核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用*
作者：李谨革 周永兴 连建奇 贾战生 冯志华
单位：第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038
关键词：核酶；肝肿瘤；乙型肝炎病毒；肝炎表面抗原，乙型
中国图书资料分类号 R735中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 观察针对HBV C区双位点核酶对HBeAg在细胞内表达的抑制作用.
方法 利用亚克隆技术，从质粒pGEM-Rz123切下EcoRⅠ-BamHⅠ片段，双粘端克隆于真核表达质粒pBBS212中，将该质粒与p1.2Ⅱ(含HBV全序列)，共转染人HCC细胞(人肝癌细胞株)，观察该核酶在细胞内对HBeAg合成的抑制作用.
, http://www.100md.com
结果 在人HCC细胞中p1.2Ⅱ可表达出HBeAg；该核酶对HBeAg的合成抑制率达65%.
结论 该双位点核酶可能通过针对HBV C区基因的剪切作用，阻断C区基因的表达，抑制了HBeAg的合成.
Inhibitory effect of ribozyme on
HBeAg in human HCC cells*
LI Jin-Ge, ZHOU Yong-Xing, LIAN Jian-Qi, JIA Zhan-Sheng and FENG Zhi-Hua
Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Subject headings ribozyme; liver neoplasms; hepatitis B virus; hepatitis B surface antigens
Abstract
AIM To observe the inhibition of HBeAg expression in the human hepatic carcinoma cell (HCC) transfected by HBV genome with two-unit ribozyme against HBV.
METHODS By using subclone technique, the two-unit ribozyme gene cut from pGEM-Rz 123 was ligated into the eukaryotic expression vector pBBS212. The recombinant plasmid pBBS212-Rz and p1.2Ⅱ plasmid carrying genome of adr-subtype HBV were cotransfected into the human HCC cell using lipofectamine. The endocellular e antigen of HBV was detected by ELISA.
, http://www.100md.com
RESULTS The cotransfection cell did express HBV e antigen, and two-unit ribozyme lowered the level of HBeAg expressed in coinfected cells by up to 65%.
CONCLUSION The two-unit ribozyme can inhibit HBV expression in cotransfected cell.
0 引言
核酶(ribozyme, Rz)是一种具有独特作用的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能[1]. 人们利用这一特点，通过合理的设计及操作，可以特异地剪切靶RNA，成为基因治疗的重要手段. 传统的药物抗乙型肝炎病毒(HBV)疗效欠佳，而基因治疗提供了一条新的途径. 本实验构建抗HBV的双位点核酶真核表达载体，观察细胞内核酶对HBV表达HBeAg的抑制作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 脂质体(lipofectamine)、DMEM为Gibco公司产品，潮霉素B(hygromycin B)为Sigma公司产品，T4 DNA连接酶为Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司. HBsAg，HBeAg酶联检测盒为科华公司产品，进口胎牛血清购自Gibco公司. 人HCC细胞由本室保存，Ecoli JM 109为本室保存，pBBS212由全军消化研究所郭建成博士惠赠，pGEMRz 123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建. 核苷酸序列见图1[2].
图1 Rz及靶mRNA的核苷酸序列
, 百拇医药
1.pBBS212-Rz/kpnⅠ+HindⅢ
1.2 方法
1.2.1 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz 123及pBBS 212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10535bp片段，用双粘法进行连接[3]，构建流程图见图2. 连接产物转化JM 109菌. 挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ，KpnⅠ及HindⅢ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳.
图2 pBBS212-Rz真核表达载体构建流程图
2.Marker: pGEM-7Zf(+)/HeaⅢ Marks:(657,458,434,328,389,367,174,142,102,80)
, 百拇医药
1.2.2 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz的转染 人HCC细胞在6孔培养板中，用含100mL/L胎牛血清的1×DMEM，在37℃ 50mL/L CO2条件下培养至细胞密度为60%～80%. 采用脂质体介导基因转染的方法(按产品说明书操作). 准备溶液A：于100μL无血清DMEM液中6μg pBBS212-Rz或pBBS212. 准备溶液B：于85μL无血清DMEM液中加15μL脂质体，轻轻混匀A，B液，室温放置35min，补足1mL无血清DMEM，加入用DMEM洗过两次的细胞单层上，37℃，50mL/L CO2培养18h. 换用含100mL/L胎牛血清的培养基，37℃，50mL/L CO2培养48h，按1∶4传代，加含200mg/L潮霉素B的培养基进行筛选，直到筛选出阳性克隆. 混合所有阳性克隆，再扩增培养.
1.2.3 胞质裂解液的制备 细胞用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加1mL含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加1mL～10mL PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl (pH 7.5).1010个/L上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg.
