烧伤对垂体-睾丸轴影响的临床研究
作者：达明绪 马克娴 段体武
单位：650101 昆明，昆明医学院第二附属医院烧伤研究室(达明绪现在山东济宁医学院附属医院 272129)
关键词：烧伤；卵泡刺激素；黄体生成素；睾酮；雌二醇
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【摘要】目的：探讨鼻咽癌放疗中是否存在肿瘤细胞的加速增殖，为鼻咽癌后程加速超分割治疗提供依据。方法：对放疗3～4周时的鼻咽癌行鼻咽纤维镜活检，利用自动图象分析仪对病理活检阳性者进行疗前、疗中的细胞增殖动力学参数AgNORs的检测和自身前后计量对照。结果：共得到14对放疗前、放疗中3～4周时的AgNORs检测自身前后对照计量资料进行配对t检验，结果表明放疗中的各参数大于疗前的各参数，疗前、疗中平均每核AgNORs颗粒面积分别为10.19和15.28μm2，平均每核AgNORs颗粒数为12.61和18.09，AgNORs颗粒面积与核面积比值为0.141和0.200，平均每个AgNORs颗粒面积为2.60和3.49，差别具有显著性(P=0.000～0.010)。结论：鼻咽癌放疗过程存在着肿瘤细胞加速再增殖，这时予以加量加速治疗具有一定的必要性。
, 百拇医药
中图号：R739.63；R730.2
Comparison the dynamic of tumor clonogenic cells
of nasopharygeal carcinoma before and
during radiotherapy and its meaning
Gao Jianming Mao Zhida Zhao Meiqing, et al.
Tumor Hospital of Sun Yat Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Aims: To detect whether there is the accelerated proliferation of tumor clonogenic cell during Radiotherapy of NPC. Methods: The values of vary kinds of AgNORs parameters, such as the mean area per nucleus, the mean total AgNORs area per nucleus, the mean AgNORs numbers per nucleus, the total AgNORs area divided by the total nucleolus area and the mean area per AgNORs, were measured in paraffin sections from 41 cases of NPC by automatic image analysis. Thirty- three cases of 41 cases took the second biopsy. Fourteen pairs of self- contrasted AgNORs parameters before and 3 to 4 weeks during radiotherapy were obtained. Results: The outcome of paired t- test showed that all the parameters before the treatment were lowere than 3 to 4 weeks during the therapy, 71.69 vs 75.79 μ m2, 10.19 vs 15.28 μ m2, 12.61 vs 18.09, 0.141 vs 0.200, 2.60 vs 3.49 μ m2 in turn, p=0.000～ 0.010. Conclusion: The increase of velocity and multiplication rate during the therapy become quicker than before the therapy. So, it is necessary to increase doses and fractions this time.
, 百拇医药
Key words： Nasopharyngeal carcinoma； The dynamic of tumor clonogenic cells； AgNORs
放射治疗的成败取决于它的辐射性生物学效应。放射生物学的新近研究进展认为过去一直以为在放射治疗期间不会再有细胞增殖的肿瘤干细胞会发生加速再增殖。在常规分割放射治疗的过程中，残留肿瘤的加速再增殖是非常重要的现象，这种放疗中的加速再增殖是治疗失败的主要原因之一〔1，2〕。常见肿瘤鼻咽癌放疗中是否存在这种加速再增殖目前尚无活体检测的研究报道，而是否存在这种加速再增殖是探讨鼻咽癌放射治疗成败原因和改进放疗分割方式的途径之一。因此，我们进行了鼻咽癌疗前疗中的细胞增殖动力学参数AgNORs的检测和比较。
1 材料和方法
1.1标本
自1995年12月至1997年1月在本院放疗并有病理者41例，其中33例在放疗中3～4周时再行鼻咽纤维镜活检，病理阳性者16例，进行AgNORs染色，2例因活检组织少或染色太重而被剔除。共得到14对放疗前、放疗中3～4周时的AgNORs检测自身前后对照计量资料进行配对t检验。
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附表 放疗前、放疗中3～4周时AgNORs检测值比较
放疗前
放疗中3～4周时
均数
标准差
标准误
均数
标准差
标准误
t
P
平均核面积(μm2)
, 百拇医药
71.69
5.98
1.60
75.79
7.91
2.12
13
0.010
平均每核AgNORs
颗粒面积(μm2)
