用电喷雾离子阱质谱法对SFZ-47在家兔体内两主要代谢物的分析
作者：钟大放 姜浩 顾景凯 周慧
单位：钟大放 姜浩 沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015；顾景凯 周慧 吉林大学分子生物学系，长春 130023
关键词：3H-1，2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮(SFZ-47)；电喷雾；离子阱质谱；代谢物；4-(3H-1，2-二氢-1-吡咯里嗪酮-2-甲基胺基)苯甲酸；β-D-葡糖苷酸结合物
沈阳药科大学学报990101 摘 要 以HPLC对家兔单剂量口服100 mg新抗炎镇痛剂SFZ-47[3H-1，2二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮]后尿中的两主要代谢物进行了分离、制备，再用电喷雾离子阱质谱法对代谢物分别进行结构鉴定.结果表明，采用负离子ESI-MS3检测方式，对代谢物SFZ-47羧基衍生物[4-(3H-1，2-二氢-1-吡咯里嗪酮-2-甲基胺基)苯甲酸]及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物可获得分子结构的丰富信息.
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分类号 R914.1
Identification of Two Major Metabolites of 3H-1，2-Dihydro-2-(4-methyl-phenylamino)methyl-1-pyrrolizinone in Rabbits Using Electrospray Ion Trap Mass Spectrometry
Zhong Dafang,Gu Jingkai,Jiang Hao,Zhou Hui
Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract Two major metabolites of a 100 mg oral dose of SFZ-47[3H-1，2-dihydro-2-(4-methylphenylamino)methyl-1-pyrrolizinone],a new anti-inflammatory and analgesic agent,in rabbit urine were separated and prepared with the high-performance liquid chromatography,and then the structures of the metabolites were identified by the use of the electrospray ion trap mass spectrometry.It was demonstrated that the structures of the two major metabolites of SFZ-47 in rabbits,the carboxylic derivative of SFZ-47[4-(3H-1,2-dihydro-1-pyrrolizinone-2-methylamino)benzoic acid]and its acyl β-D-glucuronide were well characterized with the (-)ESI-MS3 ion trap mass spectrometry.
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Key words 3H-1,2-dihydro-2-(4-methylphenylamino)methyl-1-pyrrolizinone(SFZ-47);electrospray;ion trap mass spectrometry;metabolite;4-(3H-1,2-dihydro-1-pyrrolizinone-2-methyl-amino)benzoic acid;β-D-glucuronide
药物代谢研究在新药研究与开发过程中具有重要意义〔1〕，目前对药物代谢产物的研究通常采用GC/MS获得代谢物的结构信息，再合成相应的标准物质予以确证，但是GC/MS无法对极性大或热不稳定的代谢物进行分析.近年来，随着LC/MS联用接口技术的突破，使得这些物质的分析成为现实〔2～4〕.
SFZ-47[3H-1,2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮]是沈阳药科大学张守芳教授等合成的具有抗炎镇痛活性的新化合物〔5〕，其在家兔尿中的两个代谢物遇热不稳定且其中一结合型代谢物极性较大，前文已用HPLC对照物合成和酶水解等间接法对它们进行了研究〔6〕，初步认定它们分别是SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物.本文用(-)ESI-MSn离子阱新技术对两代谢物进行了直接定性分析，进一步确证了它们的结构，并对LC/MS鉴定结合型代谢物进行了初步尝试.
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1 仪器与方法
1.1 高效液相色谱仪
日本岛津公司LC-10A高效液相色谱仪，包括LC-10AD泵，7175 Rheodyne进样阀，SPD-10A紫外检测器，CBM-10A色谱工作站.
1.2 质谱仪
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，包括APCI(大气压化学电离)、ESI(电喷雾电离)源以及LCQ数据处理系统，并配有直接进样用注射泵和250 μL进样器.
1.3 代谢物分离与制备
按前文已报道的方法给家兔服药并采集尿样〔6〕，然后以相同的色谱条件分离尿样，分别收集由色谱检测器流出的两个代谢物组分，再将收集的组分浓缩至一半体积，置-20℃冰箱保存.