, 百拇医药
1.2.4 HBeAg测定 用科华ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清，A(OD值)在A450下读取，结果均以阳性孔A/阴性孔A(P/N)表示，抑制率按下式计算：
1.2.5 免疫荧光检测 细胞爬片固定后，测加1∶10稀释人的HBe/HBcAg抗体，37℃，30min，洗涤5次，加羊抗人IgG荧光抗体，37℃， 30min，洗片，吹干，加甘油，在荧光显微镜下观察拍片.
2 结果
2.1 含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建 经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ,BamHⅠ及KpnⅠ,HindⅢ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带(图3).
, 百拇医药
图3 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析
3.pBBS212-Rz/EcoRⅠ+BamHⅠ
2.2 共转染人HCC细胞的鉴定 在将p1.2Ⅱ与pBBS212-Rz及pBBS212共转染人HCC细胞后7d胞质中测到HBeAg，经潮霉素B筛选后表达量达最大，1∶4阳性，同时发现HBeAg在转染的人HCC细胞中可稳定表达2mo以上.
2.3 在共转染细胞中，核酶对HBeAg作用 将样本分4组(含空载质粒与p1.2Ⅱ共转染组)，每组取4份样本. 由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用. 最高达65%.
表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg表达的作用
样 本 编 号
, 百拇医药
P/N值
±s
抑制率(%)
pBBS212与p1.2Ⅱ共转染组
3.95±0.06
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅰ
2.84±0.11
60
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅱ
3.12±0.10
, 百拇医药
50
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅲ
2.75±0.25
65
2.4 免疫荧光的检测结果 针对HBV C区核酶与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为+，而空载体(pBBS212)与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为++，说明针对HBV C区mRNA的双位点核酶可明确抑制HBeAg的表达(图4，5).
图4 pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
, 百拇医药
图5 pBBS212与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
3 讨论
目前，核酶的研究是分子生物学领域的热点之一. 核酶的发现不仅对生物的起源与进化具有极大的意义，同时为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段[4]. 本实验室已构建抗HBV C区双位点核酶，体外对HBV C区转录物进行切割，效率达80%. 本实验正是利用该核酶构建一个真核表达载体pBBS212-Rz，由于pBBS212质粒含两个高效增强子及CMV启动子，不但可以高效表达该核酶，而且具有稳定表达的特点[5]. 采用共转染的方法，将该核酶与乙肝病毒全序列转入人HCC细胞，结果发现其对HBeAg的抑制率可达65%，免疫荧光也证实该结果. 说明核酶作为一种抗HBV的新方法是有效的.
对于抗HBV核酶的细胞内研究，1992年Weizsacker et al[8]使用联结型(connected type)三位点核酶，体外切割效果显著，文中提及正在进行体内研究. 1997年Welch et al[9]则使用三个发夹状核酶，导入Huh 7细胞，与HBV共表达. 结果使病毒颗粒下降66%～83%. 这一结果与本结果类似，国内也有类似报道[6，7]. 由于针对HBV C区mRNA的剪切作用，可使HBV复制过程中逆转录步骤中-3.5kbm RNA发生缺陷，直接可影响HBV的复制. 本实验结果提示该双位点核酶用于抑制HBV的复制、表达有效，可为进一步的抗HBV基因治疗提供基础.
, 百拇医药
作者简介：李谨革，男，1967-12-04生，内蒙古呼和浩特市人，汉族. 1992年第四军医大学本科毕业，1998年第四军医大学传染科硕士研究生毕业，1998年第四军医大学传染科博士研究生，助教，医师，主要从事传染病专业研究工作，发表论文1篇，综述4篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570652.
通讯作者 李谨革，710038，第四军医大学唐都医院传染科，陕西省西安市新寺路.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39570652.
Correspondence to:LI Jin-Ge, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Tel. +86.29.3524578 Ext. 77595
4 参考文献
[1] Haseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988;344:585-591
[2] 连建奇，周永兴，金由辛. 抗HBV C基因核酶自剪切转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；8：376-377
[3] 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 第1版. 北京：人民军医出版社.1996：19-23
[4] 李谨革，连建奇. 抗HBV核酶的研究进展. 现代诊断与治疗，1998；9：87-88
, http://www.100md.com
[5] Lin JH, Wang M, Androws WH, Wydro R, Morser J. Expression efficiency of the human thrombomdulin encodimg gene in various vector and host systems. Gene, 1994;147:287-292
[6] 竺来发，易荣大，陆长德，汪垣，祁国荣. 乙型肝炎病毒adr，亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割. 生物化学与生物物理学报，1993；25：323-327
[7] 王平，徐炜，曾力宇，孙晓梅，童葵塘，侯云德. 核酶Ripc对HBV基因体外转录物的作用. 病毒学报，1993；9：278-280
[8] Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res Commun, 1992;189:743-748
[9] Welch PJ, Tritz R, Yei S, Barber J, Yu M. Intracellular appliction of hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997;4:736-740
收稿日期 1998-08-05, http://www.100md.com
单位：第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038
关键词：核酶；肝肿瘤；乙型肝炎病毒；肝炎表面抗原，乙型
中国图书资料分类号 R735中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 观察针对HBV C区双位点核酶对HBeAg在细胞内表达的抑制作用.
