乙型肝炎病毒宫内传播因素和机制的分子流行病学研究
作者：徐德忠 闫永平 徐剑秋 王文亮 门可 张景霞 刘斌 刘志华 王福生 蒋美玲 陈向红
单位：710032 西安，第四军医大学流行病学教研室(徐德忠、闫永平、门可、张景霞、刘志华、王福生)；陕西省妇幼保健院(徐剑秋、蒋美玲、陈向红)；第四军医大学病理学教研室(王文亮、刘斌)
关键词：肝炎病毒，乙型；胎盘；病例对照研究
中华医学杂志990107 【摘要】 目的 应用分子流行病学方法研究乙型肝炎病毒(HBV)经胎盘引起宫内感染的危险因素与机制。方法 收集连续性入院的402例乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇及其新生儿作为研究对象。其中，发生宫内感染的15例作为病例组，余为对照组，进行病例对照研究；同时分别检测182份与185份母血的HBsAg滴度和HBV DNA浓度，筛选危险因素；另外收集胎盘标本进行免疫组化染色与原位杂交，确定HBV感染状况；最后进行综合分析。结果 病例对照研究发现，母亲HBeAg阳性与先兆早产史是主要危险因素，OR值分别为17.07与5.44。母血HBsAg滴度与HBV DNA浓度与宫内感染显著相关(P=或<0.01)。101例足月孕妇胎盘的免疫组化与原位杂交显示，HBV在胎盘组织各层细胞的感染率由母面向胎儿逐渐降低(P=0.0009)。而且，综合分析表明，进入胎儿循环的最后一层细胞(绒毛毛细血管内皮)的HBV感染与宫内感染有非常显著的联系(OR=18.46，P=0.0002)。结论 HBV感染在胎盘组织内可能存在一个自母面向胎儿“细胞转移”的过程。由此，我们首次提出关于HBV宫内传播机制的假设：存在二条途径：血源性和细胞源性。
, 百拇医药
A molecular epidemiology study on risk factors and mechanism of HBV intrauterine transmission XU Dezhong, YAN Yongping, XU Jianqiu, et al. Department of Epidemiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032.
【Abstract】 Objective To clarify the risk factors and mechanism of HBV intrauterine infection by molecular epidemiology method. Methods We performed a case-control study. 402 HBsAg-positive pregnant women and their infants were collected as subjects. 15 infants infected by HBV intrauterine transmission were selected as case group and others as controls. Besides, HBsAg titer in 182 maternal sera and HBV DNA concentration in 185 maternal sera were determined. To identify the HBV infection in the placentas, immunohistochemistry stain and HBV DNA hybridization in situ were conducted. The data from both laboratory and epidemiological fields were analysed. Results The findings indicated that the positiveness of HBeAg in mother's sera (OR=17.07) and the history of threatened premature labour (OR=5.44) were the main risk factors. Intrauterine transmission was significantly related to HBsAg titers and HBV DNA concentration in mother's sera (P=0.01). The results of immunochemistry stain and HBV DNA situ in hybridization in the placentas from 101 full-term pregnancy women showed that HBV infection rates had a decreasing trend (P=0.0009) from mother's side to fetus's in placenta and there was a significant association between HBV intrauterine transmission and HBV infection in villous capillary endothelial cells in placenta (OR=18.46, P=0.0002).Conclusion There might be a “cellular transfer”of HBV infection in the placenta. With regard to the mechanism of HBV intrauterine transmission; there are two transmission routes, namely, hemagenous route and cellular route.