10.12
2.38
, 百拇医药 0.64
15.28
4.35
1.16
13
0.000
平均每核AgNORs
颗粒数
12.61
2.60
0.69
18.09
4.68
, http://www.100md.com
0.25
13
0.000
AgNORs颗粒面积
与核面积比值
0.141
0.030
0.008
0.200
0.047
0.012
13
0.000
, http://www.100md.com
平均每个AgNORs
颗粒面积(μm2)
2.60
0.90
0.24
3.49
1.03
0.28
13
0.001
1.2核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)的染色和检测
(1)染色：①取组织蜡块切片，厚度在3～4um，首先用二甲苯脱蜡3次，后用双蒸水清洗。②在染色前将2g明胶溶于1%的甲醇100ml中配制甲液，50%硝酸银溶液为乙液，在使用前将甲液与乙液以1∶2的比例混合配制。③石蜡切片水化后，将混合配制液滴在玻片上，然后放在暗室中，室温保存60分钟，取出在镜下观看是否清晰，然后再经水洗，脱水，透明后封胶固定。
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(2)检测：遵照AgNORs研究工作的方案〔3〕，在显微镜下找定观察区，然后将图像输入自动图像分析仪，利用鼠标划出100个或以上边界清楚的鼻咽癌细胞核，利用图像分析仪自动测定细胞核的总面积和细胞核个数，两者相除，计数出平均核面积。然后利用图像分析仪的灰度功能取出AgNORs颗粒，利用计算机进行藕合，得出上述所测细胞核的AgNORs颗粒，并将其根据直径大小区分开来，直径<2.5μm，≤2.5μm～<5μm，≤5μm～<10μm，≥10μm图像分析仪将显示各大小区域的AgNORs颗粒总面积和数目。直径<2.5μm每颗粒按1个颗粒数计算，≤2.5μm～<5μm按5个颗粒数计算，≤5μm～<10μm按10个颗粒数计算，直径≥10μm按15个颗粒计算。得出每例的每核平均颗粒面积，每核平均颗粒数，每核AgNORs颗粒总面积与细胞核面积比值以及每个AgNORs颗粒平均面积。
2 结果
2.1放疗前、放疗中3～4周时AgNORs检测值比较
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放疗中AgNORs各参数均大于放疗前AgNORs各参数且差别具有显著性。详见附表。
3 讨论
利用AgNORs技术来检测肿瘤细胞增殖动力学具有可行性和先进性。新的研究业已发现，AgNORs含量与流式细胞所测的S期细胞比例、DNA含量、Ki-67标染及PCNA等均有显著的相关性〔4〕，而且同采用3H-TdR,Idurd或Brdu摄入法进行的DNA合成期细胞(S期)标记并采用流式细胞术进行测定和分析的标记指数(Labeling indx,LI)、DNA含量(DNA Contents)、S期比例(S-phase cell ratio)以及建立在上述检测基础上的Tpot(Potential doubling time)相比，1994年R.Rodriguez报道存在着超过10%不被Idurd标记的克隆细胞，从而Tpot研究的成功率约为80～85%左右〔5〕，且流式细胞术利用单细胞悬液，从而丧失了组织形态方面的信息，从而受到部分非肿瘤细胞成份的干扰，因此，黄胡信等认为AgNORs可以代替Brdu渗入试验〔6〕。1996年F.G.Barker对成胶质细胞瘤的Brdu标记指数和放射治疗反应及生存率的关系的研究认为，两者之间并无显著相关性〔7〕。1994年M.Derenzini对11种人类器官肿瘤体外细胞群进行了检测，认为DNA含量与细胞倍增时间(Cell doubling time)无显著相关性，而AgNORs计量和细胞增殖速度严格相关〔8〕。1995年，他再次报告了对AgNORs和Portein B23的检测结果，证实AgNORs和人类肿瘤细胞倍增时间严格的负相关〔9〕。与Ki-67和PCNA相比，Ki-67检测时需用冰冻组织而影响其常规应用，且Ki-67和PCNA的检测结果是一种分级计数资料，而AgNORs与Tpot一样是计量资料，可以更准确地反映肿瘤细胞增殖的情况〔4〕。
, 百拇医药
在鼻咽癌放疗中的3～4周开始予以加量加速治疗具有一定的必要性。从本文鼻咽癌放疗前和放疗中3～4周时的AgNORs各参数的自身前后对照统计分析结果来看，放疗中3～4周时AgNORs各参数值均大于放疗前且差别显著，而新的研究已发现AgNORs与细胞倍增时间(Celldoubling time)密切相关，这提示在鼻咽癌放疗过程中存在着肿瘤细胞的加速再增殖。这时予加量加速治疗具有一定的必要性。这与Wither等以Tpot检测说明头颈肿瘤放疗中发生加速再增殖的结果相似，也与Wither提出超过3～4周的治疗期每延长1天，应补偿≥0.6Gy的剂量的看法相一致〔10〕。
参考文献
[1]冯炎.分割治疗中剂量/时间因素的生物学基础.中华放射肿瘤学杂志，1995，4(2)：702
[2]田野，徐国镇，余子豪.头颈部鳞癌超分割放疗的理论基础和临床结果.中华放射肿瘤学杂志，1994，3(3)：204
, 百拇医药
[3]许良中.关于AgNORs研究工作的标准化方案.肿瘤，1993，13(4)：162
[4]周丁华.肿瘤增殖动力学研究的方法学.国外医学肿瘤分册，1995，22：136
[5]Rodriguez R, Ritter WA, Fowler JF, et al. Kinetics of cell labeling and thymidine replacement after continuous infusion of halogenaeed pyrimidines in vivo. Int J Radiat Onol Bio Phys, 1994， 29(1)： 105
[6]黄胡信，王益夫，王炜.卵巢透明细胞癌中核仁组织原点计数与溴化脱氧苷参入的相关性研究.中华肿瘤杂志，14(2)：87
