术中预缺血对猪骨骼肌保护作用的实验研究
作者：赫伟 章建荣 钟安国 Pang CY
单位：赫伟、章建荣、钟安国 100041 北京，中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院；Pang CY 加拿大多伦多大学儿童医院研究所
关键词：骨骼肌；术中预缺血；缺血坏死
癌症990108
【摘要】目的：寻找一敏感的方法以发现循环中的肝癌细胞。方法：巢式RT-PCR检测外周血有核细胞成分中白蛋白(ALB)mRNA。结果：30例肝癌中17例检出ALBmRNA，阳性率56.6%，其中10例证实有转移的全部阳性。5例急性肝炎中的1例和9例慢性活动性肝炎中的1例可检出ALBmRNA。肝硬化、肝转移癌患者、良性肝肿瘤和健康对照组均为阴性。外周血细胞ALBmRNA的存在与肝癌的远处器官转移密切相关。结论：检测肝癌患者外周血ALBmRNA，可早期发现肝癌细胞的血行播散，对肝癌的诊断和治疗有辅助作用。
, http://www.100md.com
中图号：R735.7；R730.41
The clinical significance of detection of albumin mRNA in peripheral
venous blood from patients with hepatocellular carcinoma
Yuan Yuhong Hu Pinjin
Department of Gastroenterology, The First Affilated Hospital，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Purpose: We attempted to detect circulating hepatocellular caicinoma(HCC)cells by demonstrating albumin messenger RNA (mRNA) of a specifically hepatocyte- expressed gene in the nuclear cell component of peripheral blood. Method: Reverse transcription coupled with two- step polymerase chain reaction(Nested PT- PCR) was used to detect ALBmRNA expression in the peripheral blood obtained from patients with HCC and control groups. β 2MmRNA was selected as an internal control. Results: By this highly sensitive method, detection of ALBmRNA expression was positive in 17 of 30 HCC patients (56.7% . 10 patients with clinically distant metastasis were all posititve (100% ). In control, 1 fo 4 acute hepatitis and 1 of 9 chronic hepatitis patients showed detectable ALB mRNA, but disappeared following the disease improved. ALBmRNA was not detected in samples from 13 cirrhosis, 8 benign liver tumour, 6 other tumours metastatic to liver and 13 normal healthy volunteers. The presence of ALBmRNA in blood seemed to be correlated with the the presence of distant metastasis of HCC. Conclusion: Nested RT- PCR is a very sensitive method for detecting the ALBmRNA in peripheral blood. Its presence may be an indicator of circulating HCC cells, which might predict hematogenous spreading metastasis of tumour cells in HCC patients. Important information for guiding management of HCC can be acquired with this technique.
, 百拇医药
Key Words: Hepatocellular carcinoma; Nested RT- PCR; Albumin mRNA; Metastasis
原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，切除和移植后复发率高，主要原因是肝癌细胞容易侵犯血管，血行播散早。转移的肿瘤细胞有时长期处于休眠状态，生长缓慢而未被发现[1]。因此早期发现HCC患者周围血是否有肝癌细胞，不但对判断肿瘤的转移、复发有重要价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要意义。但由于循环中癌细胞数目少，鉴别良恶性细胞有困难，使细胞学和免疫组织化学在检测转移癌细胞的应用受到限制[1]。近年随着分子生物学的发展，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)已用于扩增组织特异性mRNA，以检测实体肿瘤血循环中肿瘤细胞和微小转移[2，3]，认为该法敏感性高，特异性强。本文采用巢式RT-PCR检测肝细胞特异的白蛋白(ALB)mRNA在外周血有核细胞成分中的表达，探讨其在诊断肝癌细胞血源性播散的意义。
