2，4-二氯-6-硝基酚铵诱发小鼠肺肿瘤研究
作者：田汉文 董奇男 李寿祺 肖邦良 周谷
单位：田汉文 (华西医科大学卫生毒理教研室硕士生，现在基础医学院药理教研室 成都 610041)； 董奇男 李寿祺 肖邦良 周 谷 (华西医科大学卫生毒理教研室)
关键词：2，4-二氯-6-硝基酚铵；小鼠肺肿瘤诱发；完全致癌物；演进剂
卫生毒理学杂志99017 内容摘要 用2，4-二氯-6-硝基酚铵(DCNPA)进行小鼠肺肿瘤诱发试验。分别作DCNPA1次腹腔注射染毒，DCNPA1次染毒+BHT促进，和DCNPA1次染毒+BHT促进+DCNPA演进3个试验。结果提示DCNPA为完全致癌物，因为DCNPA不需BHT促进即能诱发肺腺瘤，试验结果也提示DCNPA有一定的演进作用。
The study of mouse lung tumor inductivity by 2,4-dichloro-6- nitrophenolate ammonium
, 百拇医药
Tian Han-wen
(Dept.of Pharmacology Toxicology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Dong Qi-nan Li Shou-qi et al.
Carcinogenicity of 2,4-dichloro-6-nitrophenolate amnonium (DCNPA) was deteded by mouse lung tumor short-term induction assay.It was tested by 3 differant models,i.e.DCNPA single injection(i.p.) exposure,DCNPA single injection+BHT promotion,and DCNPA single injection+BHJ promotion+DCNPA progression.The results suggested that DCNPA is a complete carcinogen,as lung adenomas could be inducted without BHT promotion.The results also demonstrated that DCNPA appeared to play a role in the progression stage of lung carcinogenesis.
, 百拇医药
Key words:2,4-dichloro-6-nitrophenolate ammonium;Mouse lung tumor induction;Complete carcinogen;Progressor
2，4-二氯-6-硝基酚铵(ammonium 2,4-dichloro-6-nitrophenolate,DCNPA,暂定名83-1除草剂)，分子式NO2C6H2Cl2ONH4,结构式为：
。该除草剂为四川省化工研究所合成，田间试验表明它对麦田杂草“猪秧秧”有特效。据报道DCNPA枯草杆菌重组修复试验在高达2500～5000μg/ml为阳性反应，但Ames试验及大肠杆菌回变试验均为阴性反应[1]。应用小鼠肺肿瘤短期诱发试验[2]，以一次染毒对DCNPA的致癌性进行检测，对及试用DCNPA本身作演进剂同时进行二阶段和三阶段诱癌试验。目的在于了解DCNPA在致癌过程中是否具有启动作用、促进作用和演进作用(progression)。
, http://www.100md.com
材料与方法
1.化学物：2，4-二氯-6-硝基酚铵，由四川省化工研究所提供，纯度>97%，实验当天用生理盐水配成所需浓度。丁基羟基甲苯(BHT)来源于Sigma公司，使用时用食用油配成所需浓度。
2.实验动物：BALB/c小鼠和昆明种小鼠，由华西医大实验动物中心提供，质量合格证编号分别为“医动字第24101110号”和“医动字第24101108号”。4周龄小鼠，观察1周后供试验。
3.染毒设计：分3个试验。
试验A：设4组，每组BALB/c小鼠80只，雌雄各半。DCNPA按3.3，10，30mg/kg1次腹腔注射，设溶剂对照组。
试验B：共有两个组，每组BASLB/c小鼠70只，雌雄各半。一组1次腹腔注射DCNPA 30mg/kg，2周后用0.25% BHT拌饲每周1次，共8周，另一组为BHT对照组，仅有BHT拌饲每周1次，共8周。
, 百拇医药
试验C：设3个组，每组昆明种小鼠80只，雌雄各半，一组经过DCNPA和BHT两阶段染毒后，于实验的第11周再给与DCNPA 30mg/kg腹腔注射1次。一组溶剂对照注射生理盐水，另一组为BHT对照组如试验B。
A、B、C 3个试验均于第15周末颈椎脱臼处死小鼠，取肺脏置解剖镜下观察，计数肺表面肿瘤数。然后用10%甲醛固定，将肿瘤逐个取材制作石蜡切片、HE染色，光镜下复核确认。
4.统计分析：发瘤率的分析用四格表确切概率法，剂量-反应关系的确定采用曲线拟合和方差分析。
结 果
肉眼所见肿瘤为灰白色半透明结节，边界清楚，大部分突出肺表面，直径0.5～2.5mm。光镜下观察，多数为腺瘤(15/18)，少数为乳头状腺瘤(2/18)，在3阶段染毒组发现一个腺瘤恶变。所有发病鼠均仅见一个肿瘤，未见多发性。各发瘤实验组未见雌雄发瘤率差异，故合并统计。
