激光损伤致猪视网膜色素上皮细胞中游离钙变化的实验研究
作者：何守志 王凤翔 张鲲 黄靖香 顾峥 李楠 陆庆国
单位：何守志 王凤翔 张鲲(解放军总医院眼科，北京市，100853)；黄靖香 顾峥(解放军总医院病理科，北京市，100853)；李楠 陆庆国(解放军总医院仪器中心，北京市，100853)
关键词：眼色素上皮；激光；钙
中国激光医学杂志990105摘要
目的 探讨激光照射后视网膜色素上皮(RPE)细胞中游离钙的变化规律。
方法 用不同输出功率的氩离子激光照射培养的猪RPE细胞(光斑直径200 μm，照射时间0.2 s)，用激光扫描共聚焦显微镜测量光凝斑周围RPE细胞中游离钙的浓度。
结果 用0.9、1.8及2.7 W的激光照射后，RPE细胞中游离钙浓度(nmol/L)分别为415±148、525±247、994±203，而空白对照组为222±64，各组之间差异均有非常显著意义(均为P<0.01)。
, 百拇医药
结论 激光损伤可使RPE细胞中游离钙浓度明显升高，升高程度与激光能量的大小呈正相关。
Laser-induced Intracellular Free Calcium Changes in Cultured Pig Retinal Pigment Epithelial Cells
HE Shouzhi1, WANG Fengxiang1, ZHANG Kun1, HUANG Jingxiang2, GU Zheng2, LI Nan3, LU Qingguo3
1.Department of Ophthalmology, 2.Department of Pathology, 3.Instrumental Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
, 百拇医药
ABSTRACT
Objective To investigate the changes of intracellular free calcium in cultured retinal pigment epithelial cells(RPE) induced by argon laser irradiation.
Methods After Ar+ laser irradiation using different doses(0.9 W,1.8 W,2.7 W,0.2 s, spot diameter 200 μm), the free calcium concentration in RPE cells adjacent to the laser spot was measured by laser scanning confocal microscopy.
, http://www.100md.com
Results After the 0.9 W, 1.8 W and 2.7 W Ar+ laser irradiation, the intracellular free calcium concentration in RPE cells was 415±148, 525±247 and 994±203 nmol/L, respectively, significantly higher than that of control cells, 222±64 nmol/L. There was also a significant difference between each two laser irradiated groups(P<0.01).
Conclusions A significant increase of intracellular free calcium concentration can be induced by laser irradiation, proportionally correlated with the increase of light doses.
, 百拇医药
Key words Pigment epithelium of eye; Lasers; Calcium
激光照射可使视网膜色素上皮(retinal pigmental epithelium, RPE)细胞严重受损，导致RPE细胞增殖而形成增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreo-retinopathy，PVR)[1,2]。关于激光对RPE细胞细胞膜及细胞器等超微结构的损伤已有一些初步的观察及描述[3-5]。但是激光照射后RPE细胞内各种离子的变化目前国内外尚无专门描述。我们应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术，对激光照射后RPE细胞中游离钙的变化进行了观察，现报告如下。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
1.猪眼球 取自宰杀后2～3 h的北京黑猪(北京清河第三肉联厂提供)。剪去眼球壁外围的软组织，用少量肥皂水刷洗，并用Hank's液反复冲洗，然后浸泡在含有200 μg/ml庆大霉素的Hank's液中备用。
2.主要仪器和试剂
(1)仪器 Insight plus型激光扫描共聚焦显微镜(Meridian公司)，ACAS ULTIMA 型激光扫描共聚焦显微成像仪(Meridian公司)，NOVUS-2000型氩激光发射仪(Coherent公司)。