[7]Barker Fer, Pfrodos MD, Chang SM, et al. Brdu labeling index in glioblastoma mutiforme: relation to radiation response ageand survival. Int J Radiat Oncol Bio Rhys, 1996，34(4)：803
, 百拇医药
[8]Derenzini M, Trtere D, Chieco P, et al. Interphase AgNORs quantity is not related to DNA content in established human cell lines. Exp Cell Res, 1994，211(2)：282
[9]Derenzini M, Sirri V, Trer D. The quantity of nucleolar protein nucleolin and protein B23 is related to cell doubling time in human cancer cells. Lab Invest, 1995，73(4)：497
[10]Withers HR, Taylor JMG, Macrejewski B. The hazard of accelerated Tumor clonogen Repopulation during Radiotherapy. Acta Oncol, 1988，27：131
(收稿：1998-03-26修回：1998-06-16), 百拇医药
单位：650101 昆明，昆明医学院第二附属医院烧伤研究室(达明绪现在山东济宁医学院附属医院 272129)
关键词：烧伤；卵泡刺激素；黄体生成素；睾酮；雌二醇
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【摘要】目的：探讨鼻咽癌放疗中是否存在肿瘤细胞的加速增殖，为鼻咽癌后程加速超分割治疗提供依据。方法：对放疗3～4周时的鼻咽癌行鼻咽纤维镜活检，利用自动图象分析仪对病理活检阳性者进行疗前、疗中的细胞增殖动力学参数AgNORs的检测和自身前后计量对照。结果：共得到14对放疗前、放疗中3～4周时的AgNORs检测自身前后对照计量资料进行配对t检验，结果表明放疗中的各参数大于疗前的各参数，疗前、疗中平均每核AgNORs颗粒面积分别为10.19和15.28μm2，平均每核AgNORs颗粒数为12.61和18.09，AgNORs颗粒面积与核面积比值为0.141和0.200，平均每个AgNORs颗粒面积为2.60和3.49，差别具有显著性(P=0.000～0.010)。结论：鼻咽癌放疗过程存在着肿瘤细胞加速再增殖，这时予以加量加速治疗具有一定的必要性。
, 百拇医药
中图号：R739.63；R730.2
Comparison the dynamic of tumor clonogenic cells
of nasopharygeal carcinoma before and
during radiotherapy and its meaning
Gao Jianming Mao Zhida Zhao Meiqing, et al.
Tumor Hospital of Sun Yat Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Aims: To detect whether there is the accelerated proliferation of tumor clonogenic cell during Radiotherapy of NPC. Methods: The values of vary kinds of AgNORs parameters, such as the mean area per nucleus, the mean total AgNORs area per nucleus, the mean AgNORs numbers per nucleus, the total AgNORs area divided by the total nucleolus area and the mean area per AgNORs, were measured in paraffin sections from 41 cases of NPC by automatic image analysis. Thirty- three cases of 41 cases took the second biopsy. Fourteen pairs of self- contrasted AgNORs parameters before and 3 to 4 weeks during radiotherapy were obtained. Results: The outcome of paired t- test showed that all the parameters before the treatment were lowere than 3 to 4 weeks during the therapy, 71.69 vs 75.79 μ m2, 10.19 vs 15.28 μ m2, 12.61 vs 18.09, 0.141 vs 0.200, 2.60 vs 3.49 μ m2 in turn, p=0.000～ 0.010. Conclusion: The increase of velocity and multiplication rate during the therapy become quicker than before the therapy. So, it is necessary to increase doses and fractions this time.