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【Key words】 Hepatitis B virus Placenta Case-control study
(Natl Med J China, 1999,79：24-27)
国内外已有很多资料证明，乙型肝炎(乙肝)疫苗效果确实，对控制乙肝流行起到巨大作用。然而，如果乙肝病毒(HBV)经胎盘传播，使胎儿发生宫内感染，乙肝疫苗则无法阻断这种传播。因此，研究HBV经胎盘传播的机制已经成为在世界上控制乃至消灭乙肝的一个关键课题。为此，我们自1992年开始进行了病例对照研究和血清与胎盘的多种乙肝生物学标志的实验室检测。现将研究的主要结果报告如下。
材料和方法
一、研究对象与标本收集
1.病例对照研究：在陕西省妇幼保健院于1993～1997年选择402例连续性入院的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇及其新生儿作为研究对象。采集孕妇分娩前血标本，新生儿出生后24小时内的股静脉血标本存-20℃备检。新生儿采血后立即注射乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)，并进行乙肝疫苗全程免疫。
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2.分子病理学研究：1995～1997年选择陕西省妇幼保健院101例HBsAg阳性的足月孕妇作为研究对象，14例HBsAg阴性足月孕妇作为对照。采集孕妇与新生儿的血标本待检，同时采集1 cm×1 cm×2 cm的胎盘组织于甲醛液中固定，按常规切片与处理。
二、方法
1.病例对照研究：按包括六类51个暴露因素的统一调查表进行，由培训的调查员对产妇在入院后即进行询问调查。凡新生儿出生后24小时内血清HBsAg阳性者判为宫内感染，作为病例组；余作为对照组。
2.实验室检查：(1)血清HBsAg和HBeAg检测：用ELISA法，检测盒购自上海科华生物技术公司。结果用DG-3022A ELISA检测仪判定，P/N≥2.1为阳性。(2) HBsAg与HBV DNA定量检测：在研究后期，由于建立了定量检测HBV DNA方法, 在402例中，我们分别对最后可供检测的182份和185份母亲血清标本定量检测了HBsAg和HBV DNA。HBsAg滴度：使用反向被动血凝法(RPHA)检测倍比稀释血清；试剂盒购自上海科华实业公司。HBV DNA浓度：斑点杂交法检测。应用地高辛标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)标记HBV DNA进行。检测结果按HBV DNA的含量为分5级：0级：≤0.002 ng/ml；Ⅰ级：～0.019 ng/ml；Ⅱ级：～0.1 ng/ml；Ⅲ级：～0.99 ng/ml；Ⅳ级：≥1.0 ng/ml。(3)胎盘HBsAg、HBcAg与HBxAg的免疫组织化学方法检测：按先前报道过的方法[1]。主要步骤如下：用ABC免疫染色法检测，试剂盒购自美国Vecta公司。鼠单克隆抗-HBs和兔单克隆抗-HBc购自美国Zymed公司。兔抗-HBx由本校病理教研室王文亮教授惠赠。HBsAg与HBcAg阳性的尸肝组织为阳性对照；HBsAg和HBcAg阴性的尸肝、HBsAg阴性的孕妇胎盘组织为阴性对照。同时设正常鼠或兔血清的替代对照和PBS空白对照；还进行了HBsAg吸收阻断以证明其特异性。(4)胎盘组织HBV DNA原位杂交：使用上述法国公司的地高辛检测盒，设置1种阳性对照，6种阴性对照(空白、未标记HBV DNA探针、无关探针、HBV DNA阴性胎盘组织、标记未重组pBR322质粒、HBV DNA阴性肝组织)。
, 百拇医药
凡胎盘组织各层细胞中任一细胞HBsAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA任一指标阳性者，即判为胎盘HBV感染。
3.统计分析：使用本校统计学教研室SPLM软件在486微机上进行。
结果
一、HBV宫内感染率
402例新生儿中，出生后24小时内血清HBsAg阳性者15例，HBV宫内感染率为3.7%。对于HBsAg与HBeAg双阳性的孕妇，宫内感染率为9.8%(13/133)。
二、病例对照研究
1.均衡性检验：对两组母亲的年龄、职业、新生儿的体重与性别进行了统计学检验，均未发现有显著性差异(P>0.05)，提示这些因素与HBV宫内传播关系不大。
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2.单因素分析：在众多的暴露因素中，仅发现母亲HBeAg阳性与先兆早产史有统计学意义(P<0.05)，OR值分别为14.46与6.66(表1)。
表1 乙肝病毒宫内传播暴露因素的优势比 孕妇暴露
因 素
病例
对照
OR
95%CI
P值
+
-
+
, http://www.100md.com
-
HBeAg阳性
13
2
120
267
14.46
3.01～95.57
<0.05
人流史
7
8
155
, 百拇医药
232
1.31
0.41～4.11
>0.05
1产以上
3
12
26
361
3.47
0.72～14.62
>0.05
剖宫产
, 百拇医药
1
14
78
309
0.29
0.04～2.15
>0.05
先兆流产
1
14
70
317
0.32
, 百拇医药
0.02～2.44
