅷ因子在内源性凝血机制中起重要作用。vWf仅于内皮细胞中合成，呈结构性分泌或贮存于Weibel-Palade小体中。因此，血管于移植后较早时间内(1周后)内皮细胞合成vWf减少有其重要的意义，它的意义在于保持移植血管局部促凝和抗凝系统的平衡，从而维持移植血管的通畅， 而这一切可能是藉移植血管内皮细胞的再生与改建而完成的，具体细节尚需进一步研究，但从本实验中可以初步确认是血管移植后内皮细胞功能更趋于生理性而非生化性，因为它并不具有真正内皮细胞的生物学功能。
, 百拇医药
近年来，许多学者认为， 尽管血小板能合成vWf，但数量极少，血浆中大部分vWf均来自内皮细胞，他们在实验中发现血小板中vWf从α颗粒释放后仅结合在血小板表面，不与血浆中vWf发生交换，而且阿斯匹林(ASP)只改变血小板活性而不减少血浆中vWf，说明大部分vWf是来源于内皮细胞[3]。因此到目前为止，vWf因其良好特异性而被认为是较好的指标[4]。
移植血管增生内膜中平滑肌细胞(SMC)是最主要成分，但内皮细胞(EC)在内膜增生中所占比例及与内膜增生存在何种量效关系尚不清楚。 有作者观察到在人工血管增生内膜中同时存在EC和SMC的增殖，但并不能形成完整的内膜。本实验观察到术后1周时内皮细胞vWf呈阳性抗原表达，而此时内膜增生不明显，但术后2周时vWf呈阴性抗原表达，此时内膜增生加剧，说明在内膜增生与EC之间存在相互抑制的关系，增生内膜中内皮细胞的改建可能是通过EC和SMC两者所释放的某些化学介质影响而实现的。本实验结果提示在血管移植后EC的功能逐渐削弱，至术后2周EC几乎丧失正常功能，而内膜增生却逐渐加重，说明两者之间存在一定的联系，正常的EC功能对减少内膜增生具有重要作用，因此维持EC的正常生化及生物学功能对于抑制SMC增殖和内膜增生至关重要。
, 百拇医药
参考文献
[1] Nerem RM, Harrison DG, Talor WR, et al. Hemodynamics and vascular endothelial biology. J Cardiovasc Pharmacol, 1993, 21(suppl):S6-S10.
[2] Vlot AJ, Koppelman SJ, Meijers JCM, et al. Kinetics of factor VIII-von Willebrand factor association. Blood, 1996, 87:1809-1816.
[3] Ware RE, Parker RI, Mckeown LP, et al. A human chimera for von Willebrand disease following bone marrow transplantation. Am J Pediatric Hematol Oncol, 1993, 15:338-342.
[4] Pearson JD. Annotation: A reliable marker of endothelial cell dysfunction：does it exist. Br J Haemat, 1995, 90:244-248.
收稿：1997-12-05 修回：1998-10-10, 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所(钱济先，现为上海第二医科大学仁济医院血管外科)；安徽省宿县地区医院骨科(钱兆奇)；第四军医大学西京医院骨科(黄耀添)；第四军医大学西京医院病理科(王剑波)
关键词：
中华医学杂志990106 血管移植术后除内皮细胞外，中膜和外膜均可合成释放前列环素(PGI2) ，这给特异研究内皮细胞功能带来一定的局限性。自80年代以来，人们发现正常血管内皮细胞能合成Ⅷ因子，后被称之为von Willebrand factor(vWf)。迄今为止，有研究认为vWf仅由血管内皮细胞合成，因此，本实验采用vWF单抗在免疫组织化学及计算机辅助体视学基础上，探讨血管移植后内皮细胞形态及功能衍变及与内膜增生的量效关系。
一、材料与方法
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1.动物分组及手术模型：健康中国本兔12只，雌雄不拘，体重(3.2±0.6) kg，用质量分数2.5%戊巴比妥钠(25 mg/kg 体重)肌注麻醉。切取双侧股静脉倒置移植到同侧股动脉，移植静脉长度为3.0 cm，确认移植血管通畅后，置于周围健康肌肉覆盖。术后1、2、4和16周分别取材，取材的部位在移植静脉的中份，标本立即置于质量分数为4%多聚甲醛固定，以备观察用。正常动脉(A)、静脉(V)作为对照组。
2.观察指标：(1)vWf免疫组织化学：vWf单抗购于珠海Dako(丹麦)基因科技公司，组织切片厚约5 μm，经脱蜡、水洗和酶消化后按免疫组织化学(ABC法)有关步骤进行。单抗的工作浓度为1/50。(2)阳性细胞指数的真彩扫描仪微机图像分析：阳性染色的组织切片经镜检确认后，置40×10倍下行显微摄影，每个标本选4个视野(所有资料均同批处理)。照片再经真彩扫描仪(Microtek Scanmaker E6,Taiwan)扫描后输入图像分析系统，根据阳性染色之色调行色彩分割， 再提取该色调在视野中的面积并计算阳性染色细胞(棕褐色)占整个新生内膜中面积的百分比(即为阳性细胞指数)，取平均值计算。
