氧化砷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导凋亡作用*
作者：涂水平 江石湖 谭继宏 蒋晓华 乔敏敏 章永平 吴云林 吴裕忻
单位：
关键词：胃肿瘤/治疗；氧化砷；细胞凋亡
中国图书资料分类号 R735中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 研究氧化砷对胃癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.
方法 应用细胞集落形成实验、MTT，TUNEL染色、流式细胞仪技术，研究氧化砷对胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制、细胞毒和诱导凋亡的作用.
结果 氧化砷能显著抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，5μmol/L氧化砷抑制程度明显强于1μmol/L(P<0.05)，5μmol/L和1μmol/L的氧化砷作用后的细胞集落形成率分别为12.4%±3.3%和6.8%±2.6%，明显低于对照组的20.6%±5.7%(P<0.01). 氧化砷对胃癌细胞具有较强的细胞毒作用，10μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率为24.6%，48h接近50%. 氧化砷作用于细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. 流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”. TDT染色法显示，细胞凋亡指数为7.3%～15.1%. 氧化砷的细胞毒作用呈时间和剂量依赖性，且表现为细胞周期特异性，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡.
, 百拇医药
结论 氧化砷具有抑制胃癌细胞SGC-7901增殖和诱导细胞凋亡的作用，具有治疗胃癌的潜在价值.
Proliferation inhibition and apoptosis induction by arsenic trioxide on gastric cancer cell SGC-7901*
TU Shui-Ping, JIANG Shi-Hu, TAN Ji-Hong, JIANG Xiao-Hua, QIAO Min-Min, ZHANG Yong-Ping, WU Yun-Lin and WU Yu-Xin
Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
, 百拇医药
Subject headings stomach neoplasms/therapy; arsenic trioxide; apoptosis
Abstract
AIM To explore the effect of arsenic trioxide (As2O3) in inhibition of proliferation and induction of apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901.
METHODS Morphologic changes, proliferation ability, colony-forming rate of gastric cancer cell SGC-7901 treated by As2O3 were studied by light microscopy, growth curve and colony-forming assay. The cytotoxicity of As2O3 on SGC-7901 was determined by MTT assay. Apoptosis and cell cycle changes of SGC-7901 induced by As2O3 was investigated by TUNEL method and flow cytometry.
, 百拇医药
RESULTS As2O3 can inhibit significantly the growth of SGC-7901. Colony-forming rate of SGC-7901 with 5μmol/L As2O3 (6.8%±2.6%) was lower than that with 1μmol/L As2O3 (12.4%±3.3%, P<0.01), and much lower than that of control group (20.6%±5.3%, P<0.01). As2O3 had a remarkable cytotoxic effect on SGC-7901. The cytotoxic rate of 10μmol/L As2O3 on SGC-7901 was almost 50.0% in 48 hours. After 12 hours of exposure to the drug, SGC-7901 exhibited morphologic features of apoptosis, including cell shrinkage, nuclear condensation, DNA fragmentation and formation of apoptotic bodies. A typical subdiploid peak before G0/G1 phase was observed by flow cytometry. The apoptotic index was 7%-15% by TUNEL and FACS assay. The effect of As2O3 on SGC-7901 showed a remarkable cell cycle specificity, which indicates that As2O3 mainly acts in G2/M phase.
, 百拇医药
CONCLUSION As2O3 can inhibit significantly proliferation of gastric cancer cell SGC-7901 and induce apoptosis and it has a potential. value in the treatment of gastric cancer, and was worth further studies.
0 引言
胃癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率高，晚期尚缺乏有效的治疗手段，寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急. 诱导胃癌细胞凋亡是治疗的新思路. 氧化砷已成功地应用于临床治疗急性早幼粒细胞性白血病，其机制为诱导肿瘤细胞凋亡[1]. 氧化砷对实体肿瘤是否有治疗作用，尚不肯定. 我们报道三氧化二砷(氧化砷)对中分化程度的胃腺癌细胞株SGC-7901细胞的体外抑制增殖和诱导凋亡的作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 氧化砷注射液，美国Sigma公司产品. RPMI 1640培养基，Gibco公司产品. 胃癌细胞株SGC-7901(中分化腺癌)，由本实验室传代培养. 细胞凋亡原位检测试剂盒，德国Boehringer Mannheim公司产品. FACScan美国BD公司产品.
