肝癌基因治疗研究
作者：吴孟超 杨广顺 卫立辛 钱其军
单位：200438 上海 第二军医大学东方肝胆外科医院
关键词：
肝癌基因治疗研究 吴孟超 杨广顺 卫立辛 钱其军
原发性肝癌是我国特别高发的恶性肿瘤，手术切除仍是治疗肝癌的首选方法，但总体疗效不理想，迫切需要研究和发展新的治疗方法。肿瘤基因治疗是近年来研究的热点，国内外许多学者针对肝癌基因治疗做了大量工作，虽然目前肝癌基因治疗尚处于体外研究和动物实验阶段，但取得了一些令人鼓舞的结果。
一、肝癌的基因治疗研究方向及策略
分子生物学和免疫学的发展为肿瘤的基因治疗研究提供理论依据和技术方法。肿瘤基因治疗研究主要有如下几个方向[1]:1. 修饰肿瘤细胞获恶性表型相关的基因缺陷；如将外源野生型p53基因转染p53基因突变或失活的肿瘤细胞能逆转其恶性表现；2. 导入免疫原性相关分子以增强肿瘤细胞的免疫原性；这是肿瘤免疫基因治疗研究方向之一。如转导HLA-B7基因至肝癌细胞，增强其免疫原。3. 导入免疫反应相关细胞因子以增强或诱发机体抗肿瘤免疫反应；这方面工作较多，如IL-2、IL-4、TNF-α等[2]，我们实验室进行IL-12基因治疗肝癌实验研究，结果表明在肝癌接种后第1天应用生理盐水对照组及病毒对照组的大鼠均百分之百死亡，其生存时间分别为13.1±1.8及12.6±1.2天，而其肝癌接种后分别1、3、5、7天治疗组，其长期生存率分别为100%、100%、30%及10%，后者死亡大鼠的生存时间分别为21.3±3.2天及18.2±2.9天，生存时间明显延长。对于长期生存大鼠2个月后再次接种肝癌，未发现有肝癌形成，这表明IL-12基因治疗对肝癌有预防作用。同时应用携带重组IL-12基因的逆转录病毒载体包装细胞株直接注射脾脏，其疗效与肝癌局部注射的疗效相似，较为安全，且可能更易于临床应用[3]。4. 自杀基因治疗研究，肿瘤自杀基因(suicide gene)疗法又被称为药物敏感基因(drug sensitivity gene)疗法、分子化疗(molecular chemotherapy)、病毒导向的酶解药物前体疗法(VDEPT)，是一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。即将某些病毒、细菌特有的前药转换酶基因——自杀基因导入到肿瘤细胞，自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，达到杀死肿瘤细胞的目的[4]。目前自杀基因治疗肝癌研究应用最多的是单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)1型或2型胸苷激酶(thymidine kinase)基因编码的胸苷激酶，它能特异性地将核苷类似物如羟甲基无环鸟苷(ganciclovir, GCV)磷酸化，进而在胞内进一步代谢生成三磷酸GCV，后者可抑制细胞DNA聚合酶和作为DNA合成的终结者；5. 对肝癌患者自身的免疫细胞进行基因修饰；应用基因转导技术，在体外将免疫反应相关细胞因子转入免疫细胞中，如肿瘤浸润细胞(TIL)回输体内后，使其更有效地发挥抗肿瘤作用。
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在肝癌基因治疗研究中，基因转导方式分ex vivo和in vivo，前者是获取目标细胞(如肝癌细胞或免疫细胞)后，经体外基因转导处理后回输。后者直接在体内原位转导目标细胞。ex vivo大多用细胞因子及免疫相关的基因转导肿瘤细胞，制成疫苗或转导免疫细胞回输，常用于肝癌的免疫基因治疗研究。ex vivo需获取肿瘤组织和免疫细胞，一旦应用临床常适应于手术治疗后患者；还不能解决中晚期非手术治疗患者。而in vivo则可应用于这部分患者。in vivo常用于自杀基因(HSV-TK)和p53基因治疗研究，应用杀伤作用的基因，不但直接抑制或杀伤肿瘤细胞，还可能累及癌旁组织以及正常重要的组织，如骨髓。故在in vivo肝癌的基因治疗时，高效、导向的基因导入系统成为关键，若仅部分肿瘤细胞被导入基因，不会有明显效果。解决导向性的高效载体系统，成为肝癌及其它肿瘤基因治疗最迫切的问题。
二、肝癌基因治疗的载体
理想的基因治疗病毒载体应具有低毒、高效、大容量、可控基因转导及表达的特点。到目前为止，尚无一种病毒载体能同时满足上述要求。目前研究应用最广泛的有逆转录病毒载体，其次为腺病毒载体。
