细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞的超微结构观察
作者：韩彩丽 宋伟庆 阎蕴力 王凤荣 李淑荣
单位：韩彩丽 河北省医学科学院病理室(石家庄 050021)；阎蕴力 王凤荣 李淑荣 河北医科大学基础医学研究所；宋伟庆 河北医科大学第二医院外科
关键词：胃肿瘤；免疫学；T淋巴细胞，细胞毒性；免疫学；显微镜检查，电子
河北医科大学学报990102
摘要 目的 研究特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤胃癌细胞BGC-823的超微结构变化。方法 用22例患者的胃腺癌细胞反复冻融后的滤液,抗CD3单克隆抗体、白细胞介素-2(IL-2)与患者自体外周血淋巴细胞共同培养,体外诱导CTL,然后将CTL与BGC-823共同孵育,用电子显微镜观察CTL作用于BGC-823后的超微结构改变。结果 电镜观察可见CTL包围并破坏靶细胞,靶细胞凋亡的形态表现为异染色质浓缩呈特征性半月形帽状核,还可见靶细胞溶解坏死。结论 特异性CTL可使靶细胞凋亡,溶解而导致其死亡。
, 百拇医药
中图号 R730.51;R735.2
ULTRASTRUCTURAL OBSERVATION ON
GASTRIC CARCINOMA CELLS EXPOSED
TO CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES
Han Caili Song Weiqing
Department of Pathology,Hebei Academy of Medical Science (Shijiazhuang 050021)
Yan Yunli Wang Fengrong Li Shurong
Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To study ultrastructural changes of BGC-823 gastric cancer cells due to the killing effects of the specific cytotoxic T lymphocytes(CTL).Methods The CTLs were induced by repeated freeze-thawed extracts of gastric cancer cells from 22 patients with gastric carcinoma and anti-CD3 monoclonal antibody as well as recombinant interleukin-2 in vitro.The CTLs were then cultured with target cells BGC-823.Ultrastrutural changes of BGC-823 cells after CTL treatment were observed with electron microscope.Results The target cells were frequently surrounded and attacked by CTLs.Apoptotic changes,such as heterochromatin condensation with characteristic crescentic cap appearance and necrostic changes were found in BGC-823 cells.Conclusion The specific CTL killed target cells by inducing apoptosis and necrosis.
, 百拇医药
MeSH stomach neoplasms/immunol;T-lymphocytes,cytotoxic/immunol;microscopy,electron
细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀瘤活性高,而且特异性强,因此日益受到人们的重视。不少学者对其杀伤靶细胞的机制进行了大量研究,认为CTL可诱导靶细胞凋亡或使其溶解坏死。本文应用透射电镜和扫描电镜观察,研究人CTL杀伤胃癌细胞的形态学基础,以进一步阐明其杀瘤机制。
1 材料与方法
1.1 效应细胞与靶细胞制备
1.1.1 效应细胞体外诱导:在无菌条件下取胃癌患者手术切除标本22例〔1〕,用胶原酶、DNA酶、透明质酸酶消化,分离胃癌细胞,低温(-30℃)反复冻融,经0.22微孔滤膜过滤, 以其冻融滤液作为抗原。取患者自体外周血,分离单个核细胞,加入上述抗原及抗CD3单克隆抗体125 ng/ml,5% CO2,37℃培养24 h,然后加白细胞介素-2(IL-2) 100 U/ml,体外培养12 d。3 d传代1次。
, 百拇医药
1.1.2 靶细胞:以人胃癌细胞株BGC-823(军事医学科学院提供)作为靶细胞,该细胞株是具有抗NK活性及贴壁特点的传代生长细胞。经EDTA-Na消化、计数,将效应细胞与靶细胞按20∶1放入培养瓶中,5% CO2,37℃共同孵育,分别于30 min、1、2、4、6、8 h不同时间收集细胞。
1.2 电镜样品制备
1.2.1 透射电镜样品制备:将共同培养不同时间收集的细胞及单纯BGC-823细胞,离心500 g/min,5 min,先后用2.5%戊二醛4℃固定和1%OsO4固定,常规脱水,Epon812包埋,LKB NOVA切片机超薄切片,枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色,JEM-1200EX透射电镜观察。