1.2 方法
1.2.1 氧化砷对胃癌细胞生长曲线的影响 取对数生长期的胃癌细胞1×104置于25mL的培养瓶中，同时加入1μmol/L和5μmol/L的氧化砷，对照组加等体积的培养液，连续培养6d. 每天各取3瓶，以台盼蓝染色法计算活细胞数，取平均值，绘制生长曲线.
1.2.2 氧化砷对胃癌细胞集落形成的影响 取对数生长期的胃癌细胞，采用有限稀释法，以每孔500细胞置于六孔培养板中，实验组分别加入1μmol/L和5μmol/L的氧化砷，对照组不加药，培养6d，以台盼蓝染色法计算细胞集落数.
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1.2.3 氧化砷对胃癌细胞的细胞毒作用 采用MTT比色法. 将对数生长期的胃癌细胞以1×104加入96孔培养板中，培养24h. 实验孔分别加入10，5，1，0.5μmol/L氧化砷，每孔设3个复孔，分别培养24h和48h，每孔加入MTT100μL(1g/L)，作用4h后，加入DMSO 100μL，孵育30min，在酶标仪570nm处测吸光度A值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照组A值×100%.
1.2.4 氧化砷诱导胃癌细胞凋亡的研究 ①形态学观察：取对数期生长的SGC-7901细胞5×104铺于置有盖玻片的六孔细胞培养板内，培养24h，加入终浓度为10，5，1，0.5μmol/L的氧化砷，与细胞共同培养12，24，48，72h. 不加药组为对照组. 按上述时间终止细胞培养，倒去孔内培养液，100mL/L福尔马林固定30min. 0.1mol/L PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，作HE染色后，光镜下观察. ②DNA末端原位标记染色法(TUNEL)：取对数期生长的SGC-7901细胞5×104铺于置有盖玻片的六孔细胞培养板内，培养24h，加入终浓度为10μmol/L和1μmol/L的氧化砷，与细胞共同培养24，48h. 不加药组为对照组. 按上述时间终止细胞培养，弃去孔内培养液，40g/L多聚甲醛固定30min. 0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤3次，每次5min. 3mL/L过氧化氢-甲醛溶液处理，室温30min. 预冷的1g/L Triton-X 100处理,4℃，2min. PBS洗涤.
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以下步骤按Boehringer Mannheim公司药盒说明进行. 每孔中分别加入TUNEL反应液50μL，37℃水浴60min，PBS洗涤. 各孔分别加入POD液50μL，37℃水浴30min，PBS洗涤. 各孔分别加入50μL DAB-过氧化氢液，15min显色. 光镜下计算凋亡指数. 凋亡指数(apoptosis index, AI)计算方法：数5个高倍镜>1000个细胞，分别计数凋亡细胞和总细胞数. AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%. ③流式细胞仪检测：收集经过不同浓度药物处理的胃癌细胞，PBS洗涤后，用4℃乙醇固定12h以上，离心除去乙醇，加入10g/L RNA酶溶液200μL，37℃水浴15min，加入碘化化啶(PI，Sigma公司)，上FACStarplus流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料均经lysis Ⅱ软件收集、贮存和分析.
2 结果
2.1 氧化砷对胃癌细胞生长的影响 1μmol/L和5μmol/L氧化砷均能抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，随着时间延长，浓度增加. 抑制细胞生长越明显，各浓度和对照组之间差异显著(P<0.01，图1).
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图1 氧化砷对SGC-7901细胞增殖的影响.
2.2 氧化砷对胃癌细胞SGC-7901的集落形成的影响 1μmol/L和5μmol/L氧化砷能够明显抑制胃癌细胞的集落形成，差异非常显著(12.4%±3.3%，6.8%±2.6% vs 20.6%±5.7%，P<0.01)，且单个集落中细胞数普遍少于对照组.
2.3 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞毒作用 1μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率约为10.8%，随着时间延长，浓度增加，细胞毒作用也明显增强. 10μmol/L氧化砷作用48h，细胞杀伤率接近50%(表1). 表明氧化砷对胃癌细胞有较强的细胞毒作用.