方法 利用亚克隆技术，从质粒pGEM-Rz123切下EcoRⅠ-BamHⅠ片段，双粘端克隆于真核表达质粒pBBS212中，将该质粒与p1.2Ⅱ(含HBV全序列)，共转染人HCC细胞(人肝癌细胞株)，观察该核酶在细胞内对HBeAg合成的抑制作用.
, http://www.100md.com
结果 在人HCC细胞中p1.2Ⅱ可表达出HBeAg；该核酶对HBeAg的合成抑制率达65%.
结论 该双位点核酶可能通过针对HBV C区基因的剪切作用，阻断C区基因的表达，抑制了HBeAg的合成.
Inhibitory effect of ribozyme on
HBeAg in human HCC cells*
LI Jin-Ge, ZHOU Yong-Xing, LIAN Jian-Qi, JIA Zhan-Sheng and FENG Zhi-Hua
Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Subject headings ribozyme; liver neoplasms; hepatitis B virus; hepatitis B surface antigens
Abstract
AIM To observe the inhibition of HBeAg expression in the human hepatic carcinoma cell (HCC) transfected by HBV genome with two-unit ribozyme against HBV.
METHODS By using subclone technique, the two-unit ribozyme gene cut from pGEM-Rz 123 was ligated into the eukaryotic expression vector pBBS212. The recombinant plasmid pBBS212-Rz and p1.2Ⅱ plasmid carrying genome of adr-subtype HBV were cotransfected into the human HCC cell using lipofectamine. The endocellular e antigen of HBV was detected by ELISA.
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RESULTS The cotransfection cell did express HBV e antigen, and two-unit ribozyme lowered the level of HBeAg expressed in coinfected cells by up to 65%.
CONCLUSION The two-unit ribozyme can inhibit HBV expression in cotransfected cell.
0 引言
核酶(ribozyme, Rz)是一种具有独特作用的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能[1]. 人们利用这一特点，通过合理的设计及操作，可以特异地剪切靶RNA，成为基因治疗的重要手段. 传统的药物抗乙型肝炎病毒(HBV)疗效欠佳，而基因治疗提供了一条新的途径. 本实验构建抗HBV的双位点核酶真核表达载体，观察细胞内核酶对HBV表达HBeAg的抑制作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 脂质体(lipofectamine)、DMEM为Gibco公司产品，潮霉素B(hygromycin B)为Sigma公司产品，T4 DNA连接酶为Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司. HBsAg，HBeAg酶联检测盒为科华公司产品，进口胎牛血清购自Gibco公司. 人HCC细胞由本室保存，Ecoli JM 109为本室保存，pBBS212由全军消化研究所郭建成博士惠赠，pGEMRz 123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建. 核苷酸序列见图1[2].
图1 Rz及靶mRNA的核苷酸序列
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1.pBBS212-Rz/kpnⅠ+HindⅢ
1.2 方法
1.2.1 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz 123及pBBS 212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10535bp片段，用双粘法进行连接[3]，构建流程图见图2. 连接产物转化JM 109菌. 挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ，KpnⅠ及HindⅢ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳.
图2 pBBS212-Rz真核表达载体构建流程图
2.Marker: pGEM-7Zf(+)/HeaⅢ Marks:(657,458,434,328,389,367,174,142,102,80)
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1.2.2 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz的转染 人HCC细胞在6孔培养板中，用含100mL/L胎牛血清的1×DMEM，在37℃ 50mL/L CO2条件下培养至细胞密度为60%～80%. 采用脂质体介导基因转染的方法(按产品说明书操作). 准备溶液A：于100μL无血清DMEM液中6μg pBBS212-Rz或pBBS212. 准备溶液B：于85μL无血清DMEM液中加15μL脂质体，轻轻混匀A，B液，室温放置35min，补足1mL无血清DMEM，加入用DMEM洗过两次的细胞单层上，37℃，50mL/L CO2培养18h. 换用含100mL/L胎牛血清的培养基，37℃，50mL/L CO2培养48h，按1∶4传代，加含200mg/L潮霉素B的培养基进行筛选，直到筛选出阳性克隆. 混合所有阳性克隆，再扩增培养.
1.2.3 胞质裂解液的制备 细胞用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加1mL含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加1mL～10mL PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl (pH 7.5).1010个/L上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg.