1.2.2 扫描电镜样品制备:将共同培养不同时间收集的细胞悬液,滴在载玻片上,待细胞沉淀后吸弃液体,以2.5%戊二醛4℃固定,以1%OsO4后固定,2%单宁酸染色,乙醇逐级脱水,临界点干燥,离子溅射镀金,H-450扫描电镜观察。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 透射电镜观察:CTL体积小,与外周血淋巴细胞结构相似,核圆形或椭圆形,核异染色质聚集,胞浆中细胞器很少,仅有散在的游离核糖体及很少的线粒体。BGC-823细胞体积大,呈多角形彼此紧贴在一起,核大而圆,可见双核,核内无明显异染色质存在,胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,细胞表面可见微绒毛状突起。在效、靶细胞共同培养1和2 h后靶细胞彼此分离,变成圆形,细胞表面突起增多,并可见以下现象:①CTL与BGC-823细胞紧密贴近;②CTL的伪足与靶细胞突起镶嵌;③CTL突起伸长紧贴靶细胞(图1),常常可见到几个CTL包围1个靶细胞。随着培养时间的延长,一部分靶细胞胞浆浓缩,电子密度增大,胞膜完整,细胞内出现许多密度较大的圆形团块,细胞明显变形;一部分靶细胞内出现大空泡,胞浆内细胞器结构不清。共同培养6和8 h后,一部分靶细胞核膜皱缩呈波浪状,异染色质明显增多,靠边或固缩,呈典型的半月形(图2)。部分靶细胞核碎裂,细胞裂解部分脱落形成有完整胞膜的凋亡小体;部分靶细胞则呈变性坏死状态,胞膜破裂,细胞内容物流出,出现许多散在的结构不清的细胞碎片(图3)。CTL出现巨大伪足,细胞器增多,以线粒体为主。
, http://www.100md.com
2.2 扫描电镜观察:CTL体积小呈球形,表面较光滑,而BGC-823细胞体积大,表面有许多小突起。当效、靶细胞共同培养后,可见2～3个CTL紧贴BGC-823细胞(图4),一些CTL伸出伪足贴近靶细胞,而另一些CTL细胞的伪足包裹靶细胞。靶细胞表面出现许多圆形或不整形小孔,内容物流出,靶细胞呈镂空状。
图1 CTL紧贴靶细胞,细胞突起伸向靶细胞(B)(透射电镜)
图2 靶细胞凋亡,染色质呈半月形(透射电镜)
, http://www.100md.com 图3 靶细胞溶解坏死(↑)(透射电镜)
图4 CTL包围靶细胞(B)(扫描电镜)
Figure 1 CTL surrounded target cells closly and CTL projected to target cells(B)(TEM)
Figure 2 Apoptosis of target cells with semi-lunar shape of chromatin(TEM)
Figure 3 Dissolution and necrosis of target cells(↑)(TEM)
Figure 4 CTL surrounded target cells(B)(TEM)
, 百拇医药
3 讨论
CTL杀伤靶细胞的过程可概括为5步:①CTL识别靶细胞,②CTL与靶细胞结合,③靶细胞发生变化,④靶细胞死亡,⑤CTL再循环〔2〕。本研究通过透射电镜及扫描电镜观察效应细胞与靶细胞共同培养后,效应细胞很快靠近靶细胞,胞体与胞体密切相贴或效应细胞伸出伪足,将靶细胞包围,或紧贴靶细胞膜,有插入靶细胞的趋势。随之靶细胞发生一系列变化,例如:靶细胞膜不完整,细胞表面出现许多小孔,胞浆浓缩,核内异染色质增多,边化,核固缩,碎裂,细胞裂解-细胞凋亡。目前认为CTL细胞通常表现Fas和穿孔素介导的机制使靶细胞DNA断裂致细胞死亡〔3〕。导致靶细胞发生这种变化通过以下两条途径完成:一是CTL表面的Fas配体与靶细胞膜上的Fas分子相互作用,交叉连接细胞内的“死亡位点”(death domain)〔4,5〕 ,二是CTL产生的穿孔素作用到靶细胞膜使其完整性破坏,表面形成小孔,CTL通过这些小孔把自身的酶成份颗粒酶-B(granzyme B)注入靶细胞,并在Ca2+参与下启动靶细胞凋亡信号,使靶细胞DNA裂解而发生凋亡〔6〕,凋亡细胞及凋亡小体可被邻近细胞吞噬。部分靶细胞表现为细胞肿胀,细胞器结构不清,破碎,核肿胀,胞膜不完整,内容物流出,细胞溶解坏死。这是由于CTL与靶细胞TCR接触而识别抗原, 通过CD3分子传导信号 ,从而活化磷脂酶C,使胞浆内Ca2+升高,激活蛋白酶C,通过穿孔素形成的小孔将溶细胞介质注入靶细胞,使靶细胞溶解〔7〕。本文不仅观察到细胞死亡的两种方式,还发现CTL与靶细胞共同孵育后,CTL胞浆内细胞器增多,以线粒体为主,这些形态表现可能与CTL与靶细胞作用后,功能活跃,主动进攻靶细胞需大量耗能有关。本研究结果提供了CTL杀伤靶细胞的形态学依据。(本文图见插图第1页)
, 百拇医药
参考文献
1.Pamela MP,John RO,Refeat MS,et al.Natural killer-sensitive targets stimulate production of TNF-α but not TNF-β(lymphotoxin) by highly purified human peripheral blood large granular lymphocytes.J Immunol,1986,137(8):2592
2.Lisa JB,Lof L,Patrik R,et al.Increased activity of L-type Ca2+ channels exposed to serum from patients with type I diabetes.Science,1993,261(5117):86
3.Stalder T,Hahn S,Erb P.Fas antigen is the major target molecule for CD+4 T cell-mediated cytotoxicity.J Immunol.1994,152(2):1127
, http://www.100md.com
4.Christoph R.Pro-oxidats and mitochondrial Ca2+ their relationship to apoptosis and oncogenesis.FEBS Lett,1993,325(1～2):104
5.Lianfa S,Chin Minkan,James CP,et al.Purfication of three cytotoxic lymphocyte granule serine proteinase that induce apoptosis through distinct substrate and target cell interactions.J Exp Med,1992,176:1521