>0.05
先兆早产
3
12
14
373
6.66
1.31～30.15
<0.05
妊高征
2
13
, 百拇医药
39
348
1.37
0.00～6.84
>0.05
Apgar低分
1
14
14
373
1.84
0.26～13.11
>0.05
, 百拇医药
3.多因素分析：将暴露因素进行Logistic多因素回归分析，仍只有母亲HBeAg阳性与先兆早产史有意义，其OR值分别为17.07 (P=0.0006) 与5.44(P=0.0325)(表2)。结果表明，这二个因素排除各种混杂后仍与HBV宫内感染有关，可能是其主要危险因素。表2 乙肝病毒宫内传播暴露因素的Logistic多元回归分析
参数名
OR值
95%CI
U值
P值
HBeAg阳性
17.07
3.39～86.01
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3.4382
0.0006
人流史
1.06
0.33～3.38
0.1044
0.9168
1产以上
4.15
0.92～18.86
1.8453
0.0650
, http://www.100md.com 先兆流产
0.08
0.04～2.78
1.0119
0.3079
先兆早产
5.44
1.15～25.67
2.1384
0.0325
妊高征
2.73
0.44～16.88
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1.0810
0.2797
三、母血清HBsAg和HBV DNA含量与宫内传播的相关关系
1. HBsAg滴度：182例HBsAg阳性母血中，RPHA滴度≤1∶8有36例，1∶16～1∶64有59例，1∶128～1∶512有56例，≥1∶1 024有31例；这四种不同滴度的宫内感染率分别为0%(0/36)、1.7%(1/59)、7.1%(4/56)、9.7%(3/31)。可见，随着母亲HBsAg滴度升高，宫内感染率也增加(趋势检验，χ2=6.353，P=0.0117)；也即宫内感染与孕妇HBsAg滴度显著相关。
2.HBV DNA浓度：在185例检测的标本中，血清HBV DNA定量0级的有39例，Ⅰ级72例，Ⅱ级29例，Ⅲ级18例，Ⅳ级27例。其各级的宫内传播率分别为0%、1.4%、3.5%、0%、22.2%。趋势检验：χ2=15.49，P<0.01。同样可见，宫内感染与母血HBV DNA浓度呈非常显著相关。
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四、分子病理学研究结果
1.胎盘HBV总感染率： 经免疫组化与原位杂交， 101例足月孕妇的胎盘组织中，发现存在HBsAg的有34例(33.7%)，存在HBxAg的有38例(37.6%)，存在HBcAg的有21例(20.8%)，存在HBV DNA的有45例(44.6%)。胎盘组织HBV总感染率为44.6%。HBsAg不均一棕色阳性颗粒主要分布在细胞的胞浆中(图1)； HBxAg的分布与HBsAg相似； HBcAg为均一棕色颗粒，主要分布于胞核中，偶见胞浆全浆型分布(图2)；而HBV DNA为兰色颗粒，主要分布于细胞核内，呈全核型(图3)。
图1 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘绒毛组织免疫组化检测HBsAg.滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞胞浆或胞核中的棕黄色信号为HBsAg ABC(苏木素衬染)×200
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图2 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘蜕膜组织免疫组化检测HBcAg.蜕膜细胞和蜕膜毛细血管内皮细胞胞核或胞浆中的棕色信号为HBcAg
ABC(苏木素衬染)×400
图3 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘绒毛组织原位杂交检测HBV DNA.滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞浆或胞核中的蓝紫色信号为HBV DNA ISH×400
2.胎盘各层细胞HBV感染情况：母面蜕膜HBV感染率为43.6%(44/101)；胎盘屏障中逐层感染率为：滋养层细胞 40.6% (41/101)、绒毛间质细胞36.6% (37/101)、胎儿的绒毛毛细血管内皮细胞 (VCEC) 18.8% (19/101) 。可见，胎盘各层细胞中HBV感染率由母面向胎儿面逐渐降低(趋势检验：χ2=10.97，P=0.0009)。
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五、胎盘绒毛毛细血管内皮细胞HBV感染与宫内传播的关系
101例HBsAg阳性的足月孕妇中，发生宫内感染者8例。把宫内感染作为病例组，余作为对照组。病例组8例中6例(75%)有胎盘VCEC HBV感染；而93例对照组中仅有13例(14%)感染，因此，表明胎盘VCEC HBV感染与宫内传播有非常明显的关系，其OR值为18.46(P=0.0002)。进行Logistic多因素回归分析后发现，其OR为16.15(P=0.0076)。
讨论