2.4 氧化砷诱导SGC-7901细胞凋亡的结果 ①形态学观察：氧化砷作用12h后，细胞开始出现凋亡的形态学改变；24h凋亡细胞增多；48h凋亡细胞明显增加；72h伴有大量细胞死亡. 通过HE染色，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩 ，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. ②采用TUNEL方法研究表明，氧化砷能够诱导胃癌细胞凋亡(表2)，诱导凋亡的作用与氧化砷的浓度和作用时间相关. 流式细胞仪DNA直方图(图2)上出现典型的亚二倍体的凋亡峰. ③氧化砷对SGC-7901细胞周期的影响：10μmol/L氧化砷作用24h，细胞周期没有明显变化，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，S期细胞从25.6%下降到18.8%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%(表3)，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡.
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图2 氧化砷诱导SGC-7901细胞凋亡的时相规律(FACS分析图象).
表1 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞毒作用
(%)
作用时间
(t/h)
氧化砷(c/μmol.L-1)
10
5
1
0.5
24h
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24.6±6.3
18.4±4.7
10.8±4.2
5.3±2.4
48h
48.2±7.6
32.3±3.5
18.6±4.8
9.4±3.6
表2 氧化砷诱导SGC-7901细胞的凋亡指数
(%，n=5)
作用时间(t/h)
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氧化砷(c/μmol.L-1)
10
1
0(对照组)
24h
2.1±0.3a
1.4±0.4a
0.9±0.2
48h
7.3±0.7ab
3.1±0.5ab
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1.9±0.4
aP<0.05，vs 对照组；bP<0.01，vs 24h组.
表3 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞周期的影响
(%)
组别
G0/G1
S
G2/M
对照组
54.2±1.08
25.6±0.51
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20.2±0.60
24h
59.0±0.39
28.8±0.28
12.3±0.12
48h
17.7±0.00b
18.8±0.00
63.4±1.00b
bP<0.01，vs 对照组.
3 讨论
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众多研究表明，胃癌的发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过度有关，而且与细胞凋亡减少有关[2]. 近年来，随着人们对细胞凋亡机制的深入研究，发现目前临床应用的大多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一，因此设法诱导肿瘤细胞凋亡，将成为新的治疗方向.
氧化砷是一些中药(吡霜、复方青黛等)的主要有效成分，长期以来被认为是一种致癌剂，能抑制细胞DNA和RNA的合成，干扰细胞代谢，致染色体畸变[3]. 我国学者首次应用砷剂治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)取得显著成功[4]，并进一步证实氧化砷是通过诱导凋亡而发挥治疗作用的[5]. 氧化砷对胃癌是否有治疗作用，目前尚缺乏系统研究.
本研究表明，氧化砷能够明显抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，抑制程度与药物的浓度和作用时间有关. 氧化砷能够显著抑制SGC-7901细胞的集落形成，呈剂量依赖性，5μmol/L氧化砷抑制率明显高于1μmol/L氧化砷. 细胞毒实验表明，氧化砷对胃癌细胞具有较强的细胞毒作用，10μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率为24.6%，48h接近50%. 氧化砷的细胞毒作用呈时间和剂量依赖性. 氧化砷治疗APL的机制是诱导细胞凋亡和部分诱导分化[6]. 本研究初步证明，氧化砷也能够诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡. 氧化砷作用于细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. 流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体的凋亡峰. 流式细胞仪检测(数据未显示)和TDT染色法表明，细胞凋亡率为7.3%～15.1%. 比较细胞毒和凋亡作用的结果，发现细胞凋亡率明显低于细胞杀伤率，除细胞凋亡定量检测的方法的局限性外，可能与细胞凋亡发生的整个过程较短暂，细胞凋亡的时间不同步. 部分凋亡的细胞已碎裂而没能检测到有关.
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氧化砷对胃癌细胞的细胞毒作用，表现为细胞周期特异性，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G0/G1期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，使细胞阻滞于G2/M期. 有关氧化砷治疗肿瘤的作用机制的研究，目前尚未完全阐明. 上海血研所对氧化砷治疗血液系统肿瘤的机制方面作了大量的开拓性的工作，证实氧化砷能够下调APL细胞Bcl-2的表达[5]，降低K562细胞的BCR/ABL蛋白的PTK活性，减少蛋白酪氨酸磷酸化，阻断BCR/ABL抗凋亡信号的传导，诱导细胞凋亡[6]. 本研究小组正对氧化砷诱导胃癌细胞凋亡的相关基因进行研究.
作者简介：涂水平，男，1966-06-29生，江西省南丰县人，汉族. 1989年苏州医学院医疗系毕业，主治医师，医学博士，主要从事消化道肿瘤的研究，发表论文6篇，参与3部专著有关章节的编写.