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Key words： Nasopharyngeal carcinoma； The dynamic of tumor clonogenic cells； AgNORs
放射治疗的成败取决于它的辐射性生物学效应。放射生物学的新近研究进展认为过去一直以为在放射治疗期间不会再有细胞增殖的肿瘤干细胞会发生加速再增殖。在常规分割放射治疗的过程中，残留肿瘤的加速再增殖是非常重要的现象，这种放疗中的加速再增殖是治疗失败的主要原因之一〔1，2〕。常见肿瘤鼻咽癌放疗中是否存在这种加速再增殖目前尚无活体检测的研究报道，而是否存在这种加速再增殖是探讨鼻咽癌放射治疗成败原因和改进放疗分割方式的途径之一。因此，我们进行了鼻咽癌疗前疗中的细胞增殖动力学参数AgNORs的检测和比较。
1 材料和方法
1.1标本
自1995年12月至1997年1月在本院放疗并有病理者41例，其中33例在放疗中3～4周时再行鼻咽纤维镜活检，病理阳性者16例，进行AgNORs染色，2例因活检组织少或染色太重而被剔除。共得到14对放疗前、放疗中3～4周时的AgNORs检测自身前后对照计量资料进行配对t检验。
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附表 放疗前、放疗中3～4周时AgNORs检测值比较
放疗前
放疗中3～4周时
均数
标准差
标准误
均数
标准差
标准误
t
P
平均核面积(μm2)
, 百拇医药
71.69
5.98
1.60
75.79
7.91
2.12
13
0.010
平均每核AgNORs
颗粒面积(μm2)
10.12
2.38
, 百拇医药 0.64
15.28
4.35
1.16
13
0.000
平均每核AgNORs
颗粒数
12.61
2.60
0.69
18.09
4.68
, http://www.100md.com
0.25
13
0.000
AgNORs颗粒面积
与核面积比值
0.141
0.030
0.008
0.200
0.047
0.012
13
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平均每个AgNORs
颗粒面积(μm2)
2.60
0.90
0.24
3.49
1.03
0.28
13
0.001
1.2核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)的染色和检测
(1)染色：①取组织蜡块切片，厚度在3～4um，首先用二甲苯脱蜡3次，后用双蒸水清洗。②在染色前将2g明胶溶于1%的甲醇100ml中配制甲液，50%硝酸银溶液为乙液，在使用前将甲液与乙液以1∶2的比例混合配制。③石蜡切片水化后，将混合配制液滴在玻片上，然后放在暗室中，室温保存60分钟，取出在镜下观看是否清晰，然后再经水洗，脱水，透明后封胶固定。
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(2)检测：遵照AgNORs研究工作的方案〔3〕，在显微镜下找定观察区，然后将图像输入自动图像分析仪，利用鼠标划出100个或以上边界清楚的鼻咽癌细胞核，利用图像分析仪自动测定细胞核的总面积和细胞核个数，两者相除，计数出平均核面积。然后利用图像分析仪的灰度功能取出AgNORs颗粒，利用计算机进行藕合，得出上述所测细胞核的AgNORs颗粒，并将其根据直径大小区分开来，直径<2.5μm，≤2.5μm～<5μm，≤5μm～<10μm，≥10μm图像分析仪将显示各大小区域的AgNORs颗粒总面积和数目。直径<2.5μm每颗粒按1个颗粒数计算，≤2.5μm～<5μm按5个颗粒数计算，≤5μm～<10μm按10个颗粒数计算，直径≥10μm按15个颗粒计算。得出每例的每核平均颗粒面积，每核平均颗粒数，每核AgNORs颗粒总面积与细胞核面积比值以及每个AgNORs颗粒平均面积。
2 结果
2.1放疗前、放疗中3～4周时AgNORs检测值比较
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放疗中AgNORs各参数均大于放疗前AgNORs各参数且差别具有显著性。详见附表。
3 讨论