关于HBV经胎盘发生宫内传播机制的报告仅数篇[2～4]，而得出的结论完全相反。可能由于其是现况研究或病例报告，胎盘组织研究的方法还不够先进、样本量又较少等原因。我们为规范研究HBV宫内传播的危险因素与机制，一方面作病例对照调查，另一方面利用HBsAg、HBeAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA作为生物学标志(biological markers)，观察其在血清和/或胎盘中的分布或定位及其与宏观研究资料之间的联系。本研究中，暴露因素使用了一些客观指标，同时，由于孕妇的询问调查在病例组分组之前，故调查员询问偏倚小，对结果的影响不大。在病例对照研究中，为避免PCR 检测引起的假阳性，我们使用ELISA检测新生儿血清HBsAg，可能低估了HBV宫内感染率。免疫组化研究中使用了敏感性较高的ABC方法，而且设置多种对照与替代、阻断试验，保证了结果的可靠性。为提高方法的敏感性，我们还用原位杂交检测了胎盘组织中HBV DNA。分别供HBsAg与HBV DNA定量检测的182份与185份母血标本。尽管是整个研究后期采取的，但也采自后期连续性病例,且标本数量较多，故基本上没有破坏样本的代表性。
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我们的病例对照研究发现，无论是单因素分析还是多因素分析均表明，母亲HBeAg阳性和先兆早产史与宫内感染有明显的相关，OR值分别为14.46～17.07与5.44～6.66。结果提示，这二个因素很可能是HBV宫内感染的主要危险因素。
我们的研究表明，母亲血中HBsAg滴度与HBV DNA浓度和宫内感染显著相关(P值分别为0.0117与<0.01)，也即HBsAg滴度与HBV DNA浓度愈高，其引起宫内传播的概率愈高。这与病例对照研究中发现母血HBeAg阳性是主要的危险因素的结果一致。因为一般来说，HBeAg阳性者血清中血HBsAg滴度与HBV DNA含量就高[5，6]。然而，在Lin等[2]与Ohto等[3]的研究报告中，虽然宫内感染的孕妇HBsAg滴度与HBV DNA浓度均高于非宫内感染者，但统计学均未达到显著性。这很可能是样本量小的缘故。
胎盘组织的免疫组化与原位杂交发现，胎盘各层细胞的HBV感染率不同，从母面到胎儿的各层细胞：脱膜、滋养层、绒毛间质、绒毛毛细血管内皮的HBV感染率逐层降低，即愈接近胎儿，其感染率愈低，其趋势检验有非常显著的意义(P=0.0009)。结果提示，HBV在胎盘组织内的感染似有一个逐层“细胞转移”或“细胞传递”的过程。而且很有意思的是，进入胎儿血循环的最后一层细胞——绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)的HBV感染率与宫内感染的发生有非常显著的相关：单因素分析OR值为18.46(P=0.0002)，Logistic回归分析为16.15(P=0.0076)。可见，宫内感染很可能与HBV在胎盘各层组织内“细胞转移”有关。然而，这种“细胞转移”过程是如何发生的?其机制如何?有哪些影响因素? 我们正在作全面而深入的研究。
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综合上述现场与实验室的研究结果，我们首次提出关于HBV经胎盘引起胎儿宫内感染的假设：感染有两条途径：(1)血源性：可由某些因素，如先兆早产，引起胎盘微血管的破损，使高浓度HBV的母血直接进入胎儿循环；(2)细胞源性：高浓度的HBV感染孕妇的脱膜细胞，经过“细胞转移”至胎儿绒毛毛细血管内皮，最后引起胎儿感染。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39370611)
参考文献
[1] 闫永平，徐德忠，王文亮，等.乙型肝炎表面抗原阳性孕妇不同孕期胎盘乙型肝炎病毒的感染状态.中华医学杂志，1998，78：76-77.
[2] Lin H, Lee T, Chen D, et al. Trasplacental leakage of HBeAg-positive maternal blood as the most likely route in causing intrauterine infection with hepatitis B virus. J Pediatr, 1987,111：877-881.
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[3] Ohto H, Lin H, Kawana T, et al. Intrauterine transmission of hepatitis B virus is closely related to placental leakage, J Med Virol, 1987,21：1-6.
[4] 唐时幸，于光烈，程绍尧.HBV宫内感染机制及影响因素的研究.中华流行病学杂志，1991，12：325-326.
[5] 徐德忠，陈友绩.甲、乙型肝炎病毒学标志的临床与流行病学意义.陕西医学杂志，1989,18：37-39.
[6] Chen DS, Lai MY, Lee SC, et al. Serum HBsAg，HBeAg, anti-HBe and hepatitis B viral DNA in asymptomatic carriers in Taiwan. J Med Virol, 1986,19：87-94.