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*上海市科委基金资助课题，No.964119035.
通讯作者 涂水平，200025，上海第二医科大学瑞金医院消化科，上海市瑞金二路197号.
*Supported by the Natural Science Foundation of Shanghai Municipal Commission of Science & Technology, No. 964119035.
Correspondence to:Dr. TU Shui-Ping, Department of Gastroenterology, Shanghai Second Medical University, 197 Ruijinerlu, Shanghai 200025, China
Tel. +86.21.64370045 Ext. 1144
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作者单位：涂水平 江石湖 谭继宏 蒋晓华 乔敏敏 章永平 吴云林 吴裕忻 上海第二医科大学瑞金医院消化科 上海市 200025
4 参考文献
[1] Chen GQ, Zhu J, Shi XG,Xiao LJ,Wei T,Xiu SL,Shun MX,Zhi XS,Sun GL,Jun Ma.Zhang P,Zhang TD,Glaude G,Tomoki N,Chen SJ,Wang ZY,Chen Z. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic troxideiu,hun in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARa/PML proteins. Blood, 1996;88(3):1053-1058
, 百拇医药
[2] 涂水平，吴裕忻. 细胞凋亡与胃肠肿瘤. 内镜，1997;3 (1):61-64
[3] Dong JT, Luo XM. Effects of arsenic on DNA damage and repaire in human fetal lung fibroblasts. Mutat Res, 1994;315(1):12-14
[4] 孙洪德，李元善，马玲，张藤岱. 癌灵1号结合中药辩证治疗急性早幼粒细胞白血病32例. 中国中西医结合杂志，1992；12：171-173
[5] 唐玮，陈国强，沈志祥，史桂英，倪建华，陈赛娟，王振义，陈竺. 氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的体外研究. 中华血液学杂志，1997；18：624-65
[6] 肖冬梅，孙关林，乌维礼，陈竺，王振义，苏卉，李佳，戴勤勇. As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪氨酸蛋白激酶活性的变化. 中华血液学杂志，1998；19：235-236
收稿日期 1998-07-31, http://www.100md.com
单位：
关键词：胃肿瘤/治疗；氧化砷；细胞凋亡
中国图书资料分类号 R735中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 研究氧化砷对胃癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.
方法 应用细胞集落形成实验、MTT，TUNEL染色、流式细胞仪技术，研究氧化砷对胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制、细胞毒和诱导凋亡的作用.
结果 氧化砷能显著抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，5μmol/L氧化砷抑制程度明显强于1μmol/L(P<0.05)，5μmol/L和1μmol/L的氧化砷作用后的细胞集落形成率分别为12.4%±3.3%和6.8%±2.6%，明显低于对照组的20.6%±5.7%(P<0.01). 氧化砷对胃癌细胞具有较强的细胞毒作用，10μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率为24.6%，48h接近50%. 氧化砷作用于细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. 流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”. TDT染色法显示，细胞凋亡指数为7.3%～15.1%. 氧化砷的细胞毒作用呈时间和剂量依赖性，且表现为细胞周期特异性，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡.
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结论 氧化砷具有抑制胃癌细胞SGC-7901增殖和诱导细胞凋亡的作用，具有治疗胃癌的潜在价值.
Proliferation inhibition and apoptosis induction by arsenic trioxide on gastric cancer cell SGC-7901*
TU Shui-Ping, JIANG Shi-Hu, TAN Ji-Hong, JIANG Xiao-Hua, QIAO Min-Min, ZHANG Yong-Ping, WU Yun-Lin and WU Yu-Xin
Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
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Subject headings stomach neoplasms/therapy; arsenic trioxide; apoptosis
Abstract
AIM To explore the effect of arsenic trioxide (As2O3) in inhibition of proliferation and induction of apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901.
METHODS Morphologic changes, proliferation ability, colony-forming rate of gastric cancer cell SGC-7901 treated by As2O3 were studied by light microscopy, growth curve and colony-forming assay. The cytotoxicity of As2O3 on SGC-7901 was determined by MTT assay. Apoptosis and cell cycle changes of SGC-7901 induced by As2O3 was investigated by TUNEL method and flow cytometry.