利用AgNORs技术来检测肿瘤细胞增殖动力学具有可行性和先进性。新的研究业已发现，AgNORs含量与流式细胞所测的S期细胞比例、DNA含量、Ki-67标染及PCNA等均有显著的相关性〔4〕，而且同采用3H-TdR,Idurd或Brdu摄入法进行的DNA合成期细胞(S期)标记并采用流式细胞术进行测定和分析的标记指数(Labeling indx,LI)、DNA含量(DNA Contents)、S期比例(S-phase cell ratio)以及建立在上述检测基础上的Tpot(Potential doubling time)相比，1994年R.Rodriguez报道存在着超过10%不被Idurd标记的克隆细胞，从而Tpot研究的成功率约为80～85%左右〔5〕，且流式细胞术利用单细胞悬液，从而丧失了组织形态方面的信息，从而受到部分非肿瘤细胞成份的干扰，因此，黄胡信等认为AgNORs可以代替Brdu渗入试验〔6〕。1996年F.G.Barker对成胶质细胞瘤的Brdu标记指数和放射治疗反应及生存率的关系的研究认为，两者之间并无显著相关性〔7〕。1994年M.Derenzini对11种人类器官肿瘤体外细胞群进行了检测，认为DNA含量与细胞倍增时间(Cell doubling time)无显著相关性，而AgNORs计量和细胞增殖速度严格相关〔8〕。1995年，他再次报告了对AgNORs和Portein B23的检测结果，证实AgNORs和人类肿瘤细胞倍增时间严格的负相关〔9〕。与Ki-67和PCNA相比，Ki-67检测时需用冰冻组织而影响其常规应用，且Ki-67和PCNA的检测结果是一种分级计数资料，而AgNORs与Tpot一样是计量资料，可以更准确地反映肿瘤细胞增殖的情况〔4〕。
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在鼻咽癌放疗中的3～4周开始予以加量加速治疗具有一定的必要性。从本文鼻咽癌放疗前和放疗中3～4周时的AgNORs各参数的自身前后对照统计分析结果来看，放疗中3～4周时AgNORs各参数值均大于放疗前且差别显著，而新的研究已发现AgNORs与细胞倍增时间(Celldoubling time)密切相关，这提示在鼻咽癌放疗过程中存在着肿瘤细胞的加速再增殖。这时予加量加速治疗具有一定的必要性。这与Wither等以Tpot检测说明头颈肿瘤放疗中发生加速再增殖的结果相似，也与Wither提出超过3～4周的治疗期每延长1天，应补偿≥0.6Gy的剂量的看法相一致〔10〕。
参考文献
[1]冯炎.分割治疗中剂量/时间因素的生物学基础.中华放射肿瘤学杂志，1995，4(2)：702
[2]田野，徐国镇，余子豪.头颈部鳞癌超分割放疗的理论基础和临床结果.中华放射肿瘤学杂志，1994，3(3)：204
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[3]许良中.关于AgNORs研究工作的标准化方案.肿瘤，1993，13(4)：162
[4]周丁华.肿瘤增殖动力学研究的方法学.国外医学肿瘤分册，1995，22：136
[5]Rodriguez R, Ritter WA, Fowler JF, et al. Kinetics of cell labeling and thymidine replacement after continuous infusion of halogenaeed pyrimidines in vivo. Int J Radiat Onol Bio Phys, 1994， 29(1)： 105
[6]黄胡信，王益夫，王炜.卵巢透明细胞癌中核仁组织原点计数与溴化脱氧苷参入的相关性研究.中华肿瘤杂志，14(2)：87
[7]Barker Fer, Pfrodos MD, Chang SM, et al. Brdu labeling index in glioblastoma mutiforme: relation to radiation response ageand survival. Int J Radiat Oncol Bio Rhys, 1996，34(4)：803
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[8]Derenzini M, Trtere D, Chieco P, et al. Interphase AgNORs quantity is not related to DNA content in established human cell lines. Exp Cell Res, 1994，211(2)：282
[9]Derenzini M, Sirri V, Trer D. The quantity of nucleolar protein nucleolin and protein B23 is related to cell doubling time in human cancer cells. Lab Invest, 1995，73(4)：497
[10]Withers HR, Taylor JMG, Macrejewski B. The hazard of accelerated Tumor clonogen Repopulation during Radiotherapy. Acta Oncol, 1988，27：131
(收稿：1998-03-26修回：1998-06-16), 百拇医药