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逆转录病毒载体来源于逆转录病毒，保留了逆转录病毒基因组的两端(LTRs)序列，缺失了包装感染性病毒颗粒所必须的蛋白质的编码序列，在基因转移时这些缺失的序列将被外源基因取代。逆转录病毒载体在使治疗基因进入靶细胞并将外源基因整合入基因组，实现目的基因持久稳定表达。虽然逆转录病毒载体介导的基因转移在肝癌基因治疗中应用广泛，但逆转录毒载体尚有可改进的方面。在肝癌基因治疗中，逆转录病毒载体除了其只能转染分裂细胞、使靶细胞发生插入突变和激活癌基因等普遍性缺陷外，体内实验发现逆转录病毒转导的外源基因在肝癌细胞表达低，说明该类载体不适于介导直接体内基因的转导，这些削减了逆转录病毒载体的使用价值。
腺病毒载体在目前研究应用较多，它之所以引起兴趣是因为它具有体内基因转导能力(in vivo)。它可以有效地感染非分裂期细胞，并携带大量的基因片段，最重要的是，它携带的基因不整合到宿主细胞染色体上，大大降低了由整合而带来的危险性。同时，腺病毒载体存在着不能整合到靶细胞基因组、不能长期稳定表达、转染靶细胞后产生免疫反应从而降低转染效率和限制重复应用和对肝细胞有损伤作用的缺点。
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基因治疗涉及的非病毒基因转移包括机械法(直接注射)、化学法和生物化学法，其中化学法中脂质体载体介导的基因转移在肝癌基因治疗中也有报道。脂质体介导的基因转移虽有操作简单、使用安全和可携带较大DNA分子等优点，但其转染效率低和缺乏细胞特异性也局限了其应用。
三、肝癌基因治疗的靶向性转导
基因治疗特别是自杀基因疗法、基因转导及表达的靶向性关系到治疗的高效性和是否对正常机体组织产生损害。在靶向性转导方面，逆转录病毒只感染分裂细胞的特性使其所转导的细胞具有相对特异性，这对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适，但是应用in vivo法就要对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛组织产生致死性杀伤作用，产生与放、化疗相似副作用的危险[5]。在采用逆转录病毒载体转导自杀基因治疗肝癌中，许多学者将TK基因置于AFP基因上游转录调控区之下，达到了使自杀基因在分泌AFP的肝癌细胞中表达的目的[6]。最近Cao等[7]采用逆转录病毒载体转导TNF-α基因在肝癌细胞表达，通过将TNF-α基因置于白蛋白启动子/ 增强子下。使其在表达白蛋白的肝癌细胞特异性表达。
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腺病毒载体虽可因肝脏有丰富腺病毒受体而静脉注射时大量(可达90%)集中在肝脏组织，但由于腺病毒对分裂及静息细胞均有感染性，同样也达不到肝癌组织靶向性转导的目的。于是研究者更多地把目光投向目的基因在肝癌组织靶向性表达方面，即将目的基因置于肝癌特异性转录调控序列之下，达到使目的基因在肝癌组织特异性表达的目的。目前研究较多的是AFP启动子/ 增强子，它们使调控的目的基因能在AFP阳性的肝癌细胞中特异性表达，而在AFP阴性的肝癌细胞及非肝癌细胞中不能表达或低表达。同时必须充分考虑到90%以上肝癌患者的肝癌组织属肝炎或坏死后肝硬化，其中AFP也呈不同程度的过量表达[8]。最近，Freytay等[9]构建E1B缺失重组两个自杀基因(CD和TK)的腺病毒载体。E1B缺失腺病毒可选择性在p53功能缺失的肿瘤细胞中扩增，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的。
四、存在问题及展望
当前对肝癌基因治疗研究虽然取得了很多有意义的结果，但仍存在着许多问题[10]：1. 缺乏高效载体系统，若基因的作用是直接抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞，高效的基因导入系统成为关键。因仅部分肿瘤细胞被导入基因，不会有明显效果。2. 缺乏特异的导向性载体，若应用具有杀伤作用的基因，癌旁组织以及其它重要组织(如骨髓)会被累及。要防止这一点，导入载体系统是首要的。采用某种选择性表达的元件(如AFP)加入载体中，可能起到一些作用，但在人体中估计难以取得效果。3. 肝癌动物模型与人体肿瘤存在差异：目前肝癌的基因治疗研究处在实验阶段。目前常用动物模型是在正常动物移植形成肿瘤。而人体肿瘤是在病毒或化学致癌物作用下，且在细胞突变和机体免疫选择的双重作用，经过许多阶段逐渐形成，肝癌不单肝脏发生异常，实际患者全身免疫系统也发生改变。实验研究证实有效。而在临床应用中不一定有效。这在其它肿瘤基因治疗研究结果已得到证实，如美国国立卫生研究院(NIH)对美国1995～1996年已进行的103个基因治疗方案进行了评估，仅5～6个方案可能有一定效果。上述问题也是其它肿瘤基因治疗所面临的共同问题，只有随着分子生物学技术的发展，低毒、高效、大容量载体的建立，新的功能基因的发现，肝癌的基因治疗才可能成为一项新技术应用于临床。