收稿：1998-07-30 修回：1998-10-16, http://www.100md.com
单位：710032 西安，第四军医大学流行病学教研室(徐德忠、闫永平、门可、张景霞、刘志华、王福生)；陕西省妇幼保健院(徐剑秋、蒋美玲、陈向红)；第四军医大学病理学教研室(王文亮、刘斌)
关键词：肝炎病毒，乙型；胎盘；病例对照研究
中华医学杂志990107 【摘要】 目的 应用分子流行病学方法研究乙型肝炎病毒(HBV)经胎盘引起宫内感染的危险因素与机制。方法 收集连续性入院的402例乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇及其新生儿作为研究对象。其中，发生宫内感染的15例作为病例组，余为对照组，进行病例对照研究；同时分别检测182份与185份母血的HBsAg滴度和HBV DNA浓度，筛选危险因素；另外收集胎盘标本进行免疫组化染色与原位杂交，确定HBV感染状况；最后进行综合分析。结果 病例对照研究发现，母亲HBeAg阳性与先兆早产史是主要危险因素，OR值分别为17.07与5.44。母血HBsAg滴度与HBV DNA浓度与宫内感染显著相关(P=或<0.01)。101例足月孕妇胎盘的免疫组化与原位杂交显示，HBV在胎盘组织各层细胞的感染率由母面向胎儿逐渐降低(P=0.0009)。而且，综合分析表明，进入胎儿循环的最后一层细胞(绒毛毛细血管内皮)的HBV感染与宫内感染有非常显著的联系(OR=18.46，P=0.0002)。结论 HBV感染在胎盘组织内可能存在一个自母面向胎儿“细胞转移”的过程。由此，我们首次提出关于HBV宫内传播机制的假设：存在二条途径：血源性和细胞源性。
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A molecular epidemiology study on risk factors and mechanism of HBV intrauterine transmission XU Dezhong, YAN Yongping, XU Jianqiu, et al. Department of Epidemiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032.
【Abstract】 Objective To clarify the risk factors and mechanism of HBV intrauterine infection by molecular epidemiology method. Methods We performed a case-control study. 402 HBsAg-positive pregnant women and their infants were collected as subjects. 15 infants infected by HBV intrauterine transmission were selected as case group and others as controls. Besides, HBsAg titer in 182 maternal sera and HBV DNA concentration in 185 maternal sera were determined. To identify the HBV infection in the placentas, immunohistochemistry stain and HBV DNA hybridization in situ were conducted. The data from both laboratory and epidemiological fields were analysed. Results The findings indicated that the positiveness of HBeAg in mother's sera (OR=17.07) and the history of threatened premature labour (OR=5.44) were the main risk factors. Intrauterine transmission was significantly related to HBsAg titers and HBV DNA concentration in mother's sera (P=0.01). The results of immunochemistry stain and HBV DNA situ in hybridization in the placentas from 101 full-term pregnancy women showed that HBV infection rates had a decreasing trend (P=0.0009) from mother's side to fetus's in placenta and there was a significant association between HBV intrauterine transmission and HBV infection in villous capillary endothelial cells in placenta (OR=18.46, P=0.0002).Conclusion There might be a “cellular transfer”of HBV infection in the placenta. With regard to the mechanism of HBV intrauterine transmission; there are two transmission routes, namely, hemagenous route and cellular route.