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1.4 质谱仪的分析条件
离子源电压：5 kV;离子源电流：25 μA;壳气(N2)流速：46单位；毛细管电压：-3 V；毛细管温度：150℃；注射泵进样速度：8 μL/min.
1.5 待测物的ESI-MSn分析方法
分别取分离制备的SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物样品，融化后用重蒸馏甲醇稀释至浓度约为1 mg/L，用注射泵将其直接导入ESI离子源.测定时选择负离子方式检测，先用全扫描一级质谱方式获得待测物的准分子离子峰(M-H)-，然后利用ESI-MSn离子阱技术对准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级质谱分析，获得相应的子离子质谱图.
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图1 代谢物M1 (-)ESI-MS全扫描谱图 图2 代谢物M2的(-)ESI-MS全扫描谱图
2 结果
在全扫描一级质谱条件下，分别获得了两个代谢物M1和M2的准分子离子峰m/z 269和m/z 445，如图1和图2所示.根据前文的结果〔6〕，它们分别是SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物对应的M-1峰.为进一步了解两代谢物的质谱断裂规律，本文采用MSn离子阱技术对m/z 269和m/z 445两母离子进行了MS2级质谱分析，结果发现m/z 269母离子裂解成m/z 120和m/z 148两个碎片峰(见图3)，它们的裂解发生在与吡里酮母核相联的碳-碳键.此外，m/z 445母离子在MS2条件下产生了m/z 269和m/z 175两个碎片(见图4)，它们可能由SFZ-47羧基衍生物的酯型β-D-葡糖苷酸的糖苷键裂解形成.进一步对该两碎片离子做MS3级质谱分析，发现m/z 269继续裂解成m/z 120和m/z 148两个碎片(见图5)，而m/z 175则脱去CO2和H2O，生成m/z 113(见图6).由图3和图5质谱的的相似性证实，图4中的质谱峰m/z 269为结合型代谢物中的SFZ-47羧基衍生物部分，m/z 175则为结合物中的葡糖苷酸脱水形成的碎片.相应的碎片断裂过程如图7所示.
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以上LC/MS实验结果进一步确证了代谢物M1和M2的结构，说明家兔口服SFZ-47后在体内的主要代谢途径应为芳环上的甲基氧化成羟甲基，继续氧化成羧基，再与β-D-葡糖醛酸结合，该过程如图8所示.
图3 母离子m/z 269的(-)ESI-MS2子离子谱图
图4 母离子m/z 445的(-)ESI-MS2子离子谱图
图5 母离子m/z 445(选择碎片m/z 269)的(-)ESI-MS3子离子谱图
, 百拇医药
图6 母离子m/z 445(选择碎片m/z 175)的(-)ESI-MS3子离子谱图
图7 代谢物M2的(-)ESI-MS3碎片断裂过程
图8 SFZ-47在家兔体内的主要代谢途径
3 讨论
目前，LC/MS常用的离子源有APCI和ESI两种，这两种电离方式都是软电离，其中APCI比较适合于中性或极性小的化合物的分析，而ESI则更适合于极性大、对热不稳定的酸性或碱性化合物的分析〔7，8〕.根据SFZ-47代谢物的特点，本文选择了ESI源对代谢物进行分析.
, 百拇医药
利用ESI/MSn离子阱技术可在温和的条件下获得待测物的准分子离子峰，由于本试验采用的是负离子方式，故准分子离子峰应为(M-1).在分析过程中选定母离子后，逐步提高相对碰撞能量(relative collision energy)，即可使母离子的丰度降低，而碎片离子的丰度相应提高，从而直接给出母离子与碎片离子的关系.目前，利用LCQ仪器的MSn离子阱技术最多可以进行MS10级选定母离子与碎片离子之间关系的分析，而对一般未知物结构剖析进行MS3测试就足够了.
代谢过程中药物与β-D-葡糖醛酸的结合反应是药物自体内消除的重要途径，以往采用酶水解的方法对此类结合物进行间接定性.本文通过分析MS-MS2-MS3各级离子碎片的关系，对SFZ-47羧基衍生物的酯型β-D-葡糖苷酸结合物进行了直接定性.结果发现，在负离子检测方式下，MS2级质谱中m/z 175(母离子为445)和MS3级质谱中m/z 113(母离子为m/z 175)对葡糖醛酸结合物的鉴定具有专属性，它对于确证该类代谢物可能具有普遍意义.