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第一作者简介：本刊名誉总编辑。现任第二军医大学东方肝胆外科医院院长，教授，博士生导师。中国科学院院士、中华医学会副会长、解放军医学科学技术委员会副主任、中国癌症基金会副主席、中德医学协会副理事长、中日消化道外科学会中方主席。中华医学杂志、中华外科杂志等20多种医学专业期刊主编或副主编。1996年被中央军委授予“模范医学专家”荣誉称号。
参考文献
[1] Schuster MJ, Wu GY. Gene therapy for hepatocellular carcinoma: Progress but many stones yet unturned. Gastroenterology , 1997,112:656-659.
[2] Tepper RE, Mule JJ. Experimental and clinical studies of cytokine genemodified tumor cells. Human Gene Ther, 1994,5:153-164.
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[3] 杨家和，吴孟超.白细胞介素12对肝癌的基因治疗研究.第四届全国普外科中青年医师学术交流会暨第七届全国普外科学术交流会资料汇编.1998,9:68-69.
[4] Brand K, Arnold W, Bartels T, et al. Liver-associated toxicity of the HSV-TK/ GCV approach and adenoviral vectors. Cancer Gene Ther, 1997,4:9-16.
[5] Miller DG, Adam MA, Miller AD, et al, Gene transfer by retrovirus vector occurs only in cells that are acttively replicating at the time of infection. Moll Cell Biol, 1990,10:4239-4242.
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[6] Kanai F, Shiratori Y, Yoshida Y, et al. Gene therapy for alpha-fetophotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hepatology, 1996,23:1359-1368.
[7] Cao G, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor α gene transfer. Gastroenterology, 1997,112:501-510.
[8] Macri P, Gorden JW. Delayed morbidity and mortality of albumin/ sv40T-antigen transgenic mice after insertion of an alpha-fetoprotein/ herps virus thymidine kinase transgene and treatment with ganciclovir. Human Gene Ther, 1994,5:175-182.
[9] Freytag SO, Rogulski KR, Paielli DL, et al. A novel three-pronged approach to kill cancer cells selectively:concomiant viral, double suicide gene, and radiotherapy. Hum Gene Ther,1998,9:1323-1333.
[10] Anderson WF. Human gene therapy. Nature, 1998,392:25-30.