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【Key words】 Hepatitis B virus Placenta Case-control study
(Natl Med J China, 1999,79：24-27)
国内外已有很多资料证明，乙型肝炎(乙肝)疫苗效果确实，对控制乙肝流行起到巨大作用。然而，如果乙肝病毒(HBV)经胎盘传播，使胎儿发生宫内感染，乙肝疫苗则无法阻断这种传播。因此，研究HBV经胎盘传播的机制已经成为在世界上控制乃至消灭乙肝的一个关键课题。为此，我们自1992年开始进行了病例对照研究和血清与胎盘的多种乙肝生物学标志的实验室检测。现将研究的主要结果报告如下。
材料和方法
一、研究对象与标本收集
1.病例对照研究：在陕西省妇幼保健院于1993～1997年选择402例连续性入院的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇及其新生儿作为研究对象。采集孕妇分娩前血标本，新生儿出生后24小时内的股静脉血标本存-20℃备检。新生儿采血后立即注射乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)，并进行乙肝疫苗全程免疫。
, http://www.100md.com
2.分子病理学研究：1995～1997年选择陕西省妇幼保健院101例HBsAg阳性的足月孕妇作为研究对象，14例HBsAg阴性足月孕妇作为对照。采集孕妇与新生儿的血标本待检，同时采集1 cm×1 cm×2 cm的胎盘组织于甲醛液中固定，按常规切片与处理。
二、方法
1.病例对照研究：按包括六类51个暴露因素的统一调查表进行，由培训的调查员对产妇在入院后即进行询问调查。凡新生儿出生后24小时内血清HBsAg阳性者判为宫内感染，作为病例组；余作为对照组。
2.实验室检查：(1)血清HBsAg和HBeAg检测：用ELISA法，检测盒购自上海科华生物技术公司。结果用DG-3022A ELISA检测仪判定，P/N≥2.1为阳性。(2) HBsAg与HBV DNA定量检测：在研究后期，由于建立了定量检测HBV DNA方法, 在402例中，我们分别对最后可供检测的182份和185份母亲血清标本定量检测了HBsAg和HBV DNA。HBsAg滴度：使用反向被动血凝法(RPHA)检测倍比稀释血清；试剂盒购自上海科华实业公司。HBV DNA浓度：斑点杂交法检测。应用地高辛标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)标记HBV DNA进行。检测结果按HBV DNA的含量为分5级：0级：≤0.002 ng/ml；Ⅰ级：～0.019 ng/ml；Ⅱ级：～0.1 ng/ml；Ⅲ级：～0.99 ng/ml；Ⅳ级：≥1.0 ng/ml。(3)胎盘HBsAg、HBcAg与HBxAg的免疫组织化学方法检测：按先前报道过的方法[1]。主要步骤如下：用ABC免疫染色法检测，试剂盒购自美国Vecta公司。鼠单克隆抗-HBs和兔单克隆抗-HBc购自美国Zymed公司。兔抗-HBx由本校病理教研室王文亮教授惠赠。HBsAg与HBcAg阳性的尸肝组织为阳性对照；HBsAg和HBcAg阴性的尸肝、HBsAg阴性的孕妇胎盘组织为阴性对照。同时设正常鼠或兔血清的替代对照和PBS空白对照；还进行了HBsAg吸收阻断以证明其特异性。(4)胎盘组织HBV DNA原位杂交：使用上述法国公司的地高辛检测盒，设置1种阳性对照，6种阴性对照(空白、未标记HBV DNA探针、无关探针、HBV DNA阴性胎盘组织、标记未重组pBR322质粒、HBV DNA阴性肝组织)。
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凡胎盘组织各层细胞中任一细胞HBsAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA任一指标阳性者，即判为胎盘HBV感染。
3.统计分析：使用本校统计学教研室SPLM软件在486微机上进行。
结果
一、HBV宫内感染率
402例新生儿中，出生后24小时内血清HBsAg阳性者15例，HBV宫内感染率为3.7%。对于HBsAg与HBeAg双阳性的孕妇，宫内感染率为9.8%(13/133)。
二、病例对照研究
1.均衡性检验：对两组母亲的年龄、职业、新生儿的体重与性别进行了统计学检验，均未发现有显著性差异(P>0.05)，提示这些因素与HBV宫内传播关系不大。
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2.单因素分析：在众多的暴露因素中，仅发现母亲HBeAg阳性与先兆早产史有统计学意义(P<0.05)，OR值分别为14.46与6.66(表1)。
表1 乙肝病毒宫内传播暴露因素的优势比 孕妇暴露
因 素
病例
对照
OR
95%CI
P值
+
-
+
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-
HBeAg阳性
13
2
120
267
14.46
3.01～95.57
<0.05
人流史
7
8
155
, 百拇医药
232
1.31
0.41～4.11
>0.05
1产以上
3
12
26
361
3.47
0.72～14.62
>0.05
剖宫产
, 百拇医药
1
14
78
309
0.29