, http://www.100md.com
1 材料及方法
1.1检测对象
原发性肝癌30例，男25例，女5例，中位年龄51.5岁，诊断符合1990年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》原发性肝癌诊断标准。肝硬化患者13例；急性肝炎5例，其中1例为药物性肝炎，急性甲肝2例，急性乙肝和戊肝各1例；慢性病毒性肝炎9例，其中戊肝1例，余为慢乙肝；脂肪肝、肝囊肿和肝内血管瘤、布查氏综合征各2例；肝内胆管癌(病理证实)2例；肝转移癌6例，其他肿瘤2例(膀胱癌肾转移和胃癌盆腔转移各1例)。以上均为1996年～1997年6月我院住院病人。正常对照13例均为我院医务人员，男8例，女5例，中位年龄41岁。
1.2细胞的RNA抽提
取受检查者的新鲜肝素抗凝血5ml，采用分层密度梯度离心法获取外周血多核细胞(PMNs)，用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA[4]。取4例手术切除HCC组织、癌旁组织、远处正常肝组织，2例正常胃粘膜组织，人HepG2肝癌细胞株和人MCF-7乳腺癌细胞株抽提总RNA。
, 百拇医药
1.3逆转录反应合成cDNA
取1μg细胞总RNA，65℃10分钟后移至冰浴，加入随机引物1μl，各种10mmol/LdNTP2μl，AMV逆转录酶1μl(Promega)，RNasin10U，10×RT缓冲液2μl，25mmol/LMgCl24μl，反应体积20μl。42℃1小时后95℃5分钟，一20℃保存。
1.4巢式PCR
β微球蛋白(β2M)mRNA在大多数人细胞中均有稳定的高表达，且其表达产物为细胞膜上蛋白。本实验以检测β2MmRNA为系统内参照。所用引物参照文献[5，6]由中科院上海生物工程研究中心合成，引物序列如下：β2M：正义链ACCCCCACTGAAAAAGATGA，反义链ATCTTCAAACCTCCATGATG；ALB外引物：5’-AGAAAGTACCCCAAGTGTCAA-3’(no.9)和5’-AGCTGCGAAATCATCCATAAC-3’(no.10);ALB内引物：5’-ACTATCTATCCGTGGTCCTGA-3’(no.N1)和5’TCTTGATTTGTCTCTCCTTCT-3’(no.N2)。
, http://www.100md.com
1.4.1第一轮PCR取上述反应产物5μl，分别扩增ALB和βMG。每50μl反应体积含：12.5pmolALB含3'端及5'端外引物(no.9,no.10)或12.5pmolβMG3’端及5’引物；10×PCR缓冲液5μl；10mmol/LdNTP1μl；25mmol/LMgCl22μl；TaqDNA聚合酶2U。93℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸45秒，循环35次后72℃延伸7分钟。
1.4.2第二轮PCR取上述ALB反应产物5μl作模板，加入12.5pmol含3’端及5’端内引物(no.N1,no.N2)，余反应体系和反应条件同前，作第二次ALB的PCR扩增。阳性对照用HepG2肝癌细胞株和手术肝癌组织总RNA，阴性对照用未做RT的总RNA做模板，空白对照以水代替。
1.5结果分析
取第二轮ALBPCR扩增产物和βMG扩增产物在1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。ALBmRNA阳性者可见222bp，内对照β2M为120bp。PCR的阳性结果是以肉眼能见其电泳扩增带为判断标准。统计分析：采用χ2检验，用SPSS for Windows6.0软件包在计算机上统计，分析组间差异。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1ALBmRNA的检测结果
由表1可见，30例原发性肝癌中，17例ALB mRNA阳性，阳性率56.7%。5例急性肝炎中1例急性甲型病毒性肝炎阳性(20.0%)，慢性病毒性肝炎9例中1例慢乙肝阳性(11.1%)。余良性肝肿瘤、肝内胆管癌、转移性肝癌、肝硬化和健康对照者均为阴性。HCC病人ALBmRNA检出率较肝硬化、慢性肝炎或健康对照组明显增加(P均<0.05)。手术切除的4例原发性肝细胞癌组织、癌旁组织和远处正常肝组织ALB mRNA均为阳性。HepG2人肝癌细胞株总RNA有ALB mRNA表达。2例正常胃粘膜组织和MCF-7人乳腺癌细胞株表达阴性。所有外周血和组织RNA同时都有β2MmRNA阳性表达。见图1。
表1 各组外周血ALBmRNA检测结果 分组
, 百拇医药 例数
mRNA阳性数
0mRNA阳性率(%)
P值
原发性肝癌
30
17
56.6
>0.05
急性肝炎
5
1
20.0
, 百拇医药
<0.05
慢性病毒性肝炎
9
1
11.1
<0.01
肝硬化
13
0
0
<0.01
肝转移癌
6
, 百拇医药
0
0
<0.01
良性肝肿瘤
4
0
0
<0.01
布查氏综合征
2
0
0
<0.01
, 百拇医药 肝内胆管癌
2
0
0
<0.01
健康志愿者
13
0
0
<0.01
*均与HCC组比较
图1 原发性肝癌患者外周血ALB mRNA的表达
, 百拇医药