(2)试剂 细胞培养液用RPMI 1640粉剂(美国GIBCO 实验室)配制，内含庆大霉素80 u/ml、卡那霉素1.0 mg/ml、10%小牛血清，pH值7.0～7.4。胰蛋白酶(上海东风试剂厂)用Hank's液配成0.25%的使用液。荧光探针：fluo-3/AM(Molecular Probe公司)于纯净无水的二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide，DMSO)中配成1 μg/ml贮存液，放于-20℃冰箱中保存；pluronic F-127(Molecular Probe公司)，以25%比例溶于纯净无水的DMSO中。A23187为Sigma公司产品。MnCl2*4H2O为北京化学试剂公司产品。含钙、镁的Hank's液，pH值7.4。
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二、方法
1.细胞培养 参照Stramm等[6]的方法，在无菌条件下锯齿缘靠后剖开眼球，弃去前节，将后节眼球放置在眼球托上，轻轻除去玻璃体及视网膜感觉部，后节眼杯经用Hank's液轻轻漂洗后，以0.25%胰蛋白酶消化15～20 min，分离RPE细胞，经离心、漂洗后，接种于RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2孵箱中培养。原代细胞达融合状态时，按1∶3做传代培养。将第4代传代细胞接种于96孔培养板中，每孔2×104个细胞，37℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h后，细胞贴壁生长呈单层融合状态下使用。
2.激光照射 参照Matsumoto等[7]的方法，用临床裂隙灯发射系统的蓝绿色氩激光对体外培养融合状态下的RPE细胞进行光凝，因RPE细胞色素部分脱失，故光凝时在96孔板下面放置黑纸作背景，分别以0.9、1.8、2.7 W的功率进行光凝,光斑直径200 μm,激光照射持续时间为0.2 s，每孔做20个光凝斑。空白对照组则不做光凝。
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3.fluo-3荧光着色和LSCM观察 方法同前描述[8]，即：将贮备的fluo-3用PBS稀释为25 μmol/L，加入质量浓度为2%的F-127。96孔板中每孔加样品50 μl，置37℃培养箱中保存30～40 min。着染后的样品用Hank's液洗3次，然后用LSCM观察fluo-3染色的RPE细胞正中切面的荧光图像。每份样品取紧靠光凝斑的3～5个细胞(能同时取正中切面者)作为观察对象，记录荧光强度值，然后向样品中加钙离子载体A23187，至终浓度为10 μmol/L，10 min后取其荧光最大值，然后在样品上加MnCl2至终浓度为2 mmol/L，3～5 min后取荧光最低值。按下述公式将荧光强度值转换为细胞内钙离子浓度绝对值：
[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
, http://www.100md.com
其中Kd为校正系数(Kd=450 nmol/L)，F为静息状态时的荧光强度，Fmax为加A23187后的最大荧光强度，Fmin为加MnCl2后的最低荧光强度。
4.所得结果用SAS软件处理，采用方差分析进行统计学处理。
结果
经不同功率氩激光照射的三组体外培养的猪RPE细胞，其细胞内游离钙浓度均明显高于空白对照组(均为P<0.01)，0.9 W组RPE细胞内游离钙浓度是空白对照组的近2倍，1.8 W组是空白对照组的2～3倍，2.7 W组是空白对照组的4～5倍，它们三组之间的差异经方差分析，亦均有非常显著意义(均为P<0.01)(表1)。
表1 不同能量激光损伤后体外培养猪RPE细胞内游离钙的浓度(nmol/L,
±s)
, http://www.100md.com
Tab.1 Ca2+ concentration in RPE cells after laser-induced injury with different powers (nmol/L,±s) 组别
Groups
细胞数
Samples
钙离子浓度
Ca2+ concentation
空白对照组 Control group
, 百拇医药
37
222± 64
激光照射组 Experimental groups
0.9 W
14
415±148*
1.8 W
14
525±247*
2.7 W
14
994±203*
, 百拇医药
* 与空白对照组比较，P<0.01
Compared with the control group, P<0.01
讨论
色素上皮细胞与视网膜中的感光细胞紧密相连，执行许多代谢和生化功能，如吞噬视杆和视锥细胞的外节代谢物、参与维生素A的代谢、合成酸性粘多糖、在视细胞和脉络膜细胞间转运代谢物质以及合成并代谢黑色素颗粒等。RPE细胞还参与保持感光细胞的微环境，如视网膜下空间的细胞外游离钙浓度，尤其是在光适应和暗适应的情况下，它们对于感光细胞内的游离钙离子浓度起至关重要的作用。RPE细胞内游离钙本身也是十分活跃的，它受多种因素的影响，机械性刺激、生长因子、组织胺、神经多肽等均可使RPE细胞内钙动员，胞内游离钙浓度升高[9]。本实验发现体外培养的猪RPE细胞静息状态下的游离钙浓度是222 nmol/L±64 nmol/L，而在激光损伤的情况下，胞内的钙离子浓度有明显的升高，而且升高的幅度与激光照射的剂量呈正相关。
, http://www.100md.com