, 百拇医药
在鉴定本文的两个代谢物时，曾试用正离子方式检测，发现它们易形成[M+H]+、[M+Na]+或[M+2Na]+等准分子离子，且背景干扰较强；而选用负离子方式检测则背景干扰小，形成的[M-H]-准分子离子易于跟踪，灵敏度亦未降低.推测其原因，可能是由于待测物分子中含羧基所致.故本文选用负离子检测，对含羧基的代谢物M1和M2均获得了良好的分析结果.
作者单位：
参考文献
[1] 宋振玉主编.药物代谢研究——意义、方法、应用.北京：人民卫生出版社，1990.206～231
[2] Poon GK,Vigushin D,Griggs LJ,et al.Identification and characterization of limonene metabolites in patients with advanced cancer by liquid chromatography/mass spectrometry.Drug Metab Dispos,1996,24:565～571
, http://www.100md.com
[3] Luffer-Atlas D,Vincent SH,Painter SK,et al.Identificaton and characterization of metabolites of L-694，458 by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Drug Metab Dispos,1997,25:940～952
[4] Doerge DR,Churchwell MI,Holder CL,et al.Detection and confirmation of β-agonists in bovine retina using LC/APCI-MS.Anal Chem，1996，68：1918～1923
[5] 张守芳，高文芳，伍湘瑾，等.新氨基吡咯里嗪酮类化合物.中国专利，11004642A.1995-07-05
, 百拇医药 [6] 钟大放，顾景凯，陈仁弟，等.3H-1，2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮在家兔体内主要代谢产物的研究.药学学报，1996，31：855～860
[7] Smith RD,Loo JA,Edmonds CG,et al.New developments in biochemical mass spectrometry:electrospray ionization.Anal Chem,1990,62:882～899
[8] Ikonomou MG,Blades AT,Kebarle P.Electrospray-ion spray:a comparison of mechanisms and performance.Anal Chem,1991,63:1993～1998
收稿日期:1998-06-24, http://www.100md.com
单位：钟大放 姜浩 沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015；顾景凯 周慧 吉林大学分子生物学系，长春 130023
关键词：3H-1，2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮(SFZ-47)；电喷雾；离子阱质谱；代谢物；4-(3H-1，2-二氢-1-吡咯里嗪酮-2-甲基胺基)苯甲酸；β-D-葡糖苷酸结合物
沈阳药科大学学报990101 摘 要 以HPLC对家兔单剂量口服100 mg新抗炎镇痛剂SFZ-47[3H-1，2二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮]后尿中的两主要代谢物进行了分离、制备，再用电喷雾离子阱质谱法对代谢物分别进行结构鉴定.结果表明，采用负离子ESI-MS3检测方式，对代谢物SFZ-47羧基衍生物[4-(3H-1，2-二氢-1-吡咯里嗪酮-2-甲基胺基)苯甲酸]及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物可获得分子结构的丰富信息.
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分类号 R914.1
Identification of Two Major Metabolites of 3H-1，2-Dihydro-2-(4-methyl-phenylamino)methyl-1-pyrrolizinone in Rabbits Using Electrospray Ion Trap Mass Spectrometry
Zhong Dafang,Gu Jingkai,Jiang Hao,Zhou Hui
Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract Two major metabolites of a 100 mg oral dose of SFZ-47[3H-1，2-dihydro-2-(4-methylphenylamino)methyl-1-pyrrolizinone],a new anti-inflammatory and analgesic agent,in rabbit urine were separated and prepared with the high-performance liquid chromatography,and then the structures of the metabolites were identified by the use of the electrospray ion trap mass spectrometry.It was demonstrated that the structures of the two major metabolites of SFZ-47 in rabbits,the carboxylic derivative of SFZ-47[4-(3H-1,2-dihydro-1-pyrrolizinone-2-methylamino)benzoic acid]and its acyl β-D-glucuronide were well characterized with the (-)ESI-MS3 ion trap mass spectrometry.
