LMP2基因多态性与胰岛素依赖型糖尿病及DR3基因的关系
作者：丁鹤林 程桦 傅祖植 邓庆丽 严励
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科(丁鹤林、程桦、傅祖植、严励)；分子生物学实验室(邓庆丽)
关键词：糖尿病，胰岛素依赖型；基因
中华医学杂志990108 【摘要】 目的 探讨大多功能蛋白酶(LMP)2基因多态性与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)及DR3基因的关系。方法 以68例IDDM患者及71例正常人(对照组)为研究对象，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术进行LMP2基因分型。根据DR3基因分型将IDDM患者及对照组分为DR3阳性组与DR3阴性组，并分别比较LMP2基因频率在IDDM患者与对照组之间的差异。结果 DR3阳性组， LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为47%、47%、6%，对照组分别为13%、87%、0%；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组，LMP2-H/H在2组间差异无显著性意义。DR3阴性组，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为58%、39%、23%，对照组分别为32%、54%、14%。LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组；LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在2组间差异无显著性意义。结论 LMP2-R/H基因阳性者患IDDM的危险性增加，它可能是IDDM的易感基因；LMP2-R/R阳性者患IDDM的危险性降低，它可能是IDDM的保护基因。
, 百拇医药
Relationship of polymorphism of LMP2 gene to Insulin-dependent diabetes mellitus and DR3 gene DING Helin, CHENG Hua, FU Zuzhi, et al. Department of Endocrinology, Sun yat-sen Memorial Hospital, Zhong Shan University of Medical Sciences, Guang zhou 510120
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of polymorphism of large multifunctional protease (LMP) 2 genes to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) and DR3 gene. Methods The polymorphism of LMP2 genes was identified by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 68 IDDM patients and 71 healthy controls. IDDM patients and healthy controls were respectively divided into 2 groups according to DR3 genotyping. One group included subjects with DR3 gene, and another group subjects without DR3 gene. Results In the subjects with DR3 gene, the frequencies of LMP2-R/H, LMP2-R/R, LMP2-H/H were 47%, 47% and 6% in the IDDM patients, 13%, 87%, 0% in the controls. Compared with the Controls, the IDDM patients had a higher frequency of LMP2-R/H (P<0.05) and a lower frequency of LMP2-R/R (P<0.05). In the subjects without DR3 gene, the frequencies of LMP2-R/H, LMP2-R/R, LMP2-H/H were 58%, 39%, 2.8% respectively in the IDDM patients, and 32%, 54%, 14% respectively in the controls. Compared with the controls, the IDDM patients had a higher frequency of LMP2-R/H (P<0.05), the frequency of LMP2-R/R in the IDDM patients did not have a significant difference from that in the controls (P>0.05). Conclusions There may be a significant association of LMP2-R/H and LMP2-R/R with the susceptibility to IDDM. The LMP2-R/H is a susceptible gene. The people with LMP2-R/H have a higher risk of suffering from IDDM. The LMP2-R/R is a protective gene. The people with LMP2-R/R have a decreased risk of suffering from IDDM. The effects of LMP2 on ID-DM are not affected by DR3 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes Mellitus, insulin-dependent Genes
