170种中草药抗乙型肝炎病毒的实验研究*
作者：李 文1 邹正宇2 查 赣2 郑民实1 黄孝天1
单位：李 文 郑民实 黄孝天 江西医学院微生物学教研室 江西省南昌市 330006； 邹正宇 查 赣 江西省南昌市传染病医院 江西省南昌市 330002
关键词：乙型肝炎病毒；肝炎，乙型/治疗；中草药
中国图书资料分类号 R512中国图书资料分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; hepatitis B/therapy; drugs, chinese herbal
乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎正严重威胁着中国人的健康和生命，临床用药品种繁多，但无论中西医治疗均无重大突破. 本文采用斑点杂交技术对170种中草药进行了体外抑制HBV的实验研究，现将结果报告如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 受试药来自国内各协作研究所(院). 称取生药10g，粉碎后加入适量无离子水煎煮3次，过滤除渣后配成100mg/mL，调至pH 7.0，煮沸消毒30min，4℃保存，正式试验的终浓度为40mg. 收集HBV-DNA斑点杂交法的阳性乙型肝炎患者血清200份，倍比加入高渗(30%)蔗糖溶液，经超速(1.56×105g)冷冻离心沉淀2h，分离出底层沉淀物，加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS)，分装后-40℃备存.
1.2 方法 采用HBV-DNA斑点杂交法[1]检测药效，每次试验重复4次. ①选择受试药物：药物在硝基纤维滤膜上点样，经模拟杂交过程处理后立即加入氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)显色，另滴加碱性磷酸酶37℃作用1h后添加NBT和BCIP，籍以排除药物所致假阳性/假阴性结果，此类药为受试药物. ②点膜：吸取病毒液40uL加入抗-HBs 40uL后37℃孵育2h，再滴加受试药物40uL，置于4℃作用24h后在硝基纤维滤膜上真空抽滤点膜. ③变性：使用0.5N NaOH溶液浸泡10min，致使DNA变性为单链形式固定在滤膜上，经三羟甲基氨基甲烷(Tris)梯度递减溶液漂洗后80℃烤干. ④杂交：滤膜放进塑料袋，经预杂交液42℃处理过夜，再加入单链生物素探针(Bio-DNA)进行杂交，使用漂洗液漂洗后再与抗生物素碱性磷酸酶作用. ⑤显色：用NBT和BCIP作为底物显色1h～2h.
, 百拇医药
2 结果
2.1 结果判定 依据有无蓝/紫色斑点和颜色深浅判定药效，病毒对照的蓝/紫色斑点的直径和颜色的深度为“+++”，药物出现斑点的直径抑制1/3,2/3与颜色的递减分别为“++”(低效药)、“+”(中效药)，蓝/紫色斑点完全抑制为“-”(高效药)以及斑点与颜色无抑制为“+++”(无效药).
2.2 受试结果 受试的170种中草药中19种对纯化的HBV-DNA有不同程度的抑制作用. 结果见表1所示. 表1中的草果、黄连、北山楂、虎杖、猪苓和大黄为高效药，表中苍术、赤芍和虎杖为病毒性肝炎防治方案[2]推荐药物. 无效药物即结果判定为“+++”的药物如：木通、当归、白术、白芍、叶下珠等未逐一列出.
表1 19种有效药物对纯化HBV的抑制作用
(n=4)
, 百拇医药
泽 泻
Alisma plantago-aquatical
++
草 果
Amomum tsao-ko
-
苍 术
Atractylodes lancea
+
黄 连
Coptis chinensis
-
, 百拇医药
北山楂
Crataegus pinnatifida
-
淫羊霍
Epimedium grandiflorum
+
杜 仲
Eucommia ulmoides
+
金钱草
Glechoma longituba
++
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板兰根
Isatis tinctoria
++
女贞子
Ligustrum incidum
++
半边莲
Lobelia chinenis
++
五倍子
Melaphis chinensis
+
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赤 芍
Paeonia lactiflora
+
虎 杖
Polygonum cuspidatum
-
猪 苓
Polyporus umbellatus
-
夏枯草
Prunella vulgaris
++
, 百拇医药
大 黄
Rheum palmatum
-
土大黄叶
Rumex madaio
+
海 藻
Sargassum fusiforme
+
3 讨论
乙型肝炎具有传染性强，流行面广和发病率高的特点，本病是目前已知七型(甲，乙，丙，丁，戊，己，庚)肝炎中危害最大的一种. 1991年报道我国至少有6亿人感染过乙型肝炎，约有1.2亿人群携带乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，其中25%最终将发展为慢性肝病(肝硬变与原发性肝癌)[3]. HBV感染与肝癌发生直接相关的证据来自流行病学研究，每年因本病死亡占30万人，约有80～100万新生儿系HBsAg携带者(AsC)，其中一部分人成年后转变为肝硬变和原发性肝癌. 每年直接经济损失约222.64亿元[3]. 目前国内市场上虽有保肝护肝药、免疫增强剂和“乙肝灵”充斥，但乙型肝炎患者仍与日剧增. 每疗程上万元的化学合成药与生物制品(诸如iRNA，Ara-AMP和IFN)，酶标法(ELISA)的HBsAg/HBeAg阴转率仅有30%左右，若采用生物探针或DNA扩增技术检测HBV-DNA阳性占85%，尚存在停药反跳问题. 鉴于最危险的传染源为HBsAg携带者已逾1.2亿以及HBV-DNA的出现提示病毒在肝脏内有大量复制的证据，故研究高效抑杀HBV-DNA与阻止HBV-DNA复制的药物为当务之急[3-9].