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Key words 3H-1,2-dihydro-2-(4-methylphenylamino)methyl-1-pyrrolizinone(SFZ-47);electrospray;ion trap mass spectrometry;metabolite;4-(3H-1,2-dihydro-1-pyrrolizinone-2-methyl-amino)benzoic acid;β-D-glucuronide
药物代谢研究在新药研究与开发过程中具有重要意义〔1〕，目前对药物代谢产物的研究通常采用GC/MS获得代谢物的结构信息，再合成相应的标准物质予以确证，但是GC/MS无法对极性大或热不稳定的代谢物进行分析.近年来，随着LC/MS联用接口技术的突破，使得这些物质的分析成为现实〔2～4〕.
SFZ-47[3H-1,2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮]是沈阳药科大学张守芳教授等合成的具有抗炎镇痛活性的新化合物〔5〕，其在家兔尿中的两个代谢物遇热不稳定且其中一结合型代谢物极性较大，前文已用HPLC对照物合成和酶水解等间接法对它们进行了研究〔6〕，初步认定它们分别是SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物.本文用(-)ESI-MSn离子阱新技术对两代谢物进行了直接定性分析，进一步确证了它们的结构，并对LC/MS鉴定结合型代谢物进行了初步尝试.
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1 仪器与方法
1.1 高效液相色谱仪
日本岛津公司LC-10A高效液相色谱仪，包括LC-10AD泵，7175 Rheodyne进样阀，SPD-10A紫外检测器，CBM-10A色谱工作站.
1.2 质谱仪
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，包括APCI(大气压化学电离)、ESI(电喷雾电离)源以及LCQ数据处理系统，并配有直接进样用注射泵和250 μL进样器.
1.3 代谢物分离与制备
按前文已报道的方法给家兔服药并采集尿样〔6〕，然后以相同的色谱条件分离尿样，分别收集由色谱检测器流出的两个代谢物组分，再将收集的组分浓缩至一半体积，置-20℃冰箱保存.
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1.4 质谱仪的分析条件
离子源电压：5 kV;离子源电流：25 μA;壳气(N2)流速：46单位；毛细管电压：-3 V；毛细管温度：150℃；注射泵进样速度：8 μL/min.
1.5 待测物的ESI-MSn分析方法
分别取分离制备的SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物样品，融化后用重蒸馏甲醇稀释至浓度约为1 mg/L，用注射泵将其直接导入ESI离子源.测定时选择负离子方式检测，先用全扫描一级质谱方式获得待测物的准分子离子峰(M-H)-，然后利用ESI-MSn离子阱技术对准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级质谱分析，获得相应的子离子质谱图.
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图1 代谢物M1 (-)ESI-MS全扫描谱图 图2 代谢物M2的(-)ESI-MS全扫描谱图
2 结果
在全扫描一级质谱条件下，分别获得了两个代谢物M1和M2的准分子离子峰m/z 269和m/z 445，如图1和图2所示.根据前文的结果〔6〕，它们分别是SFZ-47羧基衍生物及其酯型β-D-葡糖苷酸结合物对应的M-1峰.为进一步了解两代谢物的质谱断裂规律，本文采用MSn离子阱技术对m/z 269和m/z 445两母离子进行了MS2级质谱分析，结果发现m/z 269母离子裂解成m/z 120和m/z 148两个碎片峰(见图3)，它们的裂解发生在与吡里酮母核相联的碳-碳键.此外，m/z 445母离子在MS2条件下产生了m/z 269和m/z 175两个碎片(见图4)，它们可能由SFZ-47羧基衍生物的酯型β-D-葡糖苷酸的糖苷键裂解形成.进一步对该两碎片离子做MS3级质谱分析，发现m/z 269继续裂解成m/z 120和m/z 148两个碎片(见图5)，而m/z 175则脱去CO2和H2O，生成m/z 113(见图6).由图3和图5质谱的的相似性证实，图4中的质谱峰m/z 269为结合型代谢物中的SFZ-47羧基衍生物部分，m/z 175则为结合物中的葡糖苷酸脱水形成的碎片.相应的碎片断裂过程如图7所示.
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以上LC/MS实验结果进一步确证了代谢物M1和M2的结构，说明家兔口服SFZ-47后在体内的主要代谢途径应为芳环上的甲基氧化成羟甲基，继续氧化成羧基，再与β-D-葡糖醛酸结合，该过程如图8所示.