1Marker；2,4ALB mRNA的PCR产物，222bpMarker;3,5,6,9β2MmRNA的PCR产物，120bp。
2，3是一肝癌患者外周血ALB mRNA阳性样本；4，5是肝癌组织的ALBmRNA表达；6，7与8，9为阴性样本；10为阴性对照。
2.2外周血ALBmRNA与临床参数的关系
将30例HCC病人按肿瘤大小、肿瘤灶数目、有无肝外转移、门静脉癌栓进行分组。其中临床确诊的肝外器官转移8例，6例为肺转移，1例广泛腹膜转移，1例骨转移。门静脉癌栓通过CT确定。各组AFP浓度和ALB mRNA阳性率见表2。由表2可见，各组血清AFP浓度均无显著性差异(P>0.05)，有肝外转移组外周血ALB mRNA的阳性率显著高于无肝外转移组(P<0.05)。ALB mRNA阳性率与HCCTNM分期成正相关(P<0.01,r="0.75)，"晚期HCC(TNMⅢ期和Ⅳ期)总阳性率为66.7%(16/24)。ALB mRNA阳性率与年龄，肿瘤大小、数目，有无门静脉栓塞无关(P<0.05)
, 百拇医药
表2 外周血ALBmRNA与临床参数的关系 临床参数
例数
血清AFP>20μg/L9(75.0)
ALBmRNA阳性率(%)
肿瘤大小
<5cm
12
9(75.0)
5(41.7)
≥5cm
18
9(50.0)
, http://www.100md.com
12(66.7)
肿瘤数目
孤立
13
8(61.5)
5(38.5)
多发
17
10(58.8)
12(70.6)
门静脉栓塞
有
7
, 百拇医药
5(71.4)
6(85.7)
无
23
13(56.5)
11(47.8)
远处器官转移
有
8
4(50.0)
8(100)
无
22
, http://www.100md.com
14(63.6)
9(40.9)*
*P<0.05
2.3ALBmRNA与血清AFP阳性率的关系
ALB mRNA阳性的17例中血清AFP≤20μg/L者7例，AFP≥200μg/L者4例，ALB mRNA阴性的13例中血清AFP≤20μg/L者5例，AFP≥20μg/L者4例，阳性组与阴性组间血清AFP浓度无显著性差异(P>0.05)。
2.4敏感性试验
用红细胞计数仪计数，将不同数量的HePG2细胞加入到1×106个MCF-7细胞中，从这些细胞中提取总RNA并行RT-PCR，可检测到ALB mRNA的最低限是1×106个MCF-7细胞中混有的10个HepG2细胞。见图2
, http://www.100md.com
图2 敏感性试验
1为肝癌组织的ALB mRNAPCR产物；2～7分别为1×105，1×104，1×103，1×102，10，0个HepG2细胞抽提的ALB mRNA的PCR产物。
3 讨论
聚合酶链反应(PCR)能快速扩增肿瘤细胞内特异基因或DNA片段，这种技术可查出一百万正常细胞中的一个正常细胞和组织学正常的骨髓的微小残余病变[7]。但这些基因异常在多数常见实体瘤中还没发现。由于恶性肿瘤细胞继续表达具有其起源组织特征的特异性标志物，检测组织特异性mRNA优于检测以蛋白为基础的试验，近年国外已有研究用逆转录PCR(RT-PCR)扩增外周血肿瘤特异性mRNA以检测实体肿瘤细胞和微小转移，如乳腺癌、结肠癌和骨肉瘤等[8～10]。由于肝细胞和肝癌细胞会产生白蛋白，因此在外周血有核细胞成分中查到ALBmRNA则表明血循环中有恶性或良性肝细胞。
, http://www.100md.com
Hillaire用RT-PCR和Southen点杂交作外周血ALB mRNA测定[11]，首次提出HCC血循环中检出ALB mRNA很可能循环中存在恶性肝细胞，阴性患者可能肝移植后复发危险低。但该法操作耗时，有暴露于放射性同位素的危险。其后Chou[12]应用更敏感的巢式RT-PCR，发现正常人中(6/7)也有ALB mRNA的表达，认为可能正常人外周血白细胞中有其他基因的“不合理转录”。但该理论受到质疑[13]，因Kar等用选自人白蛋白基因第3第4外显子引物作RT-PCR，共36例健康者和非HCC的患者外周血均无ALBmRNA表达，晚期(TNMⅢ～Ⅳ期)患者有阳性(16/17)发现，9例肝移植后mRNA全消失，其中3例复发后ALB mRNA在血中重现。国内未见有关报道。
本文采用敏感的巢式RT-PCR，30例HCC病人17例外周血中可检出ALB mRNA，阳性率为56.6%，与肝移植后HCC复发率为50%～70%相类似[11]。同时测定肝癌组织和人肝癌细胞株表达阳性，而健康志愿者、良性肝肿瘤、肝硬化和转移性肝癌均未检出。提示部分原发性肝癌外周血检出的ALBmRNA是由脱落到循环中的肝细胞产生。本文急慢性肝炎中也可测到ALB mRNA(2/13)，可能由于肝细胞坏死增生后进入血循环引起。但这些循环中的细胞寿命有限，我们曾作重复试验，这2例患者于肝功能恢复后mRNA信号消失。我国HCC多有慢性肝炎和肝硬化的基础，不能完全排除有非癌性肝细胞进入血循环，但其阳性率较HCC明显低。且ALBmRNA阳性率与肿瘤临床分期和远处转移密切相关。因此检测HCC患者外周血中ALB mRNA是判断外周血是否存在肿瘤细胞的重要标志。
, 百拇医药
Hillaire认为，HCC者mRNA的存在与否，与肿瘤大小、血清AFP浓度和转氨酶活性无显著性差异[11]。本文也有类似结果。但有人用肝细胞另一特异性基因AFPmRNA作分析，认为肿瘤大小、体积、门静脉血栓和血清AFP浓度与肿瘤转移有关[6，14]。我们认为，尽管肿瘤>5cm、多发性肿瘤、有门静脉栓塞者ALBmRNA阳性率比对照高，但无统计学差异。说明即使是小肿瘤或未形成癌栓者，也有转移可能，这部分病人若外周血中检出ALB mRNA，比肿瘤大小等更能预测肿瘤转移。
