内皮素在大鼠全脑缺血再灌流后海马神经元损伤中的意义
作者：刘 宏1 吴平生2 蔡德鸿1
单位：1第一军医大学珠江医院内分泌科(510282)；2第一军医大学南方医院心内科(510515)
关键词：内皮素；大鼠； 全脑缺血再灌流；迟发性神经元坏死
广东医学990102 【摘要】 目的 通过检测大鼠全脑缺血后再灌流血浆及脑组织中内皮素的含量变化，初步探讨了内皮素与脑缺血再灌流后海马组织损伤的关系。方法 利用四血管阻断法形成大鼠全脑缺血模型，在全脑缺血10 min后再灌流6 h、24 h、72 h以及120 h后分别检测血浆及脑组织中内皮素的含量。结果 大鼠全脑缺血再灌流后血浆及脑组织中内皮素含量明显升高，特别是海马组织中内皮素的增高最为明显。内皮素的增高在脑缺血后24～72 h达到最高峰，120 h有下降趋势。结论 内皮素的改变与脑缺血再灌流引起的海马神经元迟发性坏死有密切的关系。
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The significance of endothelin in the injury of hippocampus after the global ischemia and reperfusion Liu Hong， Wu Pingsheng， Cai Dehong. Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objective The change of ET-1 concentrations was detected in the plasma and brain tissue after the global ischemia and reperfusion of rat and the relationship of ET-1 and the hippocampal injury after reperfusion was investigated . Methods The four-vessel occlusion (4-VO) model was made as described by Pulsinelli-Brierley in Sprague-Daewley rats. After 10 minutes of ischemia the plasma and brain tissues' concentrations of ET-1 was detected in the reperfusion of 6 hr, 12 hr, 24 hr, 72 hr and 120 hr respectively. Results The concentrations of ET-1 in the global ischemic brain tissues and plasma significantly increased after transient cerebral ischemia. And the concentrations became higher with the prolongation of ischemia. It was observed that the concentrations of ET-1 in the hippocampus were much higher than that in the cortex after the global ischemia. Conclusion It might confirm that the marked increase of ET-1 in the brain tissues and plasma was associated with global ischemic events. And ET-1 might play some role in the delayed neuron death of hippocampal neurons after the global ischemia and reperfusion.
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【Key words】 Endothelin Rats Global ischemia and reperfusion Delayed neuron death
内皮素(endothelin, ET)是在1988年由Yanagisawa首先从猪主动脉内皮细胞培养液中提取出来的一种具有强烈血管收缩效应的肽类物质[1]。目前的研究已经表明内皮素与脑血管病的发生发展有密切的相关性[2]。内皮素主要有3种，即ET-1，ET-2，ET-3，其中ET-1是主要的活性物质，它广泛分布于中枢神经系统和血管内皮细胞中，具有收缩脑血管，调节脑血流等作用。ET-1在脑组织或脑脊液中含量异常增高，都会导致脑神经元的缺血性损伤。但是，内皮素与全脑缺血再灌流引起的神经元坏死之间有什么联系，目前仍少见报道。本文测定了全脑缺血再灌流后ET-1含量的变化，从而进一步探讨内皮素与全脑缺血再灌流引起的海马神经元迟发性坏死之间的关系。
1 材料与方法
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1.1 动物和分组 雄性Sprague-Daewley大鼠50只，体重250～320 g，随机分为5组，即正常对照的假手术组和全脑缺血再灌流后6 h、24 h、72 h以及120 h实验组，每一组动物均为10只。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型 选用4-VO模型[3]。动物用10%水合氯醛(0.35 mL/kg， IP)麻醉，然后将其固定于动物立体定位仪上。首先在大鼠颈部背侧切开皮肤，暴露第一颈椎两侧翼小孔，电凝两侧椎动脉；然后颈前切口，分离两侧颈总动脉，用手术线设活结，线端经两侧耳后部引出皮肤，缝合切口，放回笼内饲养。于次日动物清醒状态下拉紧活结，造成全脑缺血，10 min后放开，放回笼内继续饲养至预定时间。模型成功标准: ①翻正反射消失； ②1 min后动物无反应，但睫毛反射存在； ③呼吸加快，竖毛，眼发白。
1.2.2 标本处理 采血2 mL+EDTA(1 mg/mL)抗凝+抑肽酶(Aprotinin，美国Sigma公司产品)50 kIU/mL，然后离心得血浆放于-80℃低温冰箱保存。脑组织在0.1 mol/L醋酸中匀浆，10 000 g离心10 min，取上清液过C 18柱(Millipore公司产品)，该柱先用70%乙晴，0.1%三氟乙酸总量2 mL预处理，滤过液真空抽干后于-80℃保存。