0.04～2.15
>0.05
先兆流产
1
14
70
317
0.32
, 百拇医药
0.02～2.44
>0.05
先兆早产
3
12
14
373
6.66
1.31～30.15
<0.05
妊高征
2
13
, 百拇医药
39
348
1.37
0.00～6.84
>0.05
Apgar低分
1
14
14
373
1.84
0.26～13.11
>0.05
, 百拇医药
3.多因素分析：将暴露因素进行Logistic多因素回归分析，仍只有母亲HBeAg阳性与先兆早产史有意义，其OR值分别为17.07 (P=0.0006) 与5.44(P=0.0325)(表2)。结果表明，这二个因素排除各种混杂后仍与HBV宫内感染有关，可能是其主要危险因素。表2 乙肝病毒宫内传播暴露因素的Logistic多元回归分析
参数名
OR值
95%CI
U值
P值
HBeAg阳性
17.07
3.39～86.01
, 百拇医药
3.4382
0.0006
人流史
1.06
0.33～3.38
0.1044
0.9168
1产以上
4.15
0.92～18.86
1.8453
0.0650
, http://www.100md.com 先兆流产
0.08
0.04～2.78
1.0119
0.3079
先兆早产
5.44
1.15～25.67
2.1384
0.0325
妊高征
2.73
0.44～16.88
, http://www.100md.com
1.0810
0.2797
三、母血清HBsAg和HBV DNA含量与宫内传播的相关关系
1. HBsAg滴度：182例HBsAg阳性母血中，RPHA滴度≤1∶8有36例，1∶16～1∶64有59例，1∶128～1∶512有56例，≥1∶1 024有31例；这四种不同滴度的宫内感染率分别为0%(0/36)、1.7%(1/59)、7.1%(4/56)、9.7%(3/31)。可见，随着母亲HBsAg滴度升高，宫内感染率也增加(趋势检验，χ2=6.353，P=0.0117)；也即宫内感染与孕妇HBsAg滴度显著相关。
2.HBV DNA浓度：在185例检测的标本中，血清HBV DNA定量0级的有39例，Ⅰ级72例，Ⅱ级29例，Ⅲ级18例，Ⅳ级27例。其各级的宫内传播率分别为0%、1.4%、3.5%、0%、22.2%。趋势检验：χ2=15.49，P<0.01。同样可见，宫内感染与母血HBV DNA浓度呈非常显著相关。
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四、分子病理学研究结果
1.胎盘HBV总感染率： 经免疫组化与原位杂交， 101例足月孕妇的胎盘组织中，发现存在HBsAg的有34例(33.7%)，存在HBxAg的有38例(37.6%)，存在HBcAg的有21例(20.8%)，存在HBV DNA的有45例(44.6%)。胎盘组织HBV总感染率为44.6%。HBsAg不均一棕色阳性颗粒主要分布在细胞的胞浆中(图1)； HBxAg的分布与HBsAg相似； HBcAg为均一棕色颗粒，主要分布于胞核中，偶见胞浆全浆型分布(图2)；而HBV DNA为兰色颗粒，主要分布于细胞核内，呈全核型(图3)。
图1 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘绒毛组织免疫组化检测HBsAg.滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞胞浆或胞核中的棕黄色信号为HBsAg ABC(苏木素衬染)×200
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图2 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘蜕膜组织免疫组化检测HBcAg.蜕膜细胞和蜕膜毛细血管内皮细胞胞核或胞浆中的棕色信号为HBcAg
ABC(苏木素衬染)×400
图3 HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘绒毛组织原位杂交检测HBV DNA.滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞浆或胞核中的蓝紫色信号为HBV DNA ISH×400
2.胎盘各层细胞HBV感染情况：母面蜕膜HBV感染率为43.6%(44/101)；胎盘屏障中逐层感染率为：滋养层细胞 40.6% (41/101)、绒毛间质细胞36.6% (37/101)、胎儿的绒毛毛细血管内皮细胞 (VCEC) 18.8% (19/101) 。可见，胎盘各层细胞中HBV感染率由母面向胎儿面逐渐降低(趋势检验：χ2=10.97，P=0.0009)。
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五、胎盘绒毛毛细血管内皮细胞HBV感染与宫内传播的关系
101例HBsAg阳性的足月孕妇中，发生宫内感染者8例。把宫内感染作为病例组，余作为对照组。病例组8例中6例(75%)有胎盘VCEC HBV感染；而93例对照组中仅有13例(14%)感染，因此，表明胎盘VCEC HBV感染与宫内传播有非常明显的关系，其OR值为18.46(P=0.0002)。进行Logistic多因素回归分析后发现，其OR为16.15(P=0.0076)。
讨论