AFP是HCC较特异的肿瘤标志物，已被广泛用于HCC的定性诊断。已有研究认为血清AFP浓度不能反映肝癌的转移[15]。从表1可知，血清AFP是否升高与肿瘤大小、数目、是否存在门静脉癌栓及远处器官转移均无密切关系，与HCC外周血ALB mRNA阳性率亦无显著相关性。因此检测血清AFP水平不能预测HCC有无血源性播散。另一肝细胞特异的外周血AFP mRNA与肝癌细胞血行播散的关系我们正在研究。
, 百拇医药
以上研究提示应用巢式RT-PCR在HCC病人外周血检出ALB mRNA很可能与循环中存在肝癌细胞有关，它不仅是反映肝癌细胞血源性播散的灵敏指标，而且对指导选择治疗方案和预后判断有重要意义。
参考文献
[1]Ghossein RA, Rosai J. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulation tumor cells. Cancer, 1996,78:10
[2]Mattano LA, Moss TJ, Emerson SG. Sensitive detection of race circulating reuroblastoma cells by the reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Cancer Res, 1992,52:4701
, 百拇医药
[3]Miyajama Y, Kato K, Mumata S, et al. Detection of neuroblastoma cells in bone marrow and peripheral blood at diagnosis by the reverse transcriptase- polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA. Cancer, 1995,75:2757
[4]Chomcznski P, Sacchi N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidium- thiocyanate- phenol- chloroform extraction.Anal Biochem, 1987, 162:156
[5]仉红刚，史国刚，王景明，等.逆转录多聚酶链反应检测白血病多药耐药性基因表达.中华内科杂志，1995，34：463
, 百拇医药
[6]Matsumura M, Niwa Y, Kato N, et al. Detection of α - fetoprotein mRNA, an indicator of hemagenous spreading hepatocellular carcinoma, in the circulation: a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1994,20:1418
[7]Negrin RS, Blume KG. The use of the polymerase chain reaction for the detection of minimal residual malignant disease. Blood, 1991,78:255
[8]Datta YH, Adams PT, Drobyski WR, et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse- transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994,12:475
, 百拇医药
[9]Burchill SA, Bradbury, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995, 71:278
[10]Pfleiderer C, Zoubek A, Gruber B, et al. Detection of melanoma cells in peripheral blood and bone marrow from Ewing tumor patients by RT- PCR. Int J Cancer, 1995,64:135
[11]Hillaire S, Barbu V, Boucher E, et al. Albumin messenger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 1994,106:239
, 百拇医药
[12]Chou HC, Sheu JC, Huang GT, et al. Albumin messenger RNA is not specific for circulating hepatoma cells. Gaatroenterology, 1994,107:6310
[13]Kar S, Carr BI. Detection of liver cells in peripheral blood of patients with advanced- stage hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995,21:403
[14]Komeda T, Fukuda Y, Sando T, et al. Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood. Cancer, 1995,75:2214
[15]房殿春，罗元辉，鲁荣，等.原发性肝癌患者外周血AFP mRNA检测的临床意义.免疫学杂志，1997，13：33
(收稿：1997-07-09修回:1997-08-13), 百拇医药
