微波湿法消解大鼠肝脏的最佳条件探索
作者：钟鸣文 计时华 黄幸纾 黄庭国 张和清 张德坤
单位：钟鸣文 计时华 黄幸纾 (浙江医科大学公共卫生学院 杭州 310031)； 黄庭国 张和清 张德坤 (上海新科微波技术应用研究所)
关键词：
卫生毒理学杂志990121 近年来，人们对微量元素的认识产生了飞跃，不仅确知微量元素与生物体所需的其它营养素之间有协同作用关系，而且微量元素的缺乏与过量都可导致疾病[1]，影响健康。要准确测定样品中的微量元素，关键之一是样品的消解。采用干式或湿式消解，因其为间接、不均匀、敞开式加热，不仅费时费电还容易损失易挥发元素，带进干扰，且不易消解完全。采用微波消解，由于微波辐射引起的内加热和吸收极化作用及所达到的较高温度和压力，使消解速度大大加快，消解效率大大提高，并减少了氧化剂用量[2]。采用密闭溶样罐进行微波湿法消解，在“生物样品的微波湿法消解研究”[3]的基础上，进一步研究了微波消解肝组织的最佳条件，着重讨论了各消解条件的经验和理论选择依据。
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材料与方法
1.仪器：MK-1型光纤压力自控微波溶样系统(上海新科微波技术应用研究所)；60ml聚四氟乙烯溶样杯(上海新科微波技术应用研究所)。
2.试剂：硝酸(A.R)；过氧化氢(A.R)。
3.样品：大鼠肝脏。
4.方法：按仪器说明书调整仪器后开机待用。取适量(约1.0g)肝脏于溶样杯内，依次加入适量硝酸、过氧化氢后，将溶样杯放入可控密闭溶样罐，再置入微波炉内，从1档至4档(0.5MPa,1.0MPa,1.5MPa,2.0MPa)定时梯度加压消解。然后取出溶样罐，冷却至室温，开罐，观察消解情况。以消解物全溶，消解液无色澄清为消解完全。
结果与讨论
1.消解大鼠肝脏(1.0g～13.0g)最佳消解条件(见表1)。
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表1 消解1.0g～13.0g大鼠鼠肝的最佳消解条件 序贯样
品量(g)
序贯试剂量(ml)
梯度加压
总时间(分)
效果
HNO3
H2O2
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*梯度加压时间：1档 5min；2档 2min，3档 2min，4档 2min。
**梯度加压时间：1档 5min，2档 2min，3档 3min，4档 5min。
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2.消解体系的选择：
消解肝脏的消化体系主要有硝酸，硝酸-硫酸，硝酸-过氧化氢[4～6]。实验表明，仅用硝酸，不仅所需试剂量多，且不易消解完全；硝酸-硫酸虽然对脂肪的消解效果好，但残余的硫酸及二氧化硫难以去除干净，干扰后续测定；而适宜比例的硝酸-过氧化氢作为微波消解样品的消解体系，不仅消化时间短，效果好，而且减少试剂用量及带入的干扰。因此，选择硝酸-过氧化氢作为消解体系。
3.硝酸、过氧化氢加入时机及加入量的选择：
对消解时反应较剧烈的样品一般采用分步加硝酸、过氧化氢以达到消解安全、完全；作者实验所用鼠肝，由于脂肪含量少，取样量又适中，消解反应较为平缓。为使操作简单，节省时间，可以同时加入硝酸和过氧化氢来进行消解。氧化剂的加入量及比例直接影响消解效果，以1.0g鼠肝为消解对象，分别一次性加入不同配比及总量的硝酸、过氧化氢，其消解效果有一定差异，见表2。从中可见，加入3ml硝酸和2ml过氧化氢时消解效果最好。同时由于硝酸用量少，试剂带入污染也小，以此用量和配比的氧化剂消解1.0g鼠肝，获得满意结果。
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表2 梯度加压条件下，一次性加入不同配比的HNO3、H2O2时，1.0g鼠肝的消解效果 序号
加试剂量(ml)
消解时间(分)
消解效果
HNO3
H2O2
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6