(Natl Med J China 1999, 79:28-30)
胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是一组多基因遗传所致并与自身免疫紊乱有关的异质性疾病，目前所发现的易感基因(如DR3、DQA1及DQB1)并不能解释IDDM的所有的遗传特征，故许多作者仍在进一步寻找新的与IDDM发病有关的基因。大多功能蛋白酶(large multifunctional protease，LMP)基因是位于人类主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ区的一个基因组，它有2个基因位点，LMP2及LMP7。LMP2基因多态性位置位于其编码产物的第60位氨基酸，当第60位氨基酸为精氨酸(R)时等位基因为LMP2-R，当第60位氨基酸为组氨酸(H)时等位基因为LMP2-H，它有3个基因型，即LMP2-R/R、LMP2-R/H及LMP2-H/H。本研究对LMP2各基因型与IDDM的关系进行初步探讨，并通过DR3基因配对研究来探讨与IDDM的关系是否受DR3基因的影响。
, http://www.100md.com
对象与方法
一、对象
68例IDDM患者，男39例,女29例，IDDM根据WHO 1985年的诊断标准。71例正常人男36例,女35例，均为华南地区无亲属关系汉族人。正常人 (对照组)为无遗传性疾病及自身免疫性疾病家族史的健康人。以巢式PCR进行DR3基因分型，根据DR3基因分型分别将IDDM患者及对照组分为DR3基因阴性组及阳性组，分别于2组比较LMP2基因频率在IDDM组与对照组间的差异。
二、方法
1. DNA的提取：静脉全血3 ml肝素抗凝，饱和酚/氯仿抽提。
2. LMP2基因分型：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)。优化PCR各反应条件后扩增出含LMP2基因多态性位置(R/H-60)的252 bp的DNA片段。然后以限制性内切
, http://www.100md.com
酶-HhaⅠ消化PCR产物，进行LMP2基因分型。PCR产物含有HhaⅠ的一个酶切位点(R/H-60)，纯合子LMP2-R/R完全为内切酶消化，而纯合子LMP2-H/H则完全不被消化，杂合子LMP2-R/H部分消化。质量控制：对70份标本重复进行LMP2基因分型；为保证内切酶消化完全，每次酶切反应以LMP2-R/R阳性标本作对照。
3. 统计学分析：基因频率在IDDM组与对照组间比较用四格表χ2检验，并计算优势比(ψ)。
结果
1.LMP2基因分型：PCR产物(252碱基对)及PCR产物的内切酶-HhaⅠ消化结果(图1)；对其中70份标本重复进行基因分型，重复率达100%。
, 百拇医药
1、3、5为PCR产物；2为LMP2-R/H，2条电泳带；4为LMP2-R/R，1条前移的电泳带；
6为LMP2-H/H，1条位置同PCR产物的电泳带；7为pGEM-7Zf(+)HaeⅢ Markers
图1 LMP2基因分型
2.LMP2基因在未进行DR3分组时的IDDM患者与对照组间的分布：LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为53%(36/68)、43%(29/68)、4%(3/68)，在对照组分别为28%(20/71)、61%(43/71)、11%(8/71)。LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=8.86，ψ=2.87，P<0.005)，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组(χ2=4.47，ψ=0.48，P<0.05)，LMP2-H/H基因频率在2组之间差异无显著性意义。
, 百拇医药
3.LMP2基因多态性在DR3分组的IDDM患者与正常对照间的分布：DR3阳性组(IDDM患者32例，对照组15例)，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为47%(15/32)、47%(15/32)、6%(2/32)，在对照组分别为13%(2/15)、87%(13/15)、0%；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=4.98，ψ=5.74，P<0.05)，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组(χ2=7.50，ψ=0.14，P<0.01)，LMP2-H/H在2组间差异无显著性意义。DR3阴性组(IDDM患者36例，对照组56例)，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为58%(21/36)、39%(14/36)、3%(1/36)，在对照组分别为32%(18/56)、54%(30/56)、14%(8/56)；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=6.15，ψ=2.96，P<0.01)，LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在两组间差异无显著性意义。