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1.2.3 内皮素的检测 采用放射免疫法检测，药盒由北京解放军总医院提供。血浆ET的单位为ng/L，脑组织标本ET的单位为ng/(g.pr)。
1.2.4 数据处理 数据以
±s表示，统计学处理用方差分析及t检验。
2 结果
脑缺血再灌流后不同时间内血浆ET-1的含量均有增加，与对照组比较差异均有显著性；脑缺血再灌流后不同时间脑组织内皮素的含量也有明显增高，它们与对照组之间的差异也有显著性，详见表1。
表1 血浆和脑组织中ET-1的含量
对照组
再灌流6 h
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24 h
72 h
120 h
血浆(ng/L)
28.4±5.9
53.2±4.5*
80.1±6.8**
83.6±7.3**
9.4±5.7*
皮层[ng/(g*pr)]
2.1±0.6
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4.2±1.5*
7.4±2.9**
9.3±3.2**
6.9±3.1*
海马[mg/(g*pr)]
1.9±0.4
4.0±1.2*
13.7±5.2**△
16.3±4.9**△
12.5±4.5**△
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与对照组比较P<0.01,**与对照组和6 h组比较P<0.01, △ 与相应时间段皮层组比较P<0.013 讨论
内皮素是一种具有强烈血管收缩作用的肽类物质，它对于脑血管也有强烈的收缩作用。近年来的研究表明它在中枢神经系统起着神经调节因子的作用，具有一种旁分泌激素功能。脑血管疾病的发生可以引起内皮素含量的改变，而内皮素的增加可能进一步加重脑组织的损伤[4]。本研究发现内皮素在脑缺血再灌流后的不同时间段其含量均有增加，且在缺血再灌流后的24～72 h达到高峰，说明内皮素与脑缺血再灌流引起的迟发性神经元坏死有一定的关系。脑缺血后脑血管内皮细胞因缺血而受损，引起血管及细胞内的内皮素释放增加，同时内皮素的合成也增加，而血管内皮细胞内皮素的降解减弱，因此血管内及组织中的内皮素含量急剧增加。内皮素又再作用于血管平滑肌，使其细胞内Ca2+增加，导致血管进一步收缩而形成恶性循环，从而加重脑缺血[5]。
, 百拇医药
内皮素通过脑内特异性内皮素结合位点而起作用。近来的研究发现中枢神经系统内广泛存在有内皮素的结合位点。内皮素与受体结合后能激活磷脂酶C和蛋白激酶C，而使细胞内钙释放至胞浆中，且可导致神经介质如谷氨酸及门冬氨酸释放，一般认为谷氨酸释放导致细胞内Ca2+超载，是缺血性神经元坏死的主要原因[6]。而且，ET-1引起细胞内Ca2+增高，可间接激活一氧化氮合成酶，导致一氧化氮增多，发挥神经毒作用。
全脑缺血再灌流后会出现典型的海马神经元的迟发性神经元坏死[7]，目前有许多学说来解释这一现象，但仍没有一种学说能够完整地说明这一问题[8]。血浆内及组织中内皮素的急剧增高，可能是产生这一现象的原因之一。本研究表明内皮素在脑缺血再灌流后6 h开始升高，而且其高峰在24～72 h，这正是脑缺血再灌流后脑组织海马神经元开始出现变性坏死的时间。在这段时间内脑组织内内皮素也明显升高，并且海马组织中内皮素的含量比皮层有明显增高，因此这或许可以说明为什么全脑缺血再灌流后海马神经元会发生迟发性坏死，而脑皮层及其他组织却没有明显病理改变。因此我们初步推断血浆内皮素的增高以及脑的海马区域内的内皮素的异常升高与全脑缺血再灌流后的迟发性神经元坏死有一定的关系。
, 百拇医药
4 参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstriction peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988, 332:411
2 Salom JB, Torregrosa G, Alborch B, et al. Endothelins and the cerebral circulation. Cerebrovasc Brain Metab Rev, 1995, 7:131
3 Pulsinelli WA, Brierley JB, Plum F, et al. Temporal profile of neuronal damage in a model of forebrain ischemia. Ann Neurol, 1982,11:491
, 百拇医药
4 Sharkey J, Butcher SP. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J Neurosci Methods, 1995, 60:125
5 Macrae IM, Robison MJ, Graham DJ, et al. Enothelin-1 induced reductions in cerebral blood flow:dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13:276
6 Stanimirovic DB, Yamamoto T, Uematsu S, et al. Endothelin-1 receptor binding and cellular signal transduction in cultured human brain endothelial cells. J Neurochem, 1994, 62:592
7 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res, 1982, 239:57
8 Abe K, Aoki M, Kawagoe J, et al. Ischemic delayed neuronal death: A mitochondrial hypothesis. Stroke, 1995, 26:1478, http://www.100md.com(刘 宏1 吴平生2 蔡德鸿1)
单位：1第一军医大学珠江医院内分泌科(510282)；2第一军医大学南方医院心内科(510515)
关键词：内皮素；大鼠； 全脑缺血再灌流；迟发性神经元坏死