单位：赫伟、章建荣、钟安国 100041 北京，中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院；Pang CY 加拿大多伦多大学儿童医院研究所
关键词：骨骼肌；术中预缺血；缺血坏死
癌症990108
【摘要】目的：寻找一敏感的方法以发现循环中的肝癌细胞。方法：巢式RT-PCR检测外周血有核细胞成分中白蛋白(ALB)mRNA。结果：30例肝癌中17例检出ALBmRNA，阳性率56.6%，其中10例证实有转移的全部阳性。5例急性肝炎中的1例和9例慢性活动性肝炎中的1例可检出ALBmRNA。肝硬化、肝转移癌患者、良性肝肿瘤和健康对照组均为阴性。外周血细胞ALBmRNA的存在与肝癌的远处器官转移密切相关。结论：检测肝癌患者外周血ALBmRNA，可早期发现肝癌细胞的血行播散，对肝癌的诊断和治疗有辅助作用。
, http://www.100md.com
中图号：R735.7；R730.41
The clinical significance of detection of albumin mRNA in peripheral
venous blood from patients with hepatocellular carcinoma
Yuan Yuhong Hu Pinjin
Department of Gastroenterology, The First Affilated Hospital，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Purpose: We attempted to detect circulating hepatocellular caicinoma(HCC)cells by demonstrating albumin messenger RNA (mRNA) of a specifically hepatocyte- expressed gene in the nuclear cell component of peripheral blood. Method: Reverse transcription coupled with two- step polymerase chain reaction(Nested PT- PCR) was used to detect ALBmRNA expression in the peripheral blood obtained from patients with HCC and control groups. β 2MmRNA was selected as an internal control. Results: By this highly sensitive method, detection of ALBmRNA expression was positive in 17 of 30 HCC patients (56.7% . 10 patients with clinically distant metastasis were all posititve (100% ). In control, 1 fo 4 acute hepatitis and 1 of 9 chronic hepatitis patients showed detectable ALB mRNA, but disappeared following the disease improved. ALBmRNA was not detected in samples from 13 cirrhosis, 8 benign liver tumour, 6 other tumours metastatic to liver and 13 normal healthy volunteers. The presence of ALBmRNA in blood seemed to be correlated with the the presence of distant metastasis of HCC. Conclusion: Nested RT- PCR is a very sensitive method for detecting the ALBmRNA in peripheral blood. Its presence may be an indicator of circulating HCC cells, which might predict hematogenous spreading metastasis of tumour cells in HCC patients. Important information for guiding management of HCC can be acquired with this technique.
, 百拇医药
Key Words: Hepatocellular carcinoma; Nested RT- PCR; Albumin mRNA; Metastasis
原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，切除和移植后复发率高，主要原因是肝癌细胞容易侵犯血管，血行播散早。转移的肿瘤细胞有时长期处于休眠状态，生长缓慢而未被发现[1]。因此早期发现HCC患者周围血是否有肝癌细胞，不但对判断肿瘤的转移、复发有重要价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要意义。但由于循环中癌细胞数目少，鉴别良恶性细胞有困难，使细胞学和免疫组织化学在检测转移癌细胞的应用受到限制[1]。近年随着分子生物学的发展，逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)已用于扩增组织特异性mRNA，以检测实体肿瘤血循环中肿瘤细胞和微小转移[2，3]，认为该法敏感性高，特异性强。本文采用巢式RT-PCR检测肝细胞特异的白蛋白(ALB)mRNA在外周血有核细胞成分中的表达，探讨其在诊断肝癌细胞血源性播散的意义。