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中医是祖国医学宝贵财富，国外学者亦纷纷将分子生物学新技术用于中医药方面研究，我们结合本实验室研究抗病毒中草药37a历史，采用DNA探针技术检测中草药抗HBV实验室药效，将现代高分子生物学新技术应用于抗病毒药物实验研究. 本工作将开辟寻找抗病毒/细菌/支原体/癌基因药物的有效途径和广阔前景，此为药物实验研究与高分子生物技术结合后药物学发展的新起点.
作者简介:*江西省自然科学基金(青年基金)资助课题，No.960001
通讯作者 李文
4 参考文献
[1] 杜绍财. DNA分子杂交检测血清中HBV-DNA. 北京医科大学学报，1985；(1)：36-37
[2] 李文. 中草药抑制HBV-DNA的实验研究. 中医杂志，1997；38：46-47
, 百拇医药
[3] 袁桂清. 全国乙型肝炎防治研讨会. 中华医学信息导报，1991；(5)：5
[4] Xie H, Voronkov M, Liotta DC. Phosphatidy-1-2＇,3＇-dideoxy-3＇-thiacytidine. Synthesis and antiviral activity in hepatitis B and HIV-1-infected cells. Antiviral Research, 1995;28:113
[5] Weiss L, Hildt E. Anti-hepatitis B virus activity of N-acetyl-L-cysteine. Antiviral Research, 1996;32:43
[6] Korba BE. In vitro evaluation of combination therapies against hepatitis replication. Antiviral Research, 1996;29:49-51
, http://www.100md.com
[7] Kojima S, Inaba K. Inhibitory effects of traditional Chinese medicine. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1996;19:47-48
[8] Summerfield A, Keil GM. Antiviral activity of an extract from leaves of the tropical plant Acanthospermum hispidum. Antiviral Research, 1997;36:60-61
[9] Parang K, Wiebe Li. In vitro antiviral activities of myristic acid analogs against human immunodeficiency and hepatitis B virus. Antiviral Research, 1997;34:75-76
收稿日期 1998-07-07, 百拇医药(李 文1 邹正宇2 查 赣2 郑民实1 黄孝天1)
单位：李 文 郑民实 黄孝天 江西医学院微生物学教研室 江西省南昌市 330006； 邹正宇 查 赣 江西省南昌市传染病医院 江西省南昌市 330002
关键词：乙型肝炎病毒；肝炎，乙型/治疗；中草药
中国图书资料分类号 R512中国图书资料分类号 R512.62
Subject headings hepatitis B virus; hepatitis B/therapy; drugs, chinese herbal
乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎正严重威胁着中国人的健康和生命，临床用药品种繁多，但无论中西医治疗均无重大突破. 本文采用斑点杂交技术对170种中草药进行了体外抑制HBV的实验研究，现将结果报告如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 受试药来自国内各协作研究所(院). 称取生药10g，粉碎后加入适量无离子水煎煮3次，过滤除渣后配成100mg/mL，调至pH 7.0，煮沸消毒30min，4℃保存，正式试验的终浓度为40mg. 收集HBV-DNA斑点杂交法的阳性乙型肝炎患者血清200份，倍比加入高渗(30%)蔗糖溶液，经超速(1.56×105g)冷冻离心沉淀2h，分离出底层沉淀物，加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS)，分装后-40℃备存.
1.2 方法 采用HBV-DNA斑点杂交法[1]检测药效，每次试验重复4次. ①选择受试药物：药物在硝基纤维滤膜上点样，经模拟杂交过程处理后立即加入氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)显色，另滴加碱性磷酸酶37℃作用1h后添加NBT和BCIP，籍以排除药物所致假阳性/假阴性结果，此类药为受试药物. ②点膜：吸取病毒液40uL加入抗-HBs 40uL后37℃孵育2h，再滴加受试药物40uL，置于4℃作用24h后在硝基纤维滤膜上真空抽滤点膜. ③变性：使用0.5N NaOH溶液浸泡10min，致使DNA变性为单链形式固定在滤膜上，经三羟甲基氨基甲烷(Tris)梯度递减溶液漂洗后80℃烤干. ④杂交：滤膜放进塑料袋，经预杂交液42℃处理过夜，再加入单链生物素探针(Bio-DNA)进行杂交，使用漂洗液漂洗后再与抗生物素碱性磷酸酶作用. ⑤显色：用NBT和BCIP作为底物显色1h～2h.
, 百拇医药
2 结果
2.1 结果判定 依据有无蓝/紫色斑点和颜色深浅判定药效，病毒对照的蓝/紫色斑点的直径和颜色的深度为“+++”，药物出现斑点的直径抑制1/3,2/3与颜色的递减分别为“++”(低效药)、“+”(中效药)，蓝/紫色斑点完全抑制为“-”(高效药)以及斑点与颜色无抑制为“+++”(无效药).