, 百拇医药
附表 DCNPA诱发小鼠肺肿瘤试验结果 组别
DCNPA(mg/kg)
BHT
(%)
DCNPA
(mg/kg)
有效小鼠数
(只)
发瘤小鼠数
(只)
发瘤率
(%)
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A
1
0
0
0
80
0
0
2
3.3
0
0
73
1
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1.3
3
10.0
0
0
73
2
2.7
4
30.0
0
0
72
4
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5.5*
B
1
0
0.25
0
63
0
0
2
30.0
0.25
0
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60
3
5.0
C
1
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0.25
0
80
0
0
2
30.0
0.25
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0
73
3
4.1
3
30.0
0.25
30.0
71
5
7.0△
与溶剂对照组比较*P<0.05，与BHT对照组比较△P<0.05
, http://www.100md.com 各组有效动物数占开始实验动物数85.7%～100%。
讨 论
目前公认的化学致癌物定义为：凡是能达到下列条件一种或几种者即可说明其有致癌性，即与对照组比较自发类型的肿瘤发生率增加，发生了对照组中没有的肿瘤类型，与对照组比较肿瘤发生提前，与对照组比较出现了肿瘤的多发性[3]。IRLG也指出，有一个种属的动物得到阳性结果，即使是短期实验，只要设计合理，就可确认该化学物具有致癌性[4]。据此标准，试验A中的DCNPA诱发的肿瘤率存在剂量-反应关系，其最高剂量组与溶剂对照组差异有显著性。故可以认为DCNPA有致癌性，且由于不需促进剂即可诱癌，很可能是完全致癌物。
丁基羟基甲苯(BHT)是促进剂，常用于肺肿瘤诱发作促进剂研究，在启动之后给予BHT可以增加肿瘤发生率[5]。但本研究试验B和C中的BHT均未发现有促进作用(B2组和C2组均与A4组无显著差异)，其原因可能为：①BHT的用量较小，②DCNPA为完全致癌物且用量过大，故使BHT的促癌作用未能显示出来。
, 百拇医药
启动细胞经促进作用的终产物通常是良性肿瘤或癌前病灶，极少有恶性肿瘤。在促进的同时或之后给予演进剂则使良性肿瘤恶化并逐渐发展为癌[6，7]。本试验在促进之后再一次给予DCNPA(C3组)，虽比DCNPA一次染毒(A4组)和二阶段染毒(B2和C2组)的发瘤率稍有提高，但其剂量或染毒次数增加的程度未产生显著提高发瘤率的效果。不过此时C3组出现一例腺瘤恶化，揭示DCNPA有一定的演进作用。如再增加其染毒次数或剂量，其演进作用有可能获得更为明显的结果。
综上所述，实验结果提示DCNPA具有启动作用、促进作用和演进作用。
2，4-二氯-6-硝基基酚铵按其结构应为氯代苯氧基型除草剂再引入硝基基团的一种衍生物。常见的氯代苯氧基型除草剂有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，2，4，5-T(三氯苯氧乙酸)，2，4，5-涕西酸(三氯苯氧丙酸)和二甲四氯(4-氯-2-甲基苯氧乙酸)。仅查见2，4-D有诱变性，能诱发SCE，DNA合成抑制和染色体畸变，对人或动物的致癌性证据有限或不足[8]。与氯代苯氧基型除草剂结构相似的氯酚类，其对人的致癌则被IARC列入2B类(即可能对人致癌)[9]。
, http://www.100md.com
2，4-二氯-6-硝基酚铵的结构与2,4-D和氯酚类都有部分相似，故应注意其致癌性的进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(3880678)
参考文献
1.衡正昌，吴德生，刘玉清，等.卫生毒理学杂志，1992，6(3)：206-207.
2.李涛祺，肖邦良，董奇男，等.中国药理学与毒理学杂志，1993，7(1)：68～72.
3.Willams GH，Weisburger JH.Chemical Carcinogens.In: Klaassen CD，Amdur MD，Doull JJ eds.Caarett and Doull Toxicology，(3nd ed) New York: Macmillan Pulb，1991,127～206.
, 百拇医药
4.IRLG.J Natl Cancer Inst.1979;63(2):341.
5.Hanspeter Witschi，Alvin M，Malkinson and John A Thomposon.Pharmac Ther，1989,42:89～113.
6.J Carl Barrett.Environmental Health Perspectives.1993;100:9～12.