广东医学990102 【摘要】 目的 通过检测大鼠全脑缺血后再灌流血浆及脑组织中内皮素的含量变化，初步探讨了内皮素与脑缺血再灌流后海马组织损伤的关系。方法 利用四血管阻断法形成大鼠全脑缺血模型，在全脑缺血10 min后再灌流6 h、24 h、72 h以及120 h后分别检测血浆及脑组织中内皮素的含量。结果 大鼠全脑缺血再灌流后血浆及脑组织中内皮素含量明显升高，特别是海马组织中内皮素的增高最为明显。内皮素的增高在脑缺血后24～72 h达到最高峰，120 h有下降趋势。结论 内皮素的改变与脑缺血再灌流引起的海马神经元迟发性坏死有密切的关系。
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The significance of endothelin in the injury of hippocampus after the global ischemia and reperfusion Liu Hong， Wu Pingsheng， Cai Dehong. Department of Endocrinology, Zhujiang Hospital, the First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objective The change of ET-1 concentrations was detected in the plasma and brain tissue after the global ischemia and reperfusion of rat and the relationship of ET-1 and the hippocampal injury after reperfusion was investigated . Methods The four-vessel occlusion (4-VO) model was made as described by Pulsinelli-Brierley in Sprague-Daewley rats. After 10 minutes of ischemia the plasma and brain tissues' concentrations of ET-1 was detected in the reperfusion of 6 hr, 12 hr, 24 hr, 72 hr and 120 hr respectively. Results The concentrations of ET-1 in the global ischemic brain tissues and plasma significantly increased after transient cerebral ischemia. And the concentrations became higher with the prolongation of ischemia. It was observed that the concentrations of ET-1 in the hippocampus were much higher than that in the cortex after the global ischemia. Conclusion It might confirm that the marked increase of ET-1 in the brain tissues and plasma was associated with global ischemic events. And ET-1 might play some role in the delayed neuron death of hippocampal neurons after the global ischemia and reperfusion.
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【Key words】 Endothelin Rats Global ischemia and reperfusion Delayed neuron death
内皮素(endothelin, ET)是在1988年由Yanagisawa首先从猪主动脉内皮细胞培养液中提取出来的一种具有强烈血管收缩效应的肽类物质[1]。目前的研究已经表明内皮素与脑血管病的发生发展有密切的相关性[2]。内皮素主要有3种，即ET-1，ET-2，ET-3，其中ET-1是主要的活性物质，它广泛分布于中枢神经系统和血管内皮细胞中，具有收缩脑血管，调节脑血流等作用。ET-1在脑组织或脑脊液中含量异常增高，都会导致脑神经元的缺血性损伤。但是，内皮素与全脑缺血再灌流引起的神经元坏死之间有什么联系，目前仍少见报道。本文测定了全脑缺血再灌流后ET-1含量的变化，从而进一步探讨内皮素与全脑缺血再灌流引起的海马神经元迟发性坏死之间的关系。
1 材料与方法
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1.1 动物和分组 雄性Sprague-Daewley大鼠50只，体重250～320 g，随机分为5组，即正常对照的假手术组和全脑缺血再灌流后6 h、24 h、72 h以及120 h实验组，每一组动物均为10只。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型 选用4-VO模型[3]。动物用10%水合氯醛(0.35 mL/kg， IP)麻醉，然后将其固定于动物立体定位仪上。首先在大鼠颈部背侧切开皮肤，暴露第一颈椎两侧翼小孔，电凝两侧椎动脉；然后颈前切口，分离两侧颈总动脉，用手术线设活结，线端经两侧耳后部引出皮肤，缝合切口，放回笼内饲养。于次日动物清醒状态下拉紧活结，造成全脑缺血，10 min后放开，放回笼内继续饲养至预定时间。模型成功标准: ①翻正反射消失； ②1 min后动物无反应，但睫毛反射存在； ③呼吸加快，竖毛，眼发白。
1.2.2 标本处理 采血2 mL+EDTA(1 mg/mL)抗凝+抑肽酶(Aprotinin，美国Sigma公司产品)50 kIU/mL，然后离心得血浆放于-80℃低温冰箱保存。脑组织在0.1 mol/L醋酸中匀浆，10 000 g离心10 min，取上清液过C 18柱(Millipore公司产品)，该柱先用70%乙晴，0.1%三氟乙酸总量2 mL预处理，滤过液真空抽干后于-80℃保存。