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RESULTS As2O3 can inhibit significantly the growth of SGC-7901. Colony-forming rate of SGC-7901 with 5μmol/L As2O3 (6.8%±2.6%) was lower than that with 1μmol/L As2O3 (12.4%±3.3%, P<0.01), and much lower than that of control group (20.6%±5.3%, P<0.01). As2O3 had a remarkable cytotoxic effect on SGC-7901. The cytotoxic rate of 10μmol/L As2O3 on SGC-7901 was almost 50.0% in 48 hours. After 12 hours of exposure to the drug, SGC-7901 exhibited morphologic features of apoptosis, including cell shrinkage, nuclear condensation, DNA fragmentation and formation of apoptotic bodies. A typical subdiploid peak before G0/G1 phase was observed by flow cytometry. The apoptotic index was 7%-15% by TUNEL and FACS assay. The effect of As2O3 on SGC-7901 showed a remarkable cell cycle specificity, which indicates that As2O3 mainly acts in G2/M phase.
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CONCLUSION As2O3 can inhibit significantly proliferation of gastric cancer cell SGC-7901 and induce apoptosis and it has a potential. value in the treatment of gastric cancer, and was worth further studies.
0 引言
胃癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率高，晚期尚缺乏有效的治疗手段，寻找新的治疗药物和治疗手段乃当务之急. 诱导胃癌细胞凋亡是治疗的新思路. 氧化砷已成功地应用于临床治疗急性早幼粒细胞性白血病，其机制为诱导肿瘤细胞凋亡[1]. 氧化砷对实体肿瘤是否有治疗作用，尚不肯定. 我们报道三氧化二砷(氧化砷)对中分化程度的胃腺癌细胞株SGC-7901细胞的体外抑制增殖和诱导凋亡的作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 氧化砷注射液，美国Sigma公司产品. RPMI 1640培养基，Gibco公司产品. 胃癌细胞株SGC-7901(中分化腺癌)，由本实验室传代培养. 细胞凋亡原位检测试剂盒，德国Boehringer Mannheim公司产品. FACScan美国BD公司产品.
1.2 方法
1.2.1 氧化砷对胃癌细胞生长曲线的影响 取对数生长期的胃癌细胞1×104置于25mL的培养瓶中，同时加入1μmol/L和5μmol/L的氧化砷，对照组加等体积的培养液，连续培养6d. 每天各取3瓶，以台盼蓝染色法计算活细胞数，取平均值，绘制生长曲线.
1.2.2 氧化砷对胃癌细胞集落形成的影响 取对数生长期的胃癌细胞，采用有限稀释法，以每孔500细胞置于六孔培养板中，实验组分别加入1μmol/L和5μmol/L的氧化砷，对照组不加药，培养6d，以台盼蓝染色法计算细胞集落数.
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1.2.3 氧化砷对胃癌细胞的细胞毒作用 采用MTT比色法. 将对数生长期的胃癌细胞以1×104加入96孔培养板中，培养24h. 实验孔分别加入10，5，1，0.5μmol/L氧化砷，每孔设3个复孔，分别培养24h和48h，每孔加入MTT100μL(1g/L)，作用4h后，加入DMSO 100μL，孵育30min，在酶标仪570nm处测吸光度A值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(%)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照组A值×100%.
1.2.4 氧化砷诱导胃癌细胞凋亡的研究 ①形态学观察：取对数期生长的SGC-7901细胞5×104铺于置有盖玻片的六孔细胞培养板内，培养24h，加入终浓度为10，5，1，0.5μmol/L的氧化砷，与细胞共同培养12，24，48，72h. 不加药组为对照组. 按上述时间终止细胞培养，倒去孔内培养液，100mL/L福尔马林固定30min. 0.1mol/L PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，作HE染色后，光镜下观察. ②DNA末端原位标记染色法(TUNEL)：取对数期生长的SGC-7901细胞5×104铺于置有盖玻片的六孔细胞培养板内，培养24h，加入终浓度为10μmol/L和1μmol/L的氧化砷，与细胞共同培养24，48h. 不加药组为对照组. 按上述时间终止细胞培养，弃去孔内培养液，40g/L多聚甲醛固定30min. 0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤3次，每次5min. 3mL/L过氧化氢-甲醛溶液处理，室温30min. 预冷的1g/L Triton-X 100处理,4℃，2min. PBS洗涤.