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4.压力的选择：
以硝酸-过氧化氢作为消解体系的微波密闭消解，一方面，通过微波对样品与酸的即时深层加热作用及对极性分子的极化使其产生高速振荡从而获得高能量的作用，使反应体系温度瞬时提高。从热力学的角度看，反应温度提高，不仅提供了反应分子活化所需能量，使某些在常温下反应活化能较高的反应得以发生，而且消解反应均为吸热反应，从而促使反应平衡正向移动；从动力学的角度看，反应温度提高加快了反应速率。如果反应进行得太快太激烈，又可能导致泄漏或爆炸。因此，在微波密闭消解的过程中，要根据反应活化能、反应平衡及反应速率，针对不同的反应及不同的反应阶段控制反应温度。以大鼠肝脏为例，当样品量未达到10.0g时，采用1档5分，2档2分，3档2分，4档2分的梯度加压程序；当样品量超过10.0g时，采用1档5分，2档2分，3档3分，4档5分的梯度加压程序，使样品消解完全。
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5.样品量及消解氧化剂量的选择：
微波消解样品的量受溶样杯体积的限制，若一次取样量过大，会因溶样杯内容物过多，以致反应时发生泄漏，导致溶样失败。但在实际工作中，常因样品中待测元素含量低而不得不加大取样量以保证获得准确结果。为此，采用贯序消解法消解样品，以1.0g样品为一消解单位，往上一次消解液中投入一消解单位的样品，补充适量试剂，继续消解。如此循环往复，直至达到预期要求。比如：以3ml硝酸加2ml过氧化氢消解初始样品，续后消解时，硝酸量由每消解1.0g为2ml始，适当台阶式跳跃增加，而过氧化氢保持每消解1.0g样品为1ml。硝酸所需量之所以增加，本文作者认为是由于后次新加入的硝酸被溶样杯内消化残液所稀释，而降低了氧化性，故经过数次消解后需适量增加硝酸，以保持一定的浓度和一定的氧化性；而过氧化氢之所以保持恒定，则是由于1ml过氧化氢分解提供的高能态活性氧(与浓度无关)已足以与硝酸共同作用破坏样品中的有机物，使消解顺利完成，同时每次加入量保持恒定，对实验者而言，操作比较方便。
, 百拇医药
6.工作的意义：
自1975年Koirtyoham首次报道利用微波加热技术消解样品以来，已有很多学者在此领域作了大量应用研究，但大都是从经验上得出的高温高压下某些有限量样品(小于1.0g)的微波消解数据，近十几年的国内外文献未报道微波消解样品时一次消解量达不到检测限的问题，也未从反应热力学角度探讨微波消解样品的内在规律可循性。我们不仅给出了利用国产微波溶样系统(上海新科微波技术应用研究所的光纤压力自控微波溶样系统)高温高压下消解较多量(1.0g～13.0g)鼠肝样品的基本数据和条件选择依据，为推广应用该型微波溶样系统于其它样品提供了有参考价值的方法与参数，而且从反应活化能、反应速率等化学反应热力学和动力学的角度初步探讨了微波消解样品的原理、消解条件(温度、压力、样品量、氧化剂等)与样品和酸的消解特性之间的相互关系，为克服在探知新样品微波消解条件时的盲目性，进一步研究微波消解的化学反应热力学和动力学规律，作了有益的尝试。
参考文献
, 百拇医药
1.朱莲珍主校译.人和动物的微量元素营养.第1版，青岛出版社，1994，1～18
2.徐文国，邹彩珠.微波加热技术在重量分析法中的应用.分析化学，1992；20(11)：1291～1293
3.钟鸣文，计时华，等.生物样品的微波湿法消解研究.浙江医科大学学报，1997.
4.Raghunadha R.Rao and Amares Chatt Microwave Acid Digestion and Precontraction Neutron Activation Analysis of Biological and Diet Samples for Iodine Anal.Chem，1991,63:1298～1303.
5.徐立强，等.微波高压消化法在试样分解中应用.理化检验(化学分册)，1988，24(5)：278.