(收稿：1998-10-05), http://www.100md.com
单位：200438 上海 第二军医大学东方肝胆外科医院
关键词：
肝癌基因治疗研究 吴孟超 杨广顺 卫立辛 钱其军
原发性肝癌是我国特别高发的恶性肿瘤，手术切除仍是治疗肝癌的首选方法，但总体疗效不理想，迫切需要研究和发展新的治疗方法。肿瘤基因治疗是近年来研究的热点，国内外许多学者针对肝癌基因治疗做了大量工作，虽然目前肝癌基因治疗尚处于体外研究和动物实验阶段，但取得了一些令人鼓舞的结果。
一、肝癌的基因治疗研究方向及策略
分子生物学和免疫学的发展为肿瘤的基因治疗研究提供理论依据和技术方法。肿瘤基因治疗研究主要有如下几个方向[1]:1. 修饰肿瘤细胞获恶性表型相关的基因缺陷；如将外源野生型p53基因转染p53基因突变或失活的肿瘤细胞能逆转其恶性表现；2. 导入免疫原性相关分子以增强肿瘤细胞的免疫原性；这是肿瘤免疫基因治疗研究方向之一。如转导HLA-B7基因至肝癌细胞，增强其免疫原。3. 导入免疫反应相关细胞因子以增强或诱发机体抗肿瘤免疫反应；这方面工作较多，如IL-2、IL-4、TNF-α等[2]，我们实验室进行IL-12基因治疗肝癌实验研究，结果表明在肝癌接种后第1天应用生理盐水对照组及病毒对照组的大鼠均百分之百死亡，其生存时间分别为13.1±1.8及12.6±1.2天，而其肝癌接种后分别1、3、5、7天治疗组，其长期生存率分别为100%、100%、30%及10%，后者死亡大鼠的生存时间分别为21.3±3.2天及18.2±2.9天，生存时间明显延长。对于长期生存大鼠2个月后再次接种肝癌，未发现有肝癌形成，这表明IL-12基因治疗对肝癌有预防作用。同时应用携带重组IL-12基因的逆转录病毒载体包装细胞株直接注射脾脏，其疗效与肝癌局部注射的疗效相似，较为安全，且可能更易于临床应用[3]。4. 自杀基因治疗研究，肿瘤自杀基因(suicide gene)疗法又被称为药物敏感基因(drug sensitivity gene)疗法、分子化疗(molecular chemotherapy)、病毒导向的酶解药物前体疗法(VDEPT)，是一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。即将某些病毒、细菌特有的前药转换酶基因——自杀基因导入到肿瘤细胞，自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，达到杀死肿瘤细胞的目的[4]。目前自杀基因治疗肝癌研究应用最多的是单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)1型或2型胸苷激酶(thymidine kinase)基因编码的胸苷激酶，它能特异性地将核苷类似物如羟甲基无环鸟苷(ganciclovir, GCV)磷酸化，进而在胞内进一步代谢生成三磷酸GCV，后者可抑制细胞DNA聚合酶和作为DNA合成的终结者；5. 对肝癌患者自身的免疫细胞进行基因修饰；应用基因转导技术，在体外将免疫反应相关细胞因子转入免疫细胞中，如肿瘤浸润细胞(TIL)回输体内后，使其更有效地发挥抗肿瘤作用。
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在肝癌基因治疗研究中，基因转导方式分ex vivo和in vivo，前者是获取目标细胞(如肝癌细胞或免疫细胞)后，经体外基因转导处理后回输。后者直接在体内原位转导目标细胞。ex vivo大多用细胞因子及免疫相关的基因转导肿瘤细胞，制成疫苗或转导免疫细胞回输，常用于肝癌的免疫基因治疗研究。ex vivo需获取肿瘤组织和免疫细胞，一旦应用临床常适应于手术治疗后患者；还不能解决中晚期非手术治疗患者。而in vivo则可应用于这部分患者。in vivo常用于自杀基因(HSV-TK)和p53基因治疗研究，应用杀伤作用的基因，不但直接抑制或杀伤肿瘤细胞，还可能累及癌旁组织以及正常重要的组织，如骨髓。故在in vivo肝癌的基因治疗时，高效、导向的基因导入系统成为关键，若仅部分肿瘤细胞被导入基因，不会有明显效果。解决导向性的高效载体系统，成为肝癌及其它肿瘤基因治疗最迫切的问题。
二、肝癌基因治疗的载体
理想的基因治疗病毒载体应具有低毒、高效、大容量、可控基因转导及表达的特点。到目前为止，尚无一种病毒载体能同时满足上述要求。目前研究应用最广泛的有逆转录病毒载体，其次为腺病毒载体。