, http://www.100md.com
1 材料及方法
1.1检测对象
原发性肝癌30例，男25例，女5例，中位年龄51.5岁，诊断符合1990年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》原发性肝癌诊断标准。肝硬化患者13例；急性肝炎5例，其中1例为药物性肝炎，急性甲肝2例，急性乙肝和戊肝各1例；慢性病毒性肝炎9例，其中戊肝1例，余为慢乙肝；脂肪肝、肝囊肿和肝内血管瘤、布查氏综合征各2例；肝内胆管癌(病理证实)2例；肝转移癌6例，其他肿瘤2例(膀胱癌肾转移和胃癌盆腔转移各1例)。以上均为1996年～1997年6月我院住院病人。正常对照13例均为我院医务人员，男8例，女5例，中位年龄41岁。
1.2细胞的RNA抽提
取受检查者的新鲜肝素抗凝血5ml，采用分层密度梯度离心法获取外周血多核细胞(PMNs)，用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA[4]。取4例手术切除HCC组织、癌旁组织、远处正常肝组织，2例正常胃粘膜组织，人HepG2肝癌细胞株和人MCF-7乳腺癌细胞株抽提总RNA。
, 百拇医药
1.3逆转录反应合成cDNA
取1μg细胞总RNA，65℃10分钟后移至冰浴，加入随机引物1μl，各种10mmol/LdNTP2μl，AMV逆转录酶1μl(Promega)，RNasin10U，10×RT缓冲液2μl，25mmol/LMgCl24μl，反应体积20μl。42℃1小时后95℃5分钟，一20℃保存。
1.4巢式PCR
β微球蛋白(β2M)mRNA在大多数人细胞中均有稳定的高表达，且其表达产物为细胞膜上蛋白。本实验以检测β2MmRNA为系统内参照。所用引物参照文献[5，6]由中科院上海生物工程研究中心合成，引物序列如下：β2M：正义链ACCCCCACTGAAAAAGATGA，反义链ATCTTCAAACCTCCATGATG；ALB外引物：5’-AGAAAGTACCCCAAGTGTCAA-3’(no.9)和5’-AGCTGCGAAATCATCCATAAC-3’(no.10);ALB内引物：5’-ACTATCTATCCGTGGTCCTGA-3’(no.N1)和5’TCTTGATTTGTCTCTCCTTCT-3’(no.N2)。
, http://www.100md.com
1.4.1第一轮PCR取上述反应产物5μl，分别扩增ALB和βMG。每50μl反应体积含：12.5pmolALB含3'端及5'端外引物(no.9,no.10)或12.5pmolβMG3’端及5’引物；10×PCR缓冲液5μl；10mmol/LdNTP1μl；25mmol/LMgCl22μl；TaqDNA聚合酶2U。93℃变性30秒，54℃退火45秒，72℃延伸45秒，循环35次后72℃延伸7分钟。
1.4.2第二轮PCR取上述ALB反应产物5μl作模板，加入12.5pmol含3’端及5’端内引物(no.N1,no.N2)，余反应体系和反应条件同前，作第二次ALB的PCR扩增。阳性对照用HepG2肝癌细胞株和手术肝癌组织总RNA，阴性对照用未做RT的总RNA做模板，空白对照以水代替。
1.5结果分析
取第二轮ALBPCR扩增产物和βMG扩增产物在1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。ALBmRNA阳性者可见222bp，内对照β2M为120bp。PCR的阳性结果是以肉眼能见其电泳扩增带为判断标准。统计分析：采用χ2检验，用SPSS for Windows6.0软件包在计算机上统计，分析组间差异。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1ALBmRNA的检测结果
由表1可见，30例原发性肝癌中，17例ALB mRNA阳性，阳性率56.7%。5例急性肝炎中1例急性甲型病毒性肝炎阳性(20.0%)，慢性病毒性肝炎9例中1例慢乙肝阳性(11.1%)。余良性肝肿瘤、肝内胆管癌、转移性肝癌、肝硬化和健康对照者均为阴性。HCC病人ALBmRNA检出率较肝硬化、慢性肝炎或健康对照组明显增加(P均<0.05)。手术切除的4例原发性肝细胞癌组织、癌旁组织和远处正常肝组织ALB mRNA均为阳性。HepG2人肝癌细胞株总RNA有ALB mRNA表达。2例正常胃粘膜组织和MCF-7人乳腺癌细胞株表达阴性。所有外周血和组织RNA同时都有β2MmRNA阳性表达。见图1。
表1 各组外周血ALBmRNA检测结果 分组
, 百拇医药 例数
mRNA阳性数
0mRNA阳性率(%)
P值
原发性肝癌
30
17
56.6
>0.05
急性肝炎
5
1
20.0
, 百拇医药
<0.05
慢性病毒性肝炎
9
1
11.1
<0.01
肝硬化
13
0
0
<0.01
肝转移癌
6
, 百拇医药
0
0
<0.01
良性肝肿瘤
4
0
0
<0.01
布查氏综合征
2
0
0
<0.01
, 百拇医药 肝内胆管癌
2
0
0
<0.01
健康志愿者
13
0
0
<0.01
*均与HCC组比较
图1 原发性肝癌患者外周血ALB mRNA的表达
, 百拇医药
1Marker；2,4ALB mRNA的PCR产物，222bpMarker;3,5,6,9β2MmRNA的PCR产物，120bp。