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1.2.4 HBeAg测定 用科华ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清，A(OD值)在A450下读取，结果均以阳性孔A/阴性孔A(P/N)表示，抑制率按下式计算：
1.2.5 免疫荧光检测 细胞爬片固定后，测加1∶10稀释人的HBe/HBcAg抗体，37℃，30min，洗涤5次，加羊抗人IgG荧光抗体，37℃， 30min，洗片，吹干，加甘油，在荧光显微镜下观察拍片.
2 结果
2.1 含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建 经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ,BamHⅠ及KpnⅠ,HindⅢ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带(图3).
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图3 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析
3.pBBS212-Rz/EcoRⅠ+BamHⅠ
2.2 共转染人HCC细胞的鉴定 在将p1.2Ⅱ与pBBS212-Rz及pBBS212共转染人HCC细胞后7d胞质中测到HBeAg，经潮霉素B筛选后表达量达最大，1∶4阳性，同时发现HBeAg在转染的人HCC细胞中可稳定表达2mo以上.
2.3 在共转染细胞中，核酶对HBeAg作用 将样本分4组(含空载质粒与p1.2Ⅱ共转染组)，每组取4份样本. 由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用. 最高达65%.
表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg表达的作用
样 本 编 号
, 百拇医药
P/N值
±s抑制率(%)
pBBS212与p1.2Ⅱ共转染组
3.95±0.06
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅰ
2.84±0.11
60
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅱ
3.12±0.10
, 百拇医药
50
pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅲ
2.75±0.25
65
2.4 免疫荧光的检测结果 针对HBV C区核酶与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为+，而空载体(pBBS212)与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为++，说明针对HBV C区mRNA的双位点核酶可明确抑制HBeAg的表达(图4，5).
图4 pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
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图5 pBBS212与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
3 讨论
目前，核酶的研究是分子生物学领域的热点之一. 核酶的发现不仅对生物的起源与进化具有极大的意义，同时为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段[4]. 本实验室已构建抗HBV C区双位点核酶，体外对HBV C区转录物进行切割，效率达80%. 本实验正是利用该核酶构建一个真核表达载体pBBS212-Rz，由于pBBS212质粒含两个高效增强子及CMV启动子，不但可以高效表达该核酶，而且具有稳定表达的特点[5]. 采用共转染的方法，将该核酶与乙肝病毒全序列转入人HCC细胞，结果发现其对HBeAg的抑制率可达65%，免疫荧光也证实该结果. 说明核酶作为一种抗HBV的新方法是有效的.
对于抗HBV核酶的细胞内研究，1992年Weizsacker et al[8]使用联结型(connected type)三位点核酶，体外切割效果显著，文中提及正在进行体内研究. 1997年Welch et al[9]则使用三个发夹状核酶，导入Huh 7细胞，与HBV共表达. 结果使病毒颗粒下降66%～83%. 这一结果与本结果类似，国内也有类似报道[6，7]. 由于针对HBV C区mRNA的剪切作用，可使HBV复制过程中逆转录步骤中-3.5kbm RNA发生缺陷，直接可影响HBV的复制. 本实验结果提示该双位点核酶用于抑制HBV的复制、表达有效，可为进一步的抗HBV基因治疗提供基础.
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作者简介：李谨革，男，1967-12-04生，内蒙古呼和浩特市人，汉族. 1992年第四军医大学本科毕业，1998年第四军医大学传染科硕士研究生毕业，1998年第四军医大学传染科博士研究生，助教，医师，主要从事传染病专业研究工作，发表论文1篇，综述4篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570652.
通讯作者 李谨革，710038，第四军医大学唐都医院传染科，陕西省西安市新寺路.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39570652.
Correspondence to:LI Jin-Ge, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
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Tel. +86.29.3524578 Ext. 77595
4 参考文献
[1] Haseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988;344:585-591
[2] 连建奇，周永兴，金由辛. 抗HBV C基因核酶自剪切转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；8：376-377
[3] 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 第1版. 北京：人民军医出版社.1996：19-23
[4] 李谨革，连建奇. 抗HBV核酶的研究进展. 现代诊断与治疗，1998；9：87-88
, http://www.100md.com
[5] Lin JH, Wang M, Androws WH, Wydro R, Morser J. Expression efficiency of the human thrombomdulin encodimg gene in various vector and host systems. Gene, 1994;147:287-292
[6] 竺来发，易荣大，陆长德，汪垣，祁国荣. 乙型肝炎病毒adr，亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割. 生物化学与生物物理学报，1993；25：323-327
[7] 王平，徐炜，曾力宇，孙晓梅，童葵塘，侯云德. 核酶Ripc对HBV基因体外转录物的作用. 病毒学报，1993；9：278-280
[8] Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res Commun, 1992;189:743-748
[9] Welch PJ, Tritz R, Yei S, Barber J, Yu M. Intracellular appliction of hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997;4:736-740
收稿日期 1998-08-05, http://www.100md.com