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逆转录病毒载体来源于逆转录病毒，保留了逆转录病毒基因组的两端(LTRs)序列，缺失了包装感染性病毒颗粒所必须的蛋白质的编码序列，在基因转移时这些缺失的序列将被外源基因取代。逆转录病毒载体在使治疗基因进入靶细胞并将外源基因整合入基因组，实现目的基因持久稳定表达。虽然逆转录病毒载体介导的基因转移在肝癌基因治疗中应用广泛，但逆转录毒载体尚有可改进的方面。在肝癌基因治疗中，逆转录病毒载体除了其只能转染分裂细胞、使靶细胞发生插入突变和激活癌基因等普遍性缺陷外，体内实验发现逆转录病毒转导的外源基因在肝癌细胞表达低，说明该类载体不适于介导直接体内基因的转导，这些削减了逆转录病毒载体的使用价值。
腺病毒载体在目前研究应用较多，它之所以引起兴趣是因为它具有体内基因转导能力(in vivo)。它可以有效地感染非分裂期细胞，并携带大量的基因片段，最重要的是，它携带的基因不整合到宿主细胞染色体上，大大降低了由整合而带来的危险性。同时，腺病毒载体存在着不能整合到靶细胞基因组、不能长期稳定表达、转染靶细胞后产生免疫反应从而降低转染效率和限制重复应用和对肝细胞有损伤作用的缺点。
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基因治疗涉及的非病毒基因转移包括机械法(直接注射)、化学法和生物化学法，其中化学法中脂质体载体介导的基因转移在肝癌基因治疗中也有报道。脂质体介导的基因转移虽有操作简单、使用安全和可携带较大DNA分子等优点，但其转染效率低和缺乏细胞特异性也局限了其应用。
三、肝癌基因治疗的靶向性转导
基因治疗特别是自杀基因疗法、基因转导及表达的靶向性关系到治疗的高效性和是否对正常机体组织产生损害。在靶向性转导方面，逆转录病毒只感染分裂细胞的特性使其所转导的细胞具有相对特异性，这对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适，但是应用in vivo法就要对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛组织产生致死性杀伤作用，产生与放、化疗相似副作用的危险[5]。在采用逆转录病毒载体转导自杀基因治疗肝癌中，许多学者将TK基因置于AFP基因上游转录调控区之下，达到了使自杀基因在分泌AFP的肝癌细胞中表达的目的[6]。最近Cao等[7]采用逆转录病毒载体转导TNF-α基因在肝癌细胞表达，通过将TNF-α基因置于白蛋白启动子/ 增强子下。使其在表达白蛋白的肝癌细胞特异性表达。
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腺病毒载体虽可因肝脏有丰富腺病毒受体而静脉注射时大量(可达90%)集中在肝脏组织，但由于腺病毒对分裂及静息细胞均有感染性，同样也达不到肝癌组织靶向性转导的目的。于是研究者更多地把目光投向目的基因在肝癌组织靶向性表达方面，即将目的基因置于肝癌特异性转录调控序列之下，达到使目的基因在肝癌组织特异性表达的目的。目前研究较多的是AFP启动子/ 增强子，它们使调控的目的基因能在AFP阳性的肝癌细胞中特异性表达，而在AFP阴性的肝癌细胞及非肝癌细胞中不能表达或低表达。同时必须充分考虑到90%以上肝癌患者的肝癌组织属肝炎或坏死后肝硬化，其中AFP也呈不同程度的过量表达[8]。最近，Freytay等[9]构建E1B缺失重组两个自杀基因(CD和TK)的腺病毒载体。E1B缺失腺病毒可选择性在p53功能缺失的肿瘤细胞中扩增，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的。
四、存在问题及展望
当前对肝癌基因治疗研究虽然取得了很多有意义的结果，但仍存在着许多问题[10]：1. 缺乏高效载体系统，若基因的作用是直接抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞，高效的基因导入系统成为关键。因仅部分肿瘤细胞被导入基因，不会有明显效果。2. 缺乏特异的导向性载体，若应用具有杀伤作用的基因，癌旁组织以及其它重要组织(如骨髓)会被累及。要防止这一点，导入载体系统是首要的。采用某种选择性表达的元件(如AFP)加入载体中，可能起到一些作用，但在人体中估计难以取得效果。3. 肝癌动物模型与人体肿瘤存在差异：目前肝癌的基因治疗研究处在实验阶段。目前常用动物模型是在正常动物移植形成肿瘤。而人体肿瘤是在病毒或化学致癌物作用下，且在细胞突变和机体免疫选择的双重作用，经过许多阶段逐渐形成，肝癌不单肝脏发生异常，实际患者全身免疫系统也发生改变。实验研究证实有效。而在临床应用中不一定有效。这在其它肿瘤基因治疗研究结果已得到证实，如美国国立卫生研究院(NIH)对美国1995～1996年已进行的103个基因治疗方案进行了评估，仅5～6个方案可能有一定效果。上述问题也是其它肿瘤基因治疗所面临的共同问题，只有随着分子生物学技术的发展，低毒、高效、大容量载体的建立，新的功能基因的发现，肝癌的基因治疗才可能成为一项新技术应用于临床。