6.徐立强，等.食品的微波消化及其元素的ICP-AES测定.痕量分析，1988，2：28.
(修回日期 1997年12月), 百拇医药
单位：钟鸣文 计时华 黄幸纾 (浙江医科大学公共卫生学院 杭州 310031)； 黄庭国 张和清 张德坤 (上海新科微波技术应用研究所)
关键词：
卫生毒理学杂志990121 近年来，人们对微量元素的认识产生了飞跃，不仅确知微量元素与生物体所需的其它营养素之间有协同作用关系，而且微量元素的缺乏与过量都可导致疾病[1]，影响健康。要准确测定样品中的微量元素，关键之一是样品的消解。采用干式或湿式消解，因其为间接、不均匀、敞开式加热，不仅费时费电还容易损失易挥发元素，带进干扰，且不易消解完全。采用微波消解，由于微波辐射引起的内加热和吸收极化作用及所达到的较高温度和压力，使消解速度大大加快，消解效率大大提高，并减少了氧化剂用量[2]。采用密闭溶样罐进行微波湿法消解，在“生物样品的微波湿法消解研究”[3]的基础上，进一步研究了微波消解肝组织的最佳条件，着重讨论了各消解条件的经验和理论选择依据。
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材料与方法
1.仪器：MK-1型光纤压力自控微波溶样系统(上海新科微波技术应用研究所)；60ml聚四氟乙烯溶样杯(上海新科微波技术应用研究所)。
2.试剂：硝酸(A.R)；过氧化氢(A.R)。
3.样品：大鼠肝脏。
4.方法：按仪器说明书调整仪器后开机待用。取适量(约1.0g)肝脏于溶样杯内，依次加入适量硝酸、过氧化氢后，将溶样杯放入可控密闭溶样罐，再置入微波炉内，从1档至4档(0.5MPa,1.0MPa,1.5MPa,2.0MPa)定时梯度加压消解。然后取出溶样罐，冷却至室温，开罐，观察消解情况。以消解物全溶，消解液无色澄清为消解完全。
结果与讨论
1.消解大鼠肝脏(1.0g～13.0g)最佳消解条件(见表1)。
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表1 消解1.0g～13.0g大鼠鼠肝的最佳消解条件 序贯样
品量(g)
序贯试剂量(ml)
梯度加压
总时间(分)
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**梯度加压时间：1档 5min，2档 2min，3档 3min，4档 5min。
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2.消解体系的选择：
消解肝脏的消化体系主要有硝酸，硝酸-硫酸，硝酸-过氧化氢[4～6]。实验表明，仅用硝酸，不仅所需试剂量多，且不易消解完全；硝酸-硫酸虽然对脂肪的消解效果好，但残余的硫酸及二氧化硫难以去除干净，干扰后续测定；而适宜比例的硝酸-过氧化氢作为微波消解样品的消解体系，不仅消化时间短，效果好，而且减少试剂用量及带入的干扰。因此，选择硝酸-过氧化氢作为消解体系。
3.硝酸、过氧化氢加入时机及加入量的选择：
对消解时反应较剧烈的样品一般采用分步加硝酸、过氧化氢以达到消解安全、完全；作者实验所用鼠肝，由于脂肪含量少，取样量又适中，消解反应较为平缓。为使操作简单，节省时间，可以同时加入硝酸和过氧化氢来进行消解。氧化剂的加入量及比例直接影响消解效果，以1.0g鼠肝为消解对象，分别一次性加入不同配比及总量的硝酸、过氧化氢，其消解效果有一定差异，见表2。从中可见，加入3ml硝酸和2ml过氧化氢时消解效果最好。同时由于硝酸用量少，试剂带入污染也小，以此用量和配比的氧化剂消解1.0g鼠肝，获得满意结果。
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表2 梯度加压条件下，一次性加入不同配比的HNO3、H2O2时，1.0g鼠肝的消解效果 序号
加试剂量(ml)
消解时间(分)
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HNO3
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4.压力的选择：