钙离子在细胞功能的调节中起重要作用，除了神经传导、肌肉收缩、细胞分泌以及细胞增殖外，形态发生、细胞老化等许多细胞反应过程都受到钙离子的调节作用。细胞内游离钙因其作为第二信使而引起人们的重视，它们可能参与生长因子信号的传递，同时细胞内钙离子浓度对细胞间通讯功能有一定的调控作用。在正常生理状态下，细胞内的游离钙离子浓度能够维持很低的水平，细胞的许多功能都依赖于细胞内外存在的极高钙离子浓度差，一旦这种浓度差减低，细胞功能就要受到损伤，甚至引起死亡[10]。多种病理状态如视网膜脱离、激光光凝损伤、视网膜冷凝等，可引起RPE细胞的增殖和RPE细胞的迁移，导致临床上的异常病变如高色素性视网膜瘢痕、增殖性玻璃体视网膜病变等。本实验应用LSCM技术和fluo-3观察到体外培养的RPE细胞受到激光照射后细胞中的游离钙浓度升高，同期的实验中我们也证实激光损伤可致细胞间通讯功能降低(另文报道)，而钙离子及细胞间通讯功能状态可调节细胞的增殖，因此研究激光损伤后细胞内游离钙浓度的变化及细胞间通讯功能的改变，有助于对RPE细胞激光损伤后发生增殖迁移机制的理解。
, 百拇医药
Kuriyama[1]用fura-2结合数字成像显微镜系统分析得出单个培养的人RPE细胞中钙离子浓度是153 nmol/L±1.5 nmol/L，并观察到多种生长因子可致细胞内钙离子浓度升高。Friedman[11]用quin-2结合荧光分光光度计测得的人RPE细胞中钙离子浓度为276 nmol/L±28 nmol/L，而本实验测得的猪RPE细胞中游离钙浓度为222 nmol/L±64 nmol/L。测量结果有所不同，可能是由于所测量的细胞种类不同及所用的测量方法不同。但在同一实验中，采用同一实验方法，所得结果是稳定的，有可比性，因此有一定的参考价值。
本课题受军队“九五”医药卫生科研基金资助(编号96M143)
参考文献
[1]Kuriyama S, Ohuchi T, Yoshimura N, et al. Growth factor-induced cytosolic calcium ion transients in cultured human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32:2882-2890.
, 百拇医药
[2]Putting BJ, Zweypfenning RC, Vrensen GF, et al. Blood-retinal barrier dysfunction at the pigment epithelium induced by blue light. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1992，33:3385-3393.
[3]Douki T, Lee S, Dorey K, et al. Stress-wave-induced injury to retinal pigment epithelium cells in vitro. Lasers Surg Med, 1996，19:249-259.
[4]Delpriore LV, Glaser BM, Quigley HA，et al. Response of pig retinal pigment epithelium to laser photocoagulation in organ culture. Arch Ophthalmol, 1989, 107:119-122.
, http://www.100md.com
[5]Pollack A, Heriot WJ, Fraco， et al. Cellular processes causing defects in Bruch's membrane following krypton laser photocoagulation. Ophthalmology, 1986，93:1113-1119.
[6]Stramm LE, Haskins ME, McGovern MM, et al. Tissue culture of cat retinal pigment epithelium. Exp Eye Res, 1983，36:91-101.
[7]Matsumoto M, Yoshimura N, Honda Y. Increased production of transforming growth factor-beta 2 from cultured human retinal pigment epithelial cells by photocoagulation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994, 35:4245-4252.
, 百拇医药
[8]王凤翔，何守志，李楠. 应用激光扫描共聚焦显微镜观察晶体上皮细胞中的游离钙. 中华眼科杂志，1997，33:297-300.
[9]Stalmans P, Himpens B. Confocal imaging of Ca2+ signaling in cultured rat retinal pigment epithelial cells during mechanical and pharmacologic stimulation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997, 38:176-187.
[10]薛沿宁，周廷冲. Ca2+ 与细胞功能的调节. 生理科学进展，1988，19:328-333.
[11]Friedman Z，Hackett SF，Campochiaro PA. Human pigment retinal epithelial cells possess muscarinic receptors coupled to calcium mobilization. Brain Res，1988,446:11-16.