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以下步骤按Boehringer Mannheim公司药盒说明进行. 每孔中分别加入TUNEL反应液50μL，37℃水浴60min，PBS洗涤. 各孔分别加入POD液50μL，37℃水浴30min，PBS洗涤. 各孔分别加入50μL DAB-过氧化氢液，15min显色. 光镜下计算凋亡指数. 凋亡指数(apoptosis index, AI)计算方法：数5个高倍镜>1000个细胞，分别计数凋亡细胞和总细胞数. AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%. ③流式细胞仪检测：收集经过不同浓度药物处理的胃癌细胞，PBS洗涤后，用4℃乙醇固定12h以上，离心除去乙醇，加入10g/L RNA酶溶液200μL，37℃水浴15min，加入碘化化啶(PI，Sigma公司)，上FACStarplus流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期，资料均经lysis Ⅱ软件收集、贮存和分析.
2 结果
2.1 氧化砷对胃癌细胞生长的影响 1μmol/L和5μmol/L氧化砷均能抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，随着时间延长，浓度增加. 抑制细胞生长越明显，各浓度和对照组之间差异显著(P<0.01，图1).
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图1 氧化砷对SGC-7901细胞增殖的影响.
2.2 氧化砷对胃癌细胞SGC-7901的集落形成的影响 1μmol/L和5μmol/L氧化砷能够明显抑制胃癌细胞的集落形成，差异非常显著(12.4%±3.3%，6.8%±2.6% vs 20.6%±5.7%，P<0.01)，且单个集落中细胞数普遍少于对照组.
2.3 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞毒作用 1μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率约为10.8%，随着时间延长，浓度增加，细胞毒作用也明显增强. 10μmol/L氧化砷作用48h，细胞杀伤率接近50%(表1). 表明氧化砷对胃癌细胞有较强的细胞毒作用.
2.4 氧化砷诱导SGC-7901细胞凋亡的结果 ①形态学观察：氧化砷作用12h后，细胞开始出现凋亡的形态学改变；24h凋亡细胞增多；48h凋亡细胞明显增加；72h伴有大量细胞死亡. 通过HE染色，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩 ，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. ②采用TUNEL方法研究表明，氧化砷能够诱导胃癌细胞凋亡(表2)，诱导凋亡的作用与氧化砷的浓度和作用时间相关. 流式细胞仪DNA直方图(图2)上出现典型的亚二倍体的凋亡峰. ③氧化砷对SGC-7901细胞周期的影响：10μmol/L氧化砷作用24h，细胞周期没有明显变化，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，S期细胞从25.6%下降到18.8%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%(表3)，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G2/M期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡.
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图2 氧化砷诱导SGC-7901细胞凋亡的时相规律(FACS分析图象).
表1 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞毒作用
(%)
作用时间
(t/h)
氧化砷(c/μmol.L-1)
10
5
1
0.5
24h
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24.6±6.3
18.4±4.7
10.8±4.2
5.3±2.4
48h
48.2±7.6
32.3±3.5
18.6±4.8
9.4±3.6
表2 氧化砷诱导SGC-7901细胞的凋亡指数
(%，n=5)
作用时间(t/h)
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氧化砷(c/μmol.L-1)
10
1
0(对照组)
24h
2.1±0.3a
1.4±0.4a
0.9±0.2
48h
7.3±0.7ab
3.1±0.5ab
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1.9±0.4
aP<0.05，vs 对照组；bP<0.01，vs 24h组.
表3 氧化砷对SGC-7901细胞的细胞周期的影响
(%)
组别
G0/G1
S
G2/M
对照组
54.2±1.08
25.6±0.51
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20.2±0.60
24h
59.0±0.39
28.8±0.28
12.3±0.12
48h
17.7±0.00b
18.8±0.00
63.4±1.00b
bP<0.01，vs 对照组.
3 讨论
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众多研究表明，胃癌的发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过度有关，而且与细胞凋亡减少有关[2]. 近年来，随着人们对细胞凋亡机制的深入研究，发现目前临床应用的大多数抗肿瘤药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，诱导凋亡是其抗肿瘤的主要机制之一，因此设法诱导肿瘤细胞凋亡，将成为新的治疗方向.
氧化砷是一些中药(吡霜、复方青黛等)的主要有效成分，长期以来被认为是一种致癌剂，能抑制细胞DNA和RNA的合成，干扰细胞代谢，致染色体畸变[3]. 我国学者首次应用砷剂治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)取得显著成功[4]，并进一步证实氧化砷是通过诱导凋亡而发挥治疗作用的[5]. 氧化砷对胃癌是否有治疗作用，目前尚缺乏系统研究.