以硝酸-过氧化氢作为消解体系的微波密闭消解，一方面，通过微波对样品与酸的即时深层加热作用及对极性分子的极化使其产生高速振荡从而获得高能量的作用，使反应体系温度瞬时提高。从热力学的角度看，反应温度提高，不仅提供了反应分子活化所需能量，使某些在常温下反应活化能较高的反应得以发生，而且消解反应均为吸热反应，从而促使反应平衡正向移动；从动力学的角度看，反应温度提高加快了反应速率。如果反应进行得太快太激烈，又可能导致泄漏或爆炸。因此，在微波密闭消解的过程中，要根据反应活化能、反应平衡及反应速率，针对不同的反应及不同的反应阶段控制反应温度。以大鼠肝脏为例，当样品量未达到10.0g时，采用1档5分，2档2分，3档2分，4档2分的梯度加压程序；当样品量超过10.0g时，采用1档5分，2档2分，3档3分，4档5分的梯度加压程序，使样品消解完全。
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5.样品量及消解氧化剂量的选择：
微波消解样品的量受溶样杯体积的限制，若一次取样量过大，会因溶样杯内容物过多，以致反应时发生泄漏，导致溶样失败。但在实际工作中，常因样品中待测元素含量低而不得不加大取样量以保证获得准确结果。为此，采用贯序消解法消解样品，以1.0g样品为一消解单位，往上一次消解液中投入一消解单位的样品，补充适量试剂，继续消解。如此循环往复，直至达到预期要求。比如：以3ml硝酸加2ml过氧化氢消解初始样品，续后消解时，硝酸量由每消解1.0g为2ml始，适当台阶式跳跃增加，而过氧化氢保持每消解1.0g样品为1ml。硝酸所需量之所以增加，本文作者认为是由于后次新加入的硝酸被溶样杯内消化残液所稀释，而降低了氧化性，故经过数次消解后需适量增加硝酸，以保持一定的浓度和一定的氧化性；而过氧化氢之所以保持恒定，则是由于1ml过氧化氢分解提供的高能态活性氧(与浓度无关)已足以与硝酸共同作用破坏样品中的有机物，使消解顺利完成，同时每次加入量保持恒定，对实验者而言，操作比较方便。
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自1975年Koirtyoham首次报道利用微波加热技术消解样品以来，已有很多学者在此领域作了大量应用研究，但大都是从经验上得出的高温高压下某些有限量样品(小于1.0g)的微波消解数据，近十几年的国内外文献未报道微波消解样品时一次消解量达不到检测限的问题，也未从反应热力学角度探讨微波消解样品的内在规律可循性。我们不仅给出了利用国产微波溶样系统(上海新科微波技术应用研究所的光纤压力自控微波溶样系统)高温高压下消解较多量(1.0g～13.0g)鼠肝样品的基本数据和条件选择依据，为推广应用该型微波溶样系统于其它样品提供了有参考价值的方法与参数，而且从反应活化能、反应速率等化学反应热力学和动力学的角度初步探讨了微波消解样品的原理、消解条件(温度、压力、样品量、氧化剂等)与样品和酸的消解特性之间的相互关系，为克服在探知新样品微波消解条件时的盲目性，进一步研究微波消解的化学反应热力学和动力学规律，作了有益的尝试。
参考文献
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1.朱莲珍主校译.人和动物的微量元素营养.第1版，青岛出版社，1994，1～18
2.徐文国，邹彩珠.微波加热技术在重量分析法中的应用.分析化学，1992；20(11)：1291～1293
3.钟鸣文，计时华，等.生物样品的微波湿法消解研究.浙江医科大学学报，1997.
4.Raghunadha R.Rao and Amares Chatt Microwave Acid Digestion and Precontraction Neutron Activation Analysis of Biological and Diet Samples for Iodine Anal.Chem，1991,63:1298～1303.
5.徐立强，等.微波高压消化法在试样分解中应用.理化检验(化学分册)，1988，24(5)：278.
6.徐立强，等.食品的微波消化及其元素的ICP-AES测定.痕量分析，1988，2：28.
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