(收稿日期：1998-01-12), 百拇医药
单位：何守志 王凤翔 张鲲(解放军总医院眼科，北京市，100853)；黄靖香 顾峥(解放军总医院病理科，北京市，100853)；李楠 陆庆国(解放军总医院仪器中心，北京市，100853)
关键词：眼色素上皮；激光；钙
中国激光医学杂志990105摘要
目的 探讨激光照射后视网膜色素上皮(RPE)细胞中游离钙的变化规律。
方法 用不同输出功率的氩离子激光照射培养的猪RPE细胞(光斑直径200 μm，照射时间0.2 s)，用激光扫描共聚焦显微镜测量光凝斑周围RPE细胞中游离钙的浓度。
结果 用0.9、1.8及2.7 W的激光照射后，RPE细胞中游离钙浓度(nmol/L)分别为415±148、525±247、994±203，而空白对照组为222±64，各组之间差异均有非常显著意义(均为P<0.01)。
, 百拇医药
结论 激光损伤可使RPE细胞中游离钙浓度明显升高，升高程度与激光能量的大小呈正相关。
Laser-induced Intracellular Free Calcium Changes in Cultured Pig Retinal Pigment Epithelial Cells
HE Shouzhi1, WANG Fengxiang1, ZHANG Kun1, HUANG Jingxiang2, GU Zheng2, LI Nan3, LU Qingguo3
1.Department of Ophthalmology, 2.Department of Pathology, 3.Instrumental Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
, 百拇医药
ABSTRACT
Objective To investigate the changes of intracellular free calcium in cultured retinal pigment epithelial cells(RPE) induced by argon laser irradiation.
Methods After Ar+ laser irradiation using different doses(0.9 W,1.8 W,2.7 W,0.2 s, spot diameter 200 μm), the free calcium concentration in RPE cells adjacent to the laser spot was measured by laser scanning confocal microscopy.
, http://www.100md.com
Results After the 0.9 W, 1.8 W and 2.7 W Ar+ laser irradiation, the intracellular free calcium concentration in RPE cells was 415±148, 525±247 and 994±203 nmol/L, respectively, significantly higher than that of control cells, 222±64 nmol/L. There was also a significant difference between each two laser irradiated groups(P<0.01).
Conclusions A significant increase of intracellular free calcium concentration can be induced by laser irradiation, proportionally correlated with the increase of light doses.
, 百拇医药
Key words Pigment epithelium of eye; Lasers; Calcium
激光照射可使视网膜色素上皮(retinal pigmental epithelium, RPE)细胞严重受损，导致RPE细胞增殖而形成增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreo-retinopathy，PVR)[1,2]。关于激光对RPE细胞细胞膜及细胞器等超微结构的损伤已有一些初步的观察及描述[3-5]。但是激光照射后RPE细胞内各种离子的变化目前国内外尚无专门描述。我们应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)技术，对激光照射后RPE细胞中游离钙的变化进行了观察，现报告如下。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
1.猪眼球 取自宰杀后2～3 h的北京黑猪(北京清河第三肉联厂提供)。剪去眼球壁外围的软组织，用少量肥皂水刷洗，并用Hank's液反复冲洗，然后浸泡在含有200 μg/ml庆大霉素的Hank's液中备用。
2.主要仪器和试剂
(1)仪器 Insight plus型激光扫描共聚焦显微镜(Meridian公司)，ACAS ULTIMA 型激光扫描共聚焦显微成像仪(Meridian公司)，NOVUS-2000型氩激光发射仪(Coherent公司)。