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1.2.3 内皮素的检测 采用放射免疫法检测，药盒由北京解放军总医院提供。血浆ET的单位为ng/L，脑组织标本ET的单位为ng/(g.pr)。
1.2.4 数据处理 数据以
±s表示，统计学处理用方差分析及t检验。2 结果
脑缺血再灌流后不同时间内血浆ET-1的含量均有增加，与对照组比较差异均有显著性；脑缺血再灌流后不同时间脑组织内皮素的含量也有明显增高，它们与对照组之间的差异也有显著性，详见表1。
表1 血浆和脑组织中ET-1的含量
对照组
再灌流6 h
, 百拇医药
24 h
72 h
120 h
血浆(ng/L)
28.4±5.9
53.2±4.5*
80.1±6.8**
83.6±7.3**
9.4±5.7*
皮层[ng/(g*pr)]
2.1±0.6
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4.2±1.5*
7.4±2.9**
9.3±3.2**
6.9±3.1*
海马[mg/(g*pr)]
1.9±0.4
4.0±1.2*
13.7±5.2**△
16.3±4.9**△
12.5±4.5**△
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与对照组比较P<0.01,**与对照组和6 h组比较P<0.01, △ 与相应时间段皮层组比较P<0.013 讨论
内皮素是一种具有强烈血管收缩作用的肽类物质，它对于脑血管也有强烈的收缩作用。近年来的研究表明它在中枢神经系统起着神经调节因子的作用，具有一种旁分泌激素功能。脑血管疾病的发生可以引起内皮素含量的改变，而内皮素的增加可能进一步加重脑组织的损伤[4]。本研究发现内皮素在脑缺血再灌流后的不同时间段其含量均有增加，且在缺血再灌流后的24～72 h达到高峰，说明内皮素与脑缺血再灌流引起的迟发性神经元坏死有一定的关系。脑缺血后脑血管内皮细胞因缺血而受损，引起血管及细胞内的内皮素释放增加，同时内皮素的合成也增加，而血管内皮细胞内皮素的降解减弱，因此血管内及组织中的内皮素含量急剧增加。内皮素又再作用于血管平滑肌，使其细胞内Ca2+增加，导致血管进一步收缩而形成恶性循环，从而加重脑缺血[5]。
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内皮素通过脑内特异性内皮素结合位点而起作用。近来的研究发现中枢神经系统内广泛存在有内皮素的结合位点。内皮素与受体结合后能激活磷脂酶C和蛋白激酶C，而使细胞内钙释放至胞浆中，且可导致神经介质如谷氨酸及门冬氨酸释放，一般认为谷氨酸释放导致细胞内Ca2+超载，是缺血性神经元坏死的主要原因[6]。而且，ET-1引起细胞内Ca2+增高，可间接激活一氧化氮合成酶，导致一氧化氮增多，发挥神经毒作用。
全脑缺血再灌流后会出现典型的海马神经元的迟发性神经元坏死[7]，目前有许多学说来解释这一现象，但仍没有一种学说能够完整地说明这一问题[8]。血浆内及组织中内皮素的急剧增高，可能是产生这一现象的原因之一。本研究表明内皮素在脑缺血再灌流后6 h开始升高，而且其高峰在24～72 h，这正是脑缺血再灌流后脑组织海马神经元开始出现变性坏死的时间。在这段时间内脑组织内内皮素也明显升高，并且海马组织中内皮素的含量比皮层有明显增高，因此这或许可以说明为什么全脑缺血再灌流后海马神经元会发生迟发性坏死，而脑皮层及其他组织却没有明显病理改变。因此我们初步推断血浆内皮素的增高以及脑的海马区域内的内皮素的异常升高与全脑缺血再灌流后的迟发性神经元坏死有一定的关系。
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4 参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstriction peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988, 332:411
2 Salom JB, Torregrosa G, Alborch B, et al. Endothelins and the cerebral circulation. Cerebrovasc Brain Metab Rev, 1995, 7:131
3 Pulsinelli WA, Brierley JB, Plum F, et al. Temporal profile of neuronal damage in a model of forebrain ischemia. Ann Neurol, 1982,11:491
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4 Sharkey J, Butcher SP. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J Neurosci Methods, 1995, 60:125
5 Macrae IM, Robison MJ, Graham DJ, et al. Enothelin-1 induced reductions in cerebral blood flow:dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J Cereb Blood Flow Metab, 1993, 13:276
6 Stanimirovic DB, Yamamoto T, Uematsu S, et al. Endothelin-1 receptor binding and cellular signal transduction in cultured human brain endothelial cells. J Neurochem, 1994, 62:592
7 Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res, 1982, 239:57
8 Abe K, Aoki M, Kawagoe J, et al. Ischemic delayed neuronal death: A mitochondrial hypothesis. Stroke, 1995, 26:1478, http://www.100md.com(刘 宏1 吴平生2 蔡德鸿1)