2，3是一肝癌患者外周血ALB mRNA阳性样本；4，5是肝癌组织的ALBmRNA表达；6，7与8，9为阴性样本；10为阴性对照。
2.2外周血ALBmRNA与临床参数的关系
将30例HCC病人按肿瘤大小、肿瘤灶数目、有无肝外转移、门静脉癌栓进行分组。其中临床确诊的肝外器官转移8例，6例为肺转移，1例广泛腹膜转移，1例骨转移。门静脉癌栓通过CT确定。各组AFP浓度和ALB mRNA阳性率见表2。由表2可见，各组血清AFP浓度均无显著性差异(P>0.05)，有肝外转移组外周血ALB mRNA的阳性率显著高于无肝外转移组(P<0.05)。ALB mRNA阳性率与HCCTNM分期成正相关(P<0.01,r="0.75)，"晚期HCC(TNMⅢ期和Ⅳ期)总阳性率为66.7%(16/24)。ALB mRNA阳性率与年龄，肿瘤大小、数目，有无门静脉栓塞无关(P<0.05)
, 百拇医药
表2 外周血ALBmRNA与临床参数的关系 临床参数
例数
血清AFP>20μg/L9(75.0)
ALBmRNA阳性率(%)
肿瘤大小
<5cm
12
9(75.0)
5(41.7)
≥5cm
18
9(50.0)
, http://www.100md.com
12(66.7)
肿瘤数目
孤立
13
8(61.5)
5(38.5)
多发
17
10(58.8)
12(70.6)
门静脉栓塞
有
7
, 百拇医药
5(71.4)
6(85.7)
无
23
13(56.5)
11(47.8)
远处器官转移
有
8
4(50.0)
8(100)
无
22
, http://www.100md.com
14(63.6)
9(40.9)*
*P<0.05
2.3ALBmRNA与血清AFP阳性率的关系
ALB mRNA阳性的17例中血清AFP≤20μg/L者7例，AFP≥200μg/L者4例，ALB mRNA阴性的13例中血清AFP≤20μg/L者5例，AFP≥20μg/L者4例，阳性组与阴性组间血清AFP浓度无显著性差异(P>0.05)。
2.4敏感性试验
用红细胞计数仪计数，将不同数量的HePG2细胞加入到1×106个MCF-7细胞中，从这些细胞中提取总RNA并行RT-PCR，可检测到ALB mRNA的最低限是1×106个MCF-7细胞中混有的10个HepG2细胞。见图2
, http://www.100md.com
图2 敏感性试验
1为肝癌组织的ALB mRNAPCR产物；2～7分别为1×105，1×104，1×103，1×102，10，0个HepG2细胞抽提的ALB mRNA的PCR产物。
3 讨论
聚合酶链反应(PCR)能快速扩增肿瘤细胞内特异基因或DNA片段，这种技术可查出一百万正常细胞中的一个正常细胞和组织学正常的骨髓的微小残余病变[7]。但这些基因异常在多数常见实体瘤中还没发现。由于恶性肿瘤细胞继续表达具有其起源组织特征的特异性标志物，检测组织特异性mRNA优于检测以蛋白为基础的试验，近年国外已有研究用逆转录PCR(RT-PCR)扩增外周血肿瘤特异性mRNA以检测实体肿瘤细胞和微小转移，如乳腺癌、结肠癌和骨肉瘤等[8～10]。由于肝细胞和肝癌细胞会产生白蛋白，因此在外周血有核细胞成分中查到ALBmRNA则表明血循环中有恶性或良性肝细胞。
, http://www.100md.com
Hillaire用RT-PCR和Southen点杂交作外周血ALB mRNA测定[11]，首次提出HCC血循环中检出ALB mRNA很可能循环中存在恶性肝细胞，阴性患者可能肝移植后复发危险低。但该法操作耗时，有暴露于放射性同位素的危险。其后Chou[12]应用更敏感的巢式RT-PCR，发现正常人中(6/7)也有ALB mRNA的表达，认为可能正常人外周血白细胞中有其他基因的“不合理转录”。但该理论受到质疑[13]，因Kar等用选自人白蛋白基因第3第4外显子引物作RT-PCR，共36例健康者和非HCC的患者外周血均无ALBmRNA表达，晚期(TNMⅢ～Ⅳ期)患者有阳性(16/17)发现，9例肝移植后mRNA全消失，其中3例复发后ALB mRNA在血中重现。国内未见有关报道。
本文采用敏感的巢式RT-PCR，30例HCC病人17例外周血中可检出ALB mRNA，阳性率为56.6%，与肝移植后HCC复发率为50%～70%相类似[11]。同时测定肝癌组织和人肝癌细胞株表达阳性，而健康志愿者、良性肝肿瘤、肝硬化和转移性肝癌均未检出。提示部分原发性肝癌外周血检出的ALBmRNA是由脱落到循环中的肝细胞产生。本文急慢性肝炎中也可测到ALB mRNA(2/13)，可能由于肝细胞坏死增生后进入血循环引起。但这些循环中的细胞寿命有限，我们曾作重复试验，这2例患者于肝功能恢复后mRNA信号消失。我国HCC多有慢性肝炎和肝硬化的基础，不能完全排除有非癌性肝细胞进入血循环，但其阳性率较HCC明显低。且ALBmRNA阳性率与肿瘤临床分期和远处转移密切相关。因此检测HCC患者外周血中ALB mRNA是判断外周血是否存在肿瘤细胞的重要标志。
, 百拇医药
Hillaire认为，HCC者mRNA的存在与否，与肿瘤大小、血清AFP浓度和转氨酶活性无显著性差异[11]。本文也有类似结果。但有人用肝细胞另一特异性基因AFPmRNA作分析，认为肿瘤大小、体积、门静脉血栓和血清AFP浓度与肿瘤转移有关[6，14]。我们认为，尽管肿瘤>5cm、多发性肿瘤、有门静脉栓塞者ALBmRNA阳性率比对照高，但无统计学差异。说明即使是小肿瘤或未形成癌栓者，也有转移可能，这部分病人若外周血中检出ALB mRNA，比肿瘤大小等更能预测肿瘤转移。
AFP是HCC较特异的肿瘤标志物，已被广泛用于HCC的定性诊断。已有研究认为血清AFP浓度不能反映肝癌的转移[15]。从表1可知，血清AFP是否升高与肿瘤大小、数目、是否存在门静脉癌栓及远处器官转移均无密切关系，与HCC外周血ALB mRNA阳性率亦无显著相关性。因此检测血清AFP水平不能预测HCC有无血源性播散。另一肝细胞特异的外周血AFP mRNA与肝癌细胞血行播散的关系我们正在研究。