图3 母离子m/z 269的(-)ESI-MS2子离子谱图
图4 母离子m/z 445的(-)ESI-MS2子离子谱图
图5 母离子m/z 445(选择碎片m/z 269)的(-)ESI-MS3子离子谱图
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图6 母离子m/z 445(选择碎片m/z 175)的(-)ESI-MS3子离子谱图
图7 代谢物M2的(-)ESI-MS3碎片断裂过程
图8 SFZ-47在家兔体内的主要代谢途径
3 讨论
目前，LC/MS常用的离子源有APCI和ESI两种，这两种电离方式都是软电离，其中APCI比较适合于中性或极性小的化合物的分析，而ESI则更适合于极性大、对热不稳定的酸性或碱性化合物的分析〔7，8〕.根据SFZ-47代谢物的特点，本文选择了ESI源对代谢物进行分析.
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利用ESI/MSn离子阱技术可在温和的条件下获得待测物的准分子离子峰，由于本试验采用的是负离子方式，故准分子离子峰应为(M-1).在分析过程中选定母离子后，逐步提高相对碰撞能量(relative collision energy)，即可使母离子的丰度降低，而碎片离子的丰度相应提高，从而直接给出母离子与碎片离子的关系.目前，利用LCQ仪器的MSn离子阱技术最多可以进行MS10级选定母离子与碎片离子之间关系的分析，而对一般未知物结构剖析进行MS3测试就足够了.
代谢过程中药物与β-D-葡糖醛酸的结合反应是药物自体内消除的重要途径，以往采用酶水解的方法对此类结合物进行间接定性.本文通过分析MS-MS2-MS3各级离子碎片的关系，对SFZ-47羧基衍生物的酯型β-D-葡糖苷酸结合物进行了直接定性.结果发现，在负离子检测方式下，MS2级质谱中m/z 175(母离子为445)和MS3级质谱中m/z 113(母离子为m/z 175)对葡糖醛酸结合物的鉴定具有专属性，它对于确证该类代谢物可能具有普遍意义.
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在鉴定本文的两个代谢物时，曾试用正离子方式检测，发现它们易形成[M+H]+、[M+Na]+或[M+2Na]+等准分子离子，且背景干扰较强；而选用负离子方式检测则背景干扰小，形成的[M-H]-准分子离子易于跟踪，灵敏度亦未降低.推测其原因，可能是由于待测物分子中含羧基所致.故本文选用负离子检测，对含羧基的代谢物M1和M2均获得了良好的分析结果.
作者单位：
参考文献
[1] 宋振玉主编.药物代谢研究——意义、方法、应用.北京：人民卫生出版社，1990.206～231
[2] Poon GK,Vigushin D,Griggs LJ,et al.Identification and characterization of limonene metabolites in patients with advanced cancer by liquid chromatography/mass spectrometry.Drug Metab Dispos,1996,24:565～571
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[3] Luffer-Atlas D,Vincent SH,Painter SK,et al.Identificaton and characterization of metabolites of L-694，458 by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Drug Metab Dispos,1997,25:940～952
[4] Doerge DR,Churchwell MI,Holder CL,et al.Detection and confirmation of β-agonists in bovine retina using LC/APCI-MS.Anal Chem，1996，68：1918～1923
[5] 张守芳，高文芳，伍湘瑾，等.新氨基吡咯里嗪酮类化合物.中国专利，11004642A.1995-07-05
, 百拇医药 [6] 钟大放，顾景凯，陈仁弟，等.3H-1，2-二氢-2-(4-甲基苯胺基)甲基-1-吡咯里嗪酮在家兔体内主要代谢产物的研究.药学学报，1996，31：855～860
[7] Smith RD,Loo JA,Edmonds CG,et al.New developments in biochemical mass spectrometry:electrospray ionization.Anal Chem,1990,62:882～899
[8] Ikonomou MG,Blades AT,Kebarle P.Electrospray-ion spray:a comparison of mechanisms and performance.Anal Chem,1991,63:1993～1998
收稿日期:1998-06-24, http://www.100md.com