关于HBV经胎盘发生宫内传播机制的报告仅数篇[2～4]，而得出的结论完全相反。可能由于其是现况研究或病例报告，胎盘组织研究的方法还不够先进、样本量又较少等原因。我们为规范研究HBV宫内传播的危险因素与机制，一方面作病例对照调查，另一方面利用HBsAg、HBeAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA作为生物学标志(biological markers)，观察其在血清和/或胎盘中的分布或定位及其与宏观研究资料之间的联系。本研究中，暴露因素使用了一些客观指标，同时，由于孕妇的询问调查在病例组分组之前，故调查员询问偏倚小，对结果的影响不大。在病例对照研究中，为避免PCR 检测引起的假阳性，我们使用ELISA检测新生儿血清HBsAg，可能低估了HBV宫内感染率。免疫组化研究中使用了敏感性较高的ABC方法，而且设置多种对照与替代、阻断试验，保证了结果的可靠性。为提高方法的敏感性，我们还用原位杂交检测了胎盘组织中HBV DNA。分别供HBsAg与HBV DNA定量检测的182份与185份母血标本。尽管是整个研究后期采取的，但也采自后期连续性病例,且标本数量较多，故基本上没有破坏样本的代表性。
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我们的病例对照研究发现，无论是单因素分析还是多因素分析均表明，母亲HBeAg阳性和先兆早产史与宫内感染有明显的相关，OR值分别为14.46～17.07与5.44～6.66。结果提示，这二个因素很可能是HBV宫内感染的主要危险因素。
我们的研究表明，母亲血中HBsAg滴度与HBV DNA浓度和宫内感染显著相关(P值分别为0.0117与<0.01)，也即HBsAg滴度与HBV DNA浓度愈高，其引起宫内传播的概率愈高。这与病例对照研究中发现母血HBeAg阳性是主要的危险因素的结果一致。因为一般来说，HBeAg阳性者血清中血HBsAg滴度与HBV DNA含量就高[5，6]。然而，在Lin等[2]与Ohto等[3]的研究报告中，虽然宫内感染的孕妇HBsAg滴度与HBV DNA浓度均高于非宫内感染者，但统计学均未达到显著性。这很可能是样本量小的缘故。
胎盘组织的免疫组化与原位杂交发现，胎盘各层细胞的HBV感染率不同，从母面到胎儿的各层细胞：脱膜、滋养层、绒毛间质、绒毛毛细血管内皮的HBV感染率逐层降低，即愈接近胎儿，其感染率愈低，其趋势检验有非常显著的意义(P=0.0009)。结果提示，HBV在胎盘组织内的感染似有一个逐层“细胞转移”或“细胞传递”的过程。而且很有意思的是，进入胎儿血循环的最后一层细胞——绒毛毛细血管内皮细胞(VCEC)的HBV感染率与宫内感染的发生有非常显著的相关：单因素分析OR值为18.46(P=0.0002)，Logistic回归分析为16.15(P=0.0076)。可见，宫内感染很可能与HBV在胎盘各层组织内“细胞转移”有关。然而，这种“细胞转移”过程是如何发生的?其机制如何?有哪些影响因素? 我们正在作全面而深入的研究。
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综合上述现场与实验室的研究结果，我们首次提出关于HBV经胎盘引起胎儿宫内感染的假设：感染有两条途径：(1)血源性：可由某些因素，如先兆早产，引起胎盘微血管的破损，使高浓度HBV的母血直接进入胎儿循环；(2)细胞源性：高浓度的HBV感染孕妇的脱膜细胞，经过“细胞转移”至胎儿绒毛毛细血管内皮，最后引起胎儿感染。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39370611)
参考文献
[1] 闫永平，徐德忠，王文亮，等.乙型肝炎表面抗原阳性孕妇不同孕期胎盘乙型肝炎病毒的感染状态.中华医学杂志，1998，78：76-77.
[2] Lin H, Lee T, Chen D, et al. Trasplacental leakage of HBeAg-positive maternal blood as the most likely route in causing intrauterine infection with hepatitis B virus. J Pediatr, 1987,111：877-881.
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[3] Ohto H, Lin H, Kawana T, et al. Intrauterine transmission of hepatitis B virus is closely related to placental leakage, J Med Virol, 1987,21：1-6.
[4] 唐时幸，于光烈，程绍尧.HBV宫内感染机制及影响因素的研究.中华流行病学杂志，1991，12：325-326.
[5] 徐德忠，陈友绩.甲、乙型肝炎病毒学标志的临床与流行病学意义.陕西医学杂志，1989,18：37-39.
[6] Chen DS, Lai MY, Lee SC, et al. Serum HBsAg，HBeAg, anti-HBe and hepatitis B viral DNA in asymptomatic carriers in Taiwan. J Med Virol, 1986,19：87-94.
收稿：1998-07-30 修回：1998-10-16, http://www.100md.com