(2)试剂 细胞培养液用RPMI 1640粉剂(美国GIBCO 实验室)配制，内含庆大霉素80 u/ml、卡那霉素1.0 mg/ml、10%小牛血清，pH值7.0～7.4。胰蛋白酶(上海东风试剂厂)用Hank's液配成0.25%的使用液。荧光探针：fluo-3/AM(Molecular Probe公司)于纯净无水的二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide，DMSO)中配成1 μg/ml贮存液，放于-20℃冰箱中保存；pluronic F-127(Molecular Probe公司)，以25%比例溶于纯净无水的DMSO中。A23187为Sigma公司产品。MnCl2*4H2O为北京化学试剂公司产品。含钙、镁的Hank's液，pH值7.4。
, http://www.100md.com
二、方法
1.细胞培养 参照Stramm等[6]的方法，在无菌条件下锯齿缘靠后剖开眼球，弃去前节，将后节眼球放置在眼球托上，轻轻除去玻璃体及视网膜感觉部，后节眼杯经用Hank's液轻轻漂洗后，以0.25%胰蛋白酶消化15～20 min，分离RPE细胞，经离心、漂洗后，接种于RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2孵箱中培养。原代细胞达融合状态时，按1∶3做传代培养。将第4代传代细胞接种于96孔培养板中，每孔2×104个细胞，37℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h后，细胞贴壁生长呈单层融合状态下使用。
2.激光照射 参照Matsumoto等[7]的方法，用临床裂隙灯发射系统的蓝绿色氩激光对体外培养融合状态下的RPE细胞进行光凝，因RPE细胞色素部分脱失，故光凝时在96孔板下面放置黑纸作背景，分别以0.9、1.8、2.7 W的功率进行光凝,光斑直径200 μm,激光照射持续时间为0.2 s，每孔做20个光凝斑。空白对照组则不做光凝。
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3.fluo-3荧光着色和LSCM观察 方法同前描述[8]，即：将贮备的fluo-3用PBS稀释为25 μmol/L，加入质量浓度为2%的F-127。96孔板中每孔加样品50 μl，置37℃培养箱中保存30～40 min。着染后的样品用Hank's液洗3次，然后用LSCM观察fluo-3染色的RPE细胞正中切面的荧光图像。每份样品取紧靠光凝斑的3～5个细胞(能同时取正中切面者)作为观察对象，记录荧光强度值，然后向样品中加钙离子载体A23187，至终浓度为10 μmol/L，10 min后取其荧光最大值，然后在样品上加MnCl2至终浓度为2 mmol/L，3～5 min后取荧光最低值。按下述公式将荧光强度值转换为细胞内钙离子浓度绝对值：
[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
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其中Kd为校正系数(Kd=450 nmol/L)，F为静息状态时的荧光强度，Fmax为加A23187后的最大荧光强度，Fmin为加MnCl2后的最低荧光强度。
4.所得结果用SAS软件处理，采用方差分析进行统计学处理。
结果
经不同功率氩激光照射的三组体外培养的猪RPE细胞，其细胞内游离钙浓度均明显高于空白对照组(均为P<0.01)，0.9 W组RPE细胞内游离钙浓度是空白对照组的近2倍，1.8 W组是空白对照组的2～3倍，2.7 W组是空白对照组的4～5倍，它们三组之间的差异经方差分析，亦均有非常显著意义(均为P<0.01)(表1)。
表1 不同能量激光损伤后体外培养猪RPE细胞内游离钙的浓度(nmol/L,
±s), http://www.100md.com
Tab.1 Ca2+ concentration in RPE cells after laser-induced injury with different powers (nmol/L,
±s) 组别Groups
细胞数
Samples
钙离子浓度
Ca2+ concentation
空白对照组 Control group
, 百拇医药
37
222± 64
激光照射组 Experimental groups
0.9 W
14
415±148*
1.8 W
14
525±247*
2.7 W
14
994±203*
, 百拇医药
* 与空白对照组比较，P<0.01
Compared with the control group, P<0.01
讨论
色素上皮细胞与视网膜中的感光细胞紧密相连，执行许多代谢和生化功能，如吞噬视杆和视锥细胞的外节代谢物、参与维生素A的代谢、合成酸性粘多糖、在视细胞和脉络膜细胞间转运代谢物质以及合成并代谢黑色素颗粒等。RPE细胞还参与保持感光细胞的微环境，如视网膜下空间的细胞外游离钙浓度，尤其是在光适应和暗适应的情况下，它们对于感光细胞内的游离钙离子浓度起至关重要的作用。RPE细胞内游离钙本身也是十分活跃的，它受多种因素的影响，机械性刺激、生长因子、组织胺、神经多肽等均可使RPE细胞内钙动员，胞内游离钙浓度升高[9]。本实验发现体外培养的猪RPE细胞静息状态下的游离钙浓度是222 nmol/L±64 nmol/L，而在激光损伤的情况下，胞内的钙离子浓度有明显的升高，而且升高的幅度与激光照射的剂量呈正相关。