, 百拇医药
以上研究提示应用巢式RT-PCR在HCC病人外周血检出ALB mRNA很可能与循环中存在肝癌细胞有关，它不仅是反映肝癌细胞血源性播散的灵敏指标，而且对指导选择治疗方案和预后判断有重要意义。
参考文献
[1]Ghossein RA, Rosai J. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulation tumor cells. Cancer, 1996,78:10
[2]Mattano LA, Moss TJ, Emerson SG. Sensitive detection of race circulating reuroblastoma cells by the reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Cancer Res, 1992,52:4701
, 百拇医药
[3]Miyajama Y, Kato K, Mumata S, et al. Detection of neuroblastoma cells in bone marrow and peripheral blood at diagnosis by the reverse transcriptase- polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA. Cancer, 1995,75:2757
[4]Chomcznski P, Sacchi N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidium- thiocyanate- phenol- chloroform extraction.Anal Biochem, 1987, 162:156
[5]仉红刚，史国刚，王景明，等.逆转录多聚酶链反应检测白血病多药耐药性基因表达.中华内科杂志，1995，34：463
, 百拇医药
[6]Matsumura M, Niwa Y, Kato N, et al. Detection of α - fetoprotein mRNA, an indicator of hemagenous spreading hepatocellular carcinoma, in the circulation: a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1994,20:1418
[7]Negrin RS, Blume KG. The use of the polymerase chain reaction for the detection of minimal residual malignant disease. Blood, 1991,78:255
[8]Datta YH, Adams PT, Drobyski WR, et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse- transcriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994,12:475
, 百拇医药
[9]Burchill SA, Bradbury, Pittman K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Br J Cancer, 1995, 71:278
[10]Pfleiderer C, Zoubek A, Gruber B, et al. Detection of melanoma cells in peripheral blood and bone marrow from Ewing tumor patients by RT- PCR. Int J Cancer, 1995,64:135
[11]Hillaire S, Barbu V, Boucher E, et al. Albumin messenger RNA as a marker of circulating hepatocytes in hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 1994,106:239
, 百拇医药
[12]Chou HC, Sheu JC, Huang GT, et al. Albumin messenger RNA is not specific for circulating hepatoma cells. Gaatroenterology, 1994,107:6310
[13]Kar S, Carr BI. Detection of liver cells in peripheral blood of patients with advanced- stage hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995,21:403
[14]Komeda T, Fukuda Y, Sando T, et al. Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood. Cancer, 1995,75:2214
[15]房殿春，罗元辉，鲁荣，等.原发性肝癌患者外周血AFP mRNA检测的临床意义.免疫学杂志，1997，13：33
(收稿：1997-07-09修回:1997-08-13), 百拇医药