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第一作者简介：本刊名誉总编辑。现任第二军医大学东方肝胆外科医院院长，教授，博士生导师。中国科学院院士、中华医学会副会长、解放军医学科学技术委员会副主任、中国癌症基金会副主席、中德医学协会副理事长、中日消化道外科学会中方主席。中华医学杂志、中华外科杂志等20多种医学专业期刊主编或副主编。1996年被中央军委授予“模范医学专家”荣誉称号。
参考文献
[1] Schuster MJ, Wu GY. Gene therapy for hepatocellular carcinoma: Progress but many stones yet unturned. Gastroenterology , 1997,112:656-659.
[2] Tepper RE, Mule JJ. Experimental and clinical studies of cytokine genemodified tumor cells. Human Gene Ther, 1994,5:153-164.
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[3] 杨家和，吴孟超.白细胞介素12对肝癌的基因治疗研究.第四届全国普外科中青年医师学术交流会暨第七届全国普外科学术交流会资料汇编.1998,9:68-69.
[4] Brand K, Arnold W, Bartels T, et al. Liver-associated toxicity of the HSV-TK/ GCV approach and adenoviral vectors. Cancer Gene Ther, 1997,4:9-16.
[5] Miller DG, Adam MA, Miller AD, et al, Gene transfer by retrovirus vector occurs only in cells that are acttively replicating at the time of infection. Moll Cell Biol, 1990,10:4239-4242.
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[6] Kanai F, Shiratori Y, Yoshida Y, et al. Gene therapy for alpha-fetophotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hepatology, 1996,23:1359-1368.
[7] Cao G, Kuriyama S, Du P, et al. Complete regression of established murine hepatocellular carcinoma by in vivo tumor necrosis factor α gene transfer. Gastroenterology, 1997,112:501-510.
[8] Macri P, Gorden JW. Delayed morbidity and mortality of albumin/ sv40T-antigen transgenic mice after insertion of an alpha-fetoprotein/ herps virus thymidine kinase transgene and treatment with ganciclovir. Human Gene Ther, 1994,5:175-182.
[9] Freytag SO, Rogulski KR, Paielli DL, et al. A novel three-pronged approach to kill cancer cells selectively:concomiant viral, double suicide gene, and radiotherapy. Hum Gene Ther,1998,9:1323-1333.
[10] Anderson WF. Human gene therapy. Nature, 1998,392:25-30.
(收稿：1998-10-05), http://www.100md.com