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二、结果
正常A、V内皮细胞均可见较高的阳性抗原表达，术后1周移植血管内膜轻度增生，内皮细胞可见阳性染色(图1)，抗原表达主要在胞浆内，此期的阳性细胞主要位于内皮下层，仅个别阳性细胞位于移植静脉的中膜。阳性细胞指数为(8.91±0.30)%(图2)，与正常A、V相比差异有显著意义(P<0.05)。术后2周时未见明显的阳性细胞染色，仅于内皮细胞胞浆和细胞外基质可见极弱的阳性抗原表达。4～16周内膜增生明显，但未见阳性染色细胞。实验还发现，移植静脉内皮细胞形态发生了改变，呈现柱状垂直于或成角于血流方向的排列。
图1 术后1周转移血管内皮细胞vWF阳性染色呈褐色 ×320
图2 术后16周移植血管内膜增生明显不均匀 ×100
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三、讨论
完整的移植血管内膜是内皮细胞下层与血流间的生理生化屏障，对防止血小板附着、血栓形成及保证血流通畅具有重要意义[1]。物理和化学因素损伤血管内膜后，内皮细胞形态发生变化，不同于正常静脉内皮细胞，呈“小而圆”排列紊乱的状态，横断面呈近似于柱状成角于血流方向的排列。在本实验中观察到这种情况，说明移植静脉植入动脉血流环境后内皮细胞在形态上发生了改建，它的意义可能是抵御动脉血流的冲击而保持内膜的完整性。
不仅如此，内皮细胞功能也发生了改变，本实验结果显示移植静脉于术后1周在内皮细胞胞浆内仍可见vWf抗原表达，但术后2周即未见有明显的阳性染色细胞，说明移植血管于术后1周即逐渐丧失vWf蛋白合成的功能。Vlot等[2]应用离心结合测定法(Centrifugation binding assay)观察Ⅷ因子与vWf结合动力学，发现两者的结合是防止Ⅷ因子在血浆中迅速降解的必要条件，Ⅷ因子在内源性凝血机制中起重要作用。vWf仅于内皮细胞中合成，呈结构性分泌或贮存于Weibel-Palade小体中。因此，血管于移植后较早时间内(1周后)内皮细胞合成vWf减少有其重要的意义，它的意义在于保持移植血管局部促凝和抗凝系统的平衡，从而维持移植血管的通畅， 而这一切可能是藉移植血管内皮细胞的再生与改建而完成的，具体细节尚需进一步研究，但从本实验中可以初步确认是血管移植后内皮细胞功能更趋于生理性而非生化性，因为它并不具有真正内皮细胞的生物学功能。
, 百拇医药
近年来，许多学者认为， 尽管血小板能合成vWf，但数量极少，血浆中大部分vWf均来自内皮细胞，他们在实验中发现血小板中vWf从α颗粒释放后仅结合在血小板表面，不与血浆中vWf发生交换，而且阿斯匹林(ASP)只改变血小板活性而不减少血浆中vWf，说明大部分vWf是来源于内皮细胞[3]。因此到目前为止，vWf因其良好特异性而被认为是较好的指标[4]。
移植血管增生内膜中平滑肌细胞(SMC)是最主要成分，但内皮细胞(EC)在内膜增生中所占比例及与内膜增生存在何种量效关系尚不清楚。 有作者观察到在人工血管增生内膜中同时存在EC和SMC的增殖，但并不能形成完整的内膜。本实验观察到术后1周时内皮细胞vWf呈阳性抗原表达，而此时内膜增生不明显，但术后2周时vWf呈阴性抗原表达，此时内膜增生加剧，说明在内膜增生与EC之间存在相互抑制的关系，增生内膜中内皮细胞的改建可能是通过EC和SMC两者所释放的某些化学介质影响而实现的。本实验结果提示在血管移植后EC的功能逐渐削弱，至术后2周EC几乎丧失正常功能，而内膜增生却逐渐加重，说明两者之间存在一定的联系，正常的EC功能对减少内膜增生具有重要作用，因此维持EC的正常生化及生物学功能对于抑制SMC增殖和内膜增生至关重要。
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参考文献
[1] Nerem RM, Harrison DG, Talor WR, et al. Hemodynamics and vascular endothelial biology. J Cardiovasc Pharmacol, 1993, 21(suppl):S6-S10.
[2] Vlot AJ, Koppelman SJ, Meijers JCM, et al. Kinetics of factor VIII-von Willebrand factor association. Blood, 1996, 87:1809-1816.
[3] Ware RE, Parker RI, Mckeown LP, et al. A human chimera for von Willebrand disease following bone marrow transplantation. Am J Pediatric Hematol Oncol, 1993, 15:338-342.
[4] Pearson JD. Annotation: A reliable marker of endothelial cell dysfunction：does it exist. Br J Haemat, 1995, 90:244-248.
收稿：1997-12-05 修回：1998-10-10, 百拇医药