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钙离子在细胞功能的调节中起重要作用，除了神经传导、肌肉收缩、细胞分泌以及细胞增殖外，形态发生、细胞老化等许多细胞反应过程都受到钙离子的调节作用。细胞内游离钙因其作为第二信使而引起人们的重视，它们可能参与生长因子信号的传递，同时细胞内钙离子浓度对细胞间通讯功能有一定的调控作用。在正常生理状态下，细胞内的游离钙离子浓度能够维持很低的水平，细胞的许多功能都依赖于细胞内外存在的极高钙离子浓度差，一旦这种浓度差减低，细胞功能就要受到损伤，甚至引起死亡[10]。多种病理状态如视网膜脱离、激光光凝损伤、视网膜冷凝等，可引起RPE细胞的增殖和RPE细胞的迁移，导致临床上的异常病变如高色素性视网膜瘢痕、增殖性玻璃体视网膜病变等。本实验应用LSCM技术和fluo-3观察到体外培养的RPE细胞受到激光照射后细胞中的游离钙浓度升高，同期的实验中我们也证实激光损伤可致细胞间通讯功能降低(另文报道)，而钙离子及细胞间通讯功能状态可调节细胞的增殖，因此研究激光损伤后细胞内游离钙浓度的变化及细胞间通讯功能的改变，有助于对RPE细胞激光损伤后发生增殖迁移机制的理解。
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Kuriyama[1]用fura-2结合数字成像显微镜系统分析得出单个培养的人RPE细胞中钙离子浓度是153 nmol/L±1.5 nmol/L，并观察到多种生长因子可致细胞内钙离子浓度升高。Friedman[11]用quin-2结合荧光分光光度计测得的人RPE细胞中钙离子浓度为276 nmol/L±28 nmol/L，而本实验测得的猪RPE细胞中游离钙浓度为222 nmol/L±64 nmol/L。测量结果有所不同，可能是由于所测量的细胞种类不同及所用的测量方法不同。但在同一实验中，采用同一实验方法，所得结果是稳定的，有可比性，因此有一定的参考价值。
本课题受军队“九五”医药卫生科研基金资助(编号96M143)
参考文献
[1]Kuriyama S, Ohuchi T, Yoshimura N, et al. Growth factor-induced cytosolic calcium ion transients in cultured human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32:2882-2890.
, 百拇医药
[2]Putting BJ, Zweypfenning RC, Vrensen GF, et al. Blood-retinal barrier dysfunction at the pigment epithelium induced by blue light. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1992，33:3385-3393.
[3]Douki T, Lee S, Dorey K, et al. Stress-wave-induced injury to retinal pigment epithelium cells in vitro. Lasers Surg Med, 1996，19:249-259.
[4]Delpriore LV, Glaser BM, Quigley HA，et al. Response of pig retinal pigment epithelium to laser photocoagulation in organ culture. Arch Ophthalmol, 1989, 107:119-122.
, http://www.100md.com
[5]Pollack A, Heriot WJ, Fraco， et al. Cellular processes causing defects in Bruch's membrane following krypton laser photocoagulation. Ophthalmology, 1986，93:1113-1119.
[6]Stramm LE, Haskins ME, McGovern MM, et al. Tissue culture of cat retinal pigment epithelium. Exp Eye Res, 1983，36:91-101.
[7]Matsumoto M, Yoshimura N, Honda Y. Increased production of transforming growth factor-beta 2 from cultured human retinal pigment epithelial cells by photocoagulation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994, 35:4245-4252.
, 百拇医药
[8]王凤翔，何守志，李楠. 应用激光扫描共聚焦显微镜观察晶体上皮细胞中的游离钙. 中华眼科杂志，1997，33:297-300.
[9]Stalmans P, Himpens B. Confocal imaging of Ca2+ signaling in cultured rat retinal pigment epithelial cells during mechanical and pharmacologic stimulation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997, 38:176-187.
[10]薛沿宁，周廷冲. Ca2+ 与细胞功能的调节. 生理科学进展，1988，19:328-333.
[11]Friedman Z，Hackett SF，Campochiaro PA. Human pigment retinal epithelial cells possess muscarinic receptors coupled to calcium mobilization. Brain Res，1988,446:11-16.
(收稿日期：1998-01-12), 百拇医药