7.Potter V R.Carcinogenesis.1981,2:1375～1379.
8.Lewis RJ，Sr (Ed).Carcinogenically Active Chemicals.Yan Nostrand Reinhdd，New York，1991，251.
9.IARC.IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans.IARC，Lyon 1994,11.
(修回日期 1998年3月), http://www.100md.com
单位：田汉文 (华西医科大学卫生毒理教研室硕士生，现在基础医学院药理教研室 成都 610041)； 董奇男 李寿祺 肖邦良 周 谷 (华西医科大学卫生毒理教研室)
关键词：2，4-二氯-6-硝基酚铵；小鼠肺肿瘤诱发；完全致癌物；演进剂
卫生毒理学杂志99017 内容摘要 用2，4-二氯-6-硝基酚铵(DCNPA)进行小鼠肺肿瘤诱发试验。分别作DCNPA1次腹腔注射染毒，DCNPA1次染毒+BHT促进，和DCNPA1次染毒+BHT促进+DCNPA演进3个试验。结果提示DCNPA为完全致癌物，因为DCNPA不需BHT促进即能诱发肺腺瘤，试验结果也提示DCNPA有一定的演进作用。
The study of mouse lung tumor inductivity by 2,4-dichloro-6- nitrophenolate ammonium
, 百拇医药
Tian Han-wen
(Dept.of Pharmacology Toxicology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Dong Qi-nan Li Shou-qi et al.
Carcinogenicity of 2,4-dichloro-6-nitrophenolate amnonium (DCNPA) was deteded by mouse lung tumor short-term induction assay.It was tested by 3 differant models,i.e.DCNPA single injection(i.p.) exposure,DCNPA single injection+BHT promotion,and DCNPA single injection+BHJ promotion+DCNPA progression.The results suggested that DCNPA is a complete carcinogen,as lung adenomas could be inducted without BHT promotion.The results also demonstrated that DCNPA appeared to play a role in the progression stage of lung carcinogenesis.
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Key words:2,4-dichloro-6-nitrophenolate ammonium;Mouse lung tumor induction;Complete carcinogen;Progressor
2，4-二氯-6-硝基酚铵(ammonium 2,4-dichloro-6-nitrophenolate,DCNPA,暂定名83-1除草剂)，分子式NO2C6H2Cl2ONH4,结构式为：
。该除草剂为四川省化工研究所合成，田间试验表明它对麦田杂草“猪秧秧”有特效。据报道DCNPA枯草杆菌重组修复试验在高达2500～5000μg/ml为阳性反应，但Ames试验及大肠杆菌回变试验均为阴性反应[1]。应用小鼠肺肿瘤短期诱发试验[2]，以一次染毒对DCNPA的致癌性进行检测，对及试用DCNPA本身作演进剂同时进行二阶段和三阶段诱癌试验。目的在于了解DCNPA在致癌过程中是否具有启动作用、促进作用和演进作用(progression)。, http://www.100md.com
材料与方法
1.化学物：2，4-二氯-6-硝基酚铵，由四川省化工研究所提供，纯度>97%，实验当天用生理盐水配成所需浓度。丁基羟基甲苯(BHT)来源于Sigma公司，使用时用食用油配成所需浓度。
2.实验动物：BALB/c小鼠和昆明种小鼠，由华西医大实验动物中心提供，质量合格证编号分别为“医动字第24101110号”和“医动字第24101108号”。4周龄小鼠，观察1周后供试验。
3.染毒设计：分3个试验。
试验A：设4组，每组BALB/c小鼠80只，雌雄各半。DCNPA按3.3，10，30mg/kg1次腹腔注射，设溶剂对照组。
试验B：共有两个组，每组BASLB/c小鼠70只，雌雄各半。一组1次腹腔注射DCNPA 30mg/kg，2周后用0.25% BHT拌饲每周1次，共8周，另一组为BHT对照组，仅有BHT拌饲每周1次，共8周。
, 百拇医药
试验C：设3个组，每组昆明种小鼠80只，雌雄各半，一组经过DCNPA和BHT两阶段染毒后，于实验的第11周再给与DCNPA 30mg/kg腹腔注射1次。一组溶剂对照注射生理盐水，另一组为BHT对照组如试验B。
A、B、C 3个试验均于第15周末颈椎脱臼处死小鼠，取肺脏置解剖镜下观察，计数肺表面肿瘤数。然后用10%甲醛固定，将肿瘤逐个取材制作石蜡切片、HE染色，光镜下复核确认。