, 百拇医药
讨论
LMP2基因编码产物为大多功能蛋白酶，负责加工抗原，参与启动免疫反应(包括自身免疫反应)，因而推测LMP2基因可能与自身免疫性疾病有关。近年来国外对LMP2基因与IDDM的关系进行研究，但未能得出一致的结论，国内目前尚未见文献报道。Deng[1]等对高加索人群的研究发现，LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，LMP2-R/R频率显著低于对照组，而且与HLA-DQ/DR无连锁不平衡，认为LMP2-R/H是一个独立的易感基因，LMP2-R/R是一个独立的保护基因。Deng等虽然作了基因的连锁不平衡研究，但未作其它易感基因或保护基因的配对研究。因此不能排除这些基因在IDDM组与对照组间有不均衡性。选择DRB1-DQA1-DQB1易感基因相配对的IDDM患者及正常对照，发现在IDDM组，LMP2-R/R有增高趋势，LMP2-R/H有降低趋势，但统计学差异均无显著性意义，本研究均为DRB1-DQA1-DQB1阳性的对象，对阴性者未作研究，因此这样的研究不够全面。DR3基因是华南地区汉族人IDDM的重要易感基因[2]，为探讨LMP2基因与DR3基因的关系，作者根据DR3基因分型分别将IDDM患者及对照组分为DR3阳性组和DR3阴性组进行研究，结果显示：无论在DR3阳性组还是阴性组，LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，提示LMP2-R/H阳性者发生IDDM的危险性明显增加，LMP2-R/H是IDDM的易感基因，而且不受DR3的影响；在DR3阴性组，LMP2-R/R基因频率在IDDM组与对照组间比较有降低趋势，但统计学差异无显著性意义，在DR3阳性组LMP2-R/R基因频率在IDDM组要明显低于对照组，提示LMP2-R/R阳性者发生IDDM的危险性明显下降，LMP2-R/R可能是IDDM的保护基因，而且不受DR3基因影响。本研究结果虽发现LMP2基因对IDDM的作用不受DR3基因的影响，但要明确其是否是IDDM独立的影响因素还要联合其它易感基因及保护基因作进一步对照研究。
, 百拇医药
本课题为广东省科委重点攻关课题基金资助项目
参考文献
[1] Deng GY, Muir A, Maclaren NK, et al. Association of LMP2 and LMP7 genes within the major histocompatibility complex with insulin-dependent diabetes mellitus: Population and family studies. Am J Hum Genet,1995,56:528-534.
[2] 丁鹤林,程桦,张少玲,等. DR3基因与1型糖尿病易感性及发病年龄的关系. 中山医科大学学报,1998,19: 201-203.
收稿：1998-07-27 修回：1998-10-03, 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科(丁鹤林、程桦、傅祖植、严励)；分子生物学实验室(邓庆丽)
关键词：糖尿病，胰岛素依赖型；基因
中华医学杂志990108 【摘要】 目的 探讨大多功能蛋白酶(LMP)2基因多态性与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)及DR3基因的关系。方法 以68例IDDM患者及71例正常人(对照组)为研究对象，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术进行LMP2基因分型。根据DR3基因分型将IDDM患者及对照组分为DR3阳性组与DR3阴性组，并分别比较LMP2基因频率在IDDM患者与对照组之间的差异。结果 DR3阳性组， LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为47%、47%、6%，对照组分别为13%、87%、0%；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组，LMP2-H/H在2组间差异无显著性意义。DR3阴性组，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为58%、39%、23%，对照组分别为32%、54%、14%。LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组；LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在2组间差异无显著性意义。结论 LMP2-R/H基因阳性者患IDDM的危险性增加，它可能是IDDM的易感基因；LMP2-R/R阳性者患IDDM的危险性降低，它可能是IDDM的保护基因。
, 百拇医药
Relationship of polymorphism of LMP2 gene to Insulin-dependent diabetes mellitus and DR3 gene DING Helin, CHENG Hua, FU Zuzhi, et al. Department of Endocrinology, Sun yat-sen Memorial Hospital, Zhong Shan University of Medical Sciences, Guang zhou 510120