2.2 受试结果 受试的170种中草药中19种对纯化的HBV-DNA有不同程度的抑制作用. 结果见表1所示. 表1中的草果、黄连、北山楂、虎杖、猪苓和大黄为高效药，表中苍术、赤芍和虎杖为病毒性肝炎防治方案[2]推荐药物. 无效药物即结果判定为“+++”的药物如：木通、当归、白术、白芍、叶下珠等未逐一列出.
表1 19种有效药物对纯化HBV的抑制作用
(n=4)
, 百拇医药
泽 泻
Alisma plantago-aquatical
++
草 果
Amomum tsao-ko
-
苍 术
Atractylodes lancea
+
黄 连
Coptis chinensis
-
, 百拇医药
北山楂
Crataegus pinnatifida
-
淫羊霍
Epimedium grandiflorum
+
杜 仲
Eucommia ulmoides
+
金钱草
Glechoma longituba
++
, http://www.100md.com
板兰根
Isatis tinctoria
++
女贞子
Ligustrum incidum
++
半边莲
Lobelia chinenis
++
五倍子
Melaphis chinensis
+
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赤 芍
Paeonia lactiflora
+
虎 杖
Polygonum cuspidatum
-
猪 苓
Polyporus umbellatus
-
夏枯草
Prunella vulgaris
++
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大 黄
Rheum palmatum
-
土大黄叶
Rumex madaio
+
海 藻
Sargassum fusiforme
+
3 讨论
乙型肝炎具有传染性强，流行面广和发病率高的特点，本病是目前已知七型(甲，乙，丙，丁，戊，己，庚)肝炎中危害最大的一种. 1991年报道我国至少有6亿人感染过乙型肝炎，约有1.2亿人群携带乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，其中25%最终将发展为慢性肝病(肝硬变与原发性肝癌)[3]. HBV感染与肝癌发生直接相关的证据来自流行病学研究，每年因本病死亡占30万人，约有80～100万新生儿系HBsAg携带者(AsC)，其中一部分人成年后转变为肝硬变和原发性肝癌. 每年直接经济损失约222.64亿元[3]. 目前国内市场上虽有保肝护肝药、免疫增强剂和“乙肝灵”充斥，但乙型肝炎患者仍与日剧增. 每疗程上万元的化学合成药与生物制品(诸如iRNA，Ara-AMP和IFN)，酶标法(ELISA)的HBsAg/HBeAg阴转率仅有30%左右，若采用生物探针或DNA扩增技术检测HBV-DNA阳性占85%，尚存在停药反跳问题. 鉴于最危险的传染源为HBsAg携带者已逾1.2亿以及HBV-DNA的出现提示病毒在肝脏内有大量复制的证据，故研究高效抑杀HBV-DNA与阻止HBV-DNA复制的药物为当务之急[3-9].
, http://www.100md.com
中医是祖国医学宝贵财富，国外学者亦纷纷将分子生物学新技术用于中医药方面研究，我们结合本实验室研究抗病毒中草药37a历史，采用DNA探针技术检测中草药抗HBV实验室药效，将现代高分子生物学新技术应用于抗病毒药物实验研究. 本工作将开辟寻找抗病毒/细菌/支原体/癌基因药物的有效途径和广阔前景，此为药物实验研究与高分子生物技术结合后药物学发展的新起点.
作者简介:*江西省自然科学基金(青年基金)资助课题，No.960001
通讯作者 李文
4 参考文献
[1] 杜绍财. DNA分子杂交检测血清中HBV-DNA. 北京医科大学学报，1985；(1)：36-37
[2] 李文. 中草药抑制HBV-DNA的实验研究. 中医杂志，1997；38：46-47
, 百拇医药
[3] 袁桂清. 全国乙型肝炎防治研讨会. 中华医学信息导报，1991；(5)：5
[4] Xie H, Voronkov M, Liotta DC. Phosphatidy-1-2＇,3＇-dideoxy-3＇-thiacytidine. Synthesis and antiviral activity in hepatitis B and HIV-1-infected cells. Antiviral Research, 1995;28:113
[5] Weiss L, Hildt E. Anti-hepatitis B virus activity of N-acetyl-L-cysteine. Antiviral Research, 1996;32:43
[6] Korba BE. In vitro evaluation of combination therapies against hepatitis replication. Antiviral Research, 1996;29:49-51
, http://www.100md.com
[7] Kojima S, Inaba K. Inhibitory effects of traditional Chinese medicine. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1996;19:47-48
[8] Summerfield A, Keil GM. Antiviral activity of an extract from leaves of the tropical plant Acanthospermum hispidum. Antiviral Research, 1997;36:60-61
[9] Parang K, Wiebe Li. In vitro antiviral activities of myristic acid analogs against human immunodeficiency and hepatitis B virus. Antiviral Research, 1997;34:75-76
收稿日期 1998-07-07, 百拇医药(李 文1 邹正宇2 查 赣2 郑民实1 黄孝天1)