本研究表明，氧化砷能够明显抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，抑制程度与药物的浓度和作用时间有关. 氧化砷能够显著抑制SGC-7901细胞的集落形成，呈剂量依赖性，5μmol/L氧化砷抑制率明显高于1μmol/L氧化砷. 细胞毒实验表明，氧化砷对胃癌细胞具有较强的细胞毒作用，10μmol/L氧化砷作用24h细胞杀伤率为24.6%，48h接近50%. 氧化砷的细胞毒作用呈时间和剂量依赖性. 氧化砷治疗APL的机制是诱导细胞凋亡和部分诱导分化[6]. 本研究初步证明，氧化砷也能够诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡. 氧化砷作用于细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化：细胞核固缩，染色质凝集，呈新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等. 流式细胞仪DNA直方图上出现典型的亚二倍体的凋亡峰. 流式细胞仪检测(数据未显示)和TDT染色法表明，细胞凋亡率为7.3%～15.1%. 比较细胞毒和凋亡作用的结果，发现细胞凋亡率明显低于细胞杀伤率，除细胞凋亡定量检测的方法的局限性外，可能与细胞凋亡发生的整个过程较短暂，细胞凋亡的时间不同步. 部分凋亡的细胞已碎裂而没能检测到有关.
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氧化砷对胃癌细胞的细胞毒作用，表现为细胞周期特异性，作用48h后，SGC-7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从54.2%下降到17.7%，而G2/M期细胞则从20.2%上升63.4%，说明氧化砷主要作用于细胞周期的G0/G1期，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，使细胞阻滞于G2/M期. 有关氧化砷治疗肿瘤的作用机制的研究，目前尚未完全阐明. 上海血研所对氧化砷治疗血液系统肿瘤的机制方面作了大量的开拓性的工作，证实氧化砷能够下调APL细胞Bcl-2的表达[5]，降低K562细胞的BCR/ABL蛋白的PTK活性，减少蛋白酪氨酸磷酸化，阻断BCR/ABL抗凋亡信号的传导，诱导细胞凋亡[6]. 本研究小组正对氧化砷诱导胃癌细胞凋亡的相关基因进行研究.
作者简介：涂水平，男，1966-06-29生，江西省南丰县人，汉族. 1989年苏州医学院医疗系毕业，主治医师，医学博士，主要从事消化道肿瘤的研究，发表论文6篇，参与3部专著有关章节的编写.
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*上海市科委基金资助课题，No.964119035.
通讯作者 涂水平，200025，上海第二医科大学瑞金医院消化科，上海市瑞金二路197号.
*Supported by the Natural Science Foundation of Shanghai Municipal Commission of Science & Technology, No. 964119035.
Correspondence to:Dr. TU Shui-Ping, Department of Gastroenterology, Shanghai Second Medical University, 197 Ruijinerlu, Shanghai 200025, China
Tel. +86.21.64370045 Ext. 1144
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作者单位：涂水平 江石湖 谭继宏 蒋晓华 乔敏敏 章永平 吴云林 吴裕忻 上海第二医科大学瑞金医院消化科 上海市 200025
4 参考文献
[1] Chen GQ, Zhu J, Shi XG,Xiao LJ,Wei T,Xiu SL,Shun MX,Zhi XS,Sun GL,Jun Ma.Zhang P,Zhang TD,Glaude G,Tomoki N,Chen SJ,Wang ZY,Chen Z. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic troxideiu,hun in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RARa/PML proteins. Blood, 1996;88(3):1053-1058
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[2] 涂水平，吴裕忻. 细胞凋亡与胃肠肿瘤. 内镜，1997;3 (1):61-64
[3] Dong JT, Luo XM. Effects of arsenic on DNA damage and repaire in human fetal lung fibroblasts. Mutat Res, 1994;315(1):12-14
[4] 孙洪德，李元善，马玲，张藤岱. 癌灵1号结合中药辩证治疗急性早幼粒细胞白血病32例. 中国中西医结合杂志，1992；12：171-173
[5] 唐玮，陈国强，沈志祥，史桂英，倪建华，陈赛娟，王振义，陈竺. 氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的体外研究. 中华血液学杂志，1997；18：624-65
[6] 肖冬梅，孙关林，乌维礼，陈竺，王振义，苏卉，李佳，戴勤勇. As2O3诱导K562细胞凋亡过程中酪氨酸蛋白激酶活性的变化. 中华血液学杂志，1998；19：235-236
收稿日期 1998-07-31, http://www.100md.com