【Abstract】 Objective To investigate the relationship of polymorphism of large multifunctional protease (LMP) 2 genes to insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) and DR3 gene. Methods The polymorphism of LMP2 genes was identified by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 68 IDDM patients and 71 healthy controls. IDDM patients and healthy controls were respectively divided into 2 groups according to DR3 genotyping. One group included subjects with DR3 gene, and another group subjects without DR3 gene. Results In the subjects with DR3 gene, the frequencies of LMP2-R/H, LMP2-R/R, LMP2-H/H were 47%, 47% and 6% in the IDDM patients, 13%, 87%, 0% in the controls. Compared with the Controls, the IDDM patients had a higher frequency of LMP2-R/H (P<0.05) and a lower frequency of LMP2-R/R (P<0.05). In the subjects without DR3 gene, the frequencies of LMP2-R/H, LMP2-R/R, LMP2-H/H were 58%, 39%, 2.8% respectively in the IDDM patients, and 32%, 54%, 14% respectively in the controls. Compared with the controls, the IDDM patients had a higher frequency of LMP2-R/H (P<0.05), the frequency of LMP2-R/R in the IDDM patients did not have a significant difference from that in the controls (P>0.05). Conclusions There may be a significant association of LMP2-R/H and LMP2-R/R with the susceptibility to IDDM. The LMP2-R/H is a susceptible gene. The people with LMP2-R/H have a higher risk of suffering from IDDM. The LMP2-R/R is a protective gene. The people with LMP2-R/R have a decreased risk of suffering from IDDM. The effects of LMP2 on ID-DM are not affected by DR3 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes Mellitus, insulin-dependent Genes
(Natl Med J China 1999, 79:28-30)
胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是一组多基因遗传所致并与自身免疫紊乱有关的异质性疾病，目前所发现的易感基因(如DR3、DQA1及DQB1)并不能解释IDDM的所有的遗传特征，故许多作者仍在进一步寻找新的与IDDM发病有关的基因。大多功能蛋白酶(large multifunctional protease，LMP)基因是位于人类主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ区的一个基因组，它有2个基因位点，LMP2及LMP7。LMP2基因多态性位置位于其编码产物的第60位氨基酸，当第60位氨基酸为精氨酸(R)时等位基因为LMP2-R，当第60位氨基酸为组氨酸(H)时等位基因为LMP2-H，它有3个基因型，即LMP2-R/R、LMP2-R/H及LMP2-H/H。本研究对LMP2各基因型与IDDM的关系进行初步探讨，并通过DR3基因配对研究来探讨与IDDM的关系是否受DR3基因的影响。
, http://www.100md.com
对象与方法
一、对象
68例IDDM患者，男39例,女29例，IDDM根据WHO 1985年的诊断标准。71例正常人男36例,女35例，均为华南地区无亲属关系汉族人。正常人 (对照组)为无遗传性疾病及自身免疫性疾病家族史的健康人。以巢式PCR进行DR3基因分型，根据DR3基因分型分别将IDDM患者及对照组分为DR3基因阴性组及阳性组，分别于2组比较LMP2基因频率在IDDM组与对照组间的差异。
二、方法
1. DNA的提取：静脉全血3 ml肝素抗凝，饱和酚/氯仿抽提。
2. LMP2基因分型：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)。优化PCR各反应条件后扩增出含LMP2基因多态性位置(R/H-60)的252 bp的DNA片段。然后以限制性内切
, http://www.100md.com