4.统计分析：发瘤率的分析用四格表确切概率法，剂量-反应关系的确定采用曲线拟合和方差分析。
结 果
肉眼所见肿瘤为灰白色半透明结节，边界清楚，大部分突出肺表面，直径0.5～2.5mm。光镜下观察，多数为腺瘤(15/18)，少数为乳头状腺瘤(2/18)，在3阶段染毒组发现一个腺瘤恶变。所有发病鼠均仅见一个肿瘤，未见多发性。各发瘤实验组未见雌雄发瘤率差异，故合并统计。
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附表 DCNPA诱发小鼠肺肿瘤试验结果 组别
DCNPA(mg/kg)
BHT
(%)
DCNPA
(mg/kg)
有效小鼠数
(只)
发瘤小鼠数
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发瘤率
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7.0△
与溶剂对照组比较*P<0.05，与BHT对照组比较△P<0.05
, http://www.100md.com 各组有效动物数占开始实验动物数85.7%～100%。
讨 论
目前公认的化学致癌物定义为：凡是能达到下列条件一种或几种者即可说明其有致癌性，即与对照组比较自发类型的肿瘤发生率增加，发生了对照组中没有的肿瘤类型，与对照组比较肿瘤发生提前，与对照组比较出现了肿瘤的多发性[3]。IRLG也指出，有一个种属的动物得到阳性结果，即使是短期实验，只要设计合理，就可确认该化学物具有致癌性[4]。据此标准，试验A中的DCNPA诱发的肿瘤率存在剂量-反应关系，其最高剂量组与溶剂对照组差异有显著性。故可以认为DCNPA有致癌性，且由于不需促进剂即可诱癌，很可能是完全致癌物。
丁基羟基甲苯(BHT)是促进剂，常用于肺肿瘤诱发作促进剂研究，在启动之后给予BHT可以增加肿瘤发生率[5]。但本研究试验B和C中的BHT均未发现有促进作用(B2组和C2组均与A4组无显著差异)，其原因可能为：①BHT的用量较小，②DCNPA为完全致癌物且用量过大，故使BHT的促癌作用未能显示出来。
, 百拇医药
启动细胞经促进作用的终产物通常是良性肿瘤或癌前病灶，极少有恶性肿瘤。在促进的同时或之后给予演进剂则使良性肿瘤恶化并逐渐发展为癌[6，7]。本试验在促进之后再一次给予DCNPA(C3组)，虽比DCNPA一次染毒(A4组)和二阶段染毒(B2和C2组)的发瘤率稍有提高，但其剂量或染毒次数增加的程度未产生显著提高发瘤率的效果。不过此时C3组出现一例腺瘤恶化，揭示DCNPA有一定的演进作用。如再增加其染毒次数或剂量，其演进作用有可能获得更为明显的结果。
综上所述，实验结果提示DCNPA具有启动作用、促进作用和演进作用。
2，4-二氯-6-硝基基酚铵按其结构应为氯代苯氧基型除草剂再引入硝基基团的一种衍生物。常见的氯代苯氧基型除草剂有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，2，4，5-T(三氯苯氧乙酸)，2，4，5-涕西酸(三氯苯氧丙酸)和二甲四氯(4-氯-2-甲基苯氧乙酸)。仅查见2，4-D有诱变性，能诱发SCE，DNA合成抑制和染色体畸变，对人或动物的致癌性证据有限或不足[8]。与氯代苯氧基型除草剂结构相似的氯酚类，其对人的致癌则被IARC列入2B类(即可能对人致癌)[9]。
, http://www.100md.com
2，4-二氯-6-硝基酚铵的结构与2,4-D和氯酚类都有部分相似，故应注意其致癌性的进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(3880678)
参考文献
1.衡正昌，吴德生，刘玉清，等.卫生毒理学杂志，1992，6(3)：206-207.
2.李涛祺，肖邦良，董奇男，等.中国药理学与毒理学杂志，1993，7(1)：68～72.
3.Willams GH，Weisburger JH.Chemical Carcinogens.In: Klaassen CD，Amdur MD，Doull JJ eds.Caarett and Doull Toxicology，(3nd ed) New York: Macmillan Pulb，1991,127～206.
, 百拇医药
4.IRLG.J Natl Cancer Inst.1979;63(2):341.
5.Hanspeter Witschi，Alvin M，Malkinson and John A Thomposon.Pharmac Ther，1989,42:89～113.
6.J Carl Barrett.Environmental Health Perspectives.1993;100:9～12.
7.Potter V R.Carcinogenesis.1981,2:1375～1379.
8.Lewis RJ，Sr (Ed).Carcinogenically Active Chemicals.Yan Nostrand Reinhdd，New York，1991，251.
9.IARC.IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans.IARC，Lyon 1994,11.
(修回日期 1998年3月), http://www.100md.com