酶-HhaⅠ消化PCR产物，进行LMP2基因分型。PCR产物含有HhaⅠ的一个酶切位点(R/H-60)，纯合子LMP2-R/R完全为内切酶消化，而纯合子LMP2-H/H则完全不被消化，杂合子LMP2-R/H部分消化。质量控制：对70份标本重复进行LMP2基因分型；为保证内切酶消化完全，每次酶切反应以LMP2-R/R阳性标本作对照。
3. 统计学分析：基因频率在IDDM组与对照组间比较用四格表χ2检验，并计算优势比(ψ)。
结果
1.LMP2基因分型：PCR产物(252碱基对)及PCR产物的内切酶-HhaⅠ消化结果(图1)；对其中70份标本重复进行基因分型，重复率达100%。
, 百拇医药
1、3、5为PCR产物；2为LMP2-R/H，2条电泳带；4为LMP2-R/R，1条前移的电泳带；
6为LMP2-H/H，1条位置同PCR产物的电泳带；7为pGEM-7Zf(+)HaeⅢ Markers
图1 LMP2基因分型
2.LMP2基因在未进行DR3分组时的IDDM患者与对照组间的分布：LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为53%(36/68)、43%(29/68)、4%(3/68)，在对照组分别为28%(20/71)、61%(43/71)、11%(8/71)。LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=8.86，ψ=2.87，P<0.005)，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组(χ2=4.47，ψ=0.48，P<0.05)，LMP2-H/H基因频率在2组之间差异无显著性意义。
, 百拇医药
3.LMP2基因多态性在DR3分组的IDDM患者与正常对照间的分布：DR3阳性组(IDDM患者32例，对照组15例)，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为47%(15/32)、47%(15/32)、6%(2/32)，在对照组分别为13%(2/15)、87%(13/15)、0%；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=4.98，ψ=5.74，P<0.05)，LMP2-R/R基因频率显著低于对照组(χ2=7.50，ψ=0.14，P<0.01)，LMP2-H/H在2组间差异无显著性意义。DR3阴性组(IDDM患者36例，对照组56例)，LMP2-R/H、LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在IDDM组分别为58%(21/36)、39%(14/36)、3%(1/36)，在对照组分别为32%(18/56)、54%(30/56)、14%(8/56)；LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组(χ2=6.15，ψ=2.96，P<0.01)，LMP2-R/R及LMP2-H/H基因频率在两组间差异无显著性意义。
, 百拇医药
讨论
LMP2基因编码产物为大多功能蛋白酶，负责加工抗原，参与启动免疫反应(包括自身免疫反应)，因而推测LMP2基因可能与自身免疫性疾病有关。近年来国外对LMP2基因与IDDM的关系进行研究，但未能得出一致的结论，国内目前尚未见文献报道。Deng[1]等对高加索人群的研究发现，LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，LMP2-R/R频率显著低于对照组，而且与HLA-DQ/DR无连锁不平衡，认为LMP2-R/H是一个独立的易感基因，LMP2-R/R是一个独立的保护基因。Deng等虽然作了基因的连锁不平衡研究，但未作其它易感基因或保护基因的配对研究。因此不能排除这些基因在IDDM组与对照组间有不均衡性。选择DRB1-DQA1-DQB1易感基因相配对的IDDM患者及正常对照，发现在IDDM组，LMP2-R/R有增高趋势，LMP2-R/H有降低趋势，但统计学差异均无显著性意义，本研究均为DRB1-DQA1-DQB1阳性的对象，对阴性者未作研究，因此这样的研究不够全面。DR3基因是华南地区汉族人IDDM的重要易感基因[2]，为探讨LMP2基因与DR3基因的关系，作者根据DR3基因分型分别将IDDM患者及对照组分为DR3阳性组和DR3阴性组进行研究，结果显示：无论在DR3阳性组还是阴性组，LMP2-R/H基因频率在IDDM组显著高于对照组，提示LMP2-R/H阳性者发生IDDM的危险性明显增加，LMP2-R/H是IDDM的易感基因，而且不受DR3的影响；在DR3阴性组，LMP2-R/R基因频率在IDDM组与对照组间比较有降低趋势，但统计学差异无显著性意义，在DR3阳性组LMP2-R/R基因频率在IDDM组要明显低于对照组，提示LMP2-R/R阳性者发生IDDM的危险性明显下降，LMP2-R/R可能是IDDM的保护基因，而且不受DR3基因影响。本研究结果虽发现LMP2基因对IDDM的作用不受DR3基因的影响，但要明确其是否是IDDM独立的影响因素还要联合其它易感基因及保护基因作进一步对照研究。
, 百拇医药
本课题为广东省科委重点攻关课题基金资助项目
参考文献
[1] Deng GY, Muir A, Maclaren NK, et al. Association of LMP2 and LMP7 genes within the major histocompatibility complex with insulin-dependent diabetes mellitus: Population and family studies. Am J Hum Genet,1995,56:528-534.
[2] 丁鹤林,程桦,张少玲,等. DR3基因与1型糖尿病易感性及发病年龄的关系. 中山医科大学学报,1998,19: 201-203.
收稿：1998-07-27 修回：1998-10-03, 百拇医药