6.John WS,Lishan S,Pierre HK.Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leakemia cells expressing both cytolysin and granzyme A.Cell,1992,71:315
7.Bella F,Gideon B,Dalia R,et al.Effects of purified perforin and granzyme A from cytotoxic T lymphocytes on guinea pig ventricular myocytes.Cardiovasc Res,1994,28:643
(1998-10-26 收稿), http://www.100md.com
单位：韩彩丽 河北省医学科学院病理室(石家庄 050021)；阎蕴力 王凤荣 李淑荣 河北医科大学基础医学研究所；宋伟庆 河北医科大学第二医院外科
关键词：胃肿瘤；免疫学；T淋巴细胞，细胞毒性；免疫学；显微镜检查，电子
河北医科大学学报990102
摘要 目的 研究特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤胃癌细胞BGC-823的超微结构变化。方法 用22例患者的胃腺癌细胞反复冻融后的滤液,抗CD3单克隆抗体、白细胞介素-2(IL-2)与患者自体外周血淋巴细胞共同培养,体外诱导CTL,然后将CTL与BGC-823共同孵育,用电子显微镜观察CTL作用于BGC-823后的超微结构改变。结果 电镜观察可见CTL包围并破坏靶细胞,靶细胞凋亡的形态表现为异染色质浓缩呈特征性半月形帽状核,还可见靶细胞溶解坏死。结论 特异性CTL可使靶细胞凋亡,溶解而导致其死亡。
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中图号 R730.51;R735.2
ULTRASTRUCTURAL OBSERVATION ON
GASTRIC CARCINOMA CELLS EXPOSED
TO CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES
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Yan Yunli Wang Fengrong Li Shurong
Institute of Basic Medicine,Hebei Medical University
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ABSTRACT Objective To study ultrastructural changes of BGC-823 gastric cancer cells due to the killing effects of the specific cytotoxic T lymphocytes(CTL).Methods The CTLs were induced by repeated freeze-thawed extracts of gastric cancer cells from 22 patients with gastric carcinoma and anti-CD3 monoclonal antibody as well as recombinant interleukin-2 in vitro.The CTLs were then cultured with target cells BGC-823.Ultrastrutural changes of BGC-823 cells after CTL treatment were observed with electron microscope.Results The target cells were frequently surrounded and attacked by CTLs.Apoptotic changes,such as heterochromatin condensation with characteristic crescentic cap appearance and necrostic changes were found in BGC-823 cells.Conclusion The specific CTL killed target cells by inducing apoptosis and necrosis.
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MeSH stomach neoplasms/immunol;T-lymphocytes,cytotoxic/immunol;microscopy,electron
细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀瘤活性高,而且特异性强,因此日益受到人们的重视。不少学者对其杀伤靶细胞的机制进行了大量研究,认为CTL可诱导靶细胞凋亡或使其溶解坏死。本文应用透射电镜和扫描电镜观察,研究人CTL杀伤胃癌细胞的形态学基础,以进一步阐明其杀瘤机制。
1 材料与方法
1.1 效应细胞与靶细胞制备
1.1.1 效应细胞体外诱导:在无菌条件下取胃癌患者手术切除标本22例〔1〕,用胶原酶、DNA酶、透明质酸酶消化,分离胃癌细胞,低温(-30℃)反复冻融,经0.22微孔滤膜过滤, 以其冻融滤液作为抗原。取患者自体外周血,分离单个核细胞,加入上述抗原及抗CD3单克隆抗体125 ng/ml,5% CO2,37℃培养24 h,然后加白细胞介素-2(IL-2) 100 U/ml,体外培养12 d。3 d传代1次。
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1.1.2 靶细胞:以人胃癌细胞株BGC-823(军事医学科学院提供)作为靶细胞,该细胞株是具有抗NK活性及贴壁特点的传代生长细胞。经EDTA-Na消化、计数,将效应细胞与靶细胞按20∶1放入培养瓶中,5% CO2,37℃共同孵育,分别于30 min、1、2、4、6、8 h不同时间收集细胞。
1.2 电镜样品制备
1.2.1 透射电镜样品制备:将共同培养不同时间收集的细胞及单纯BGC-823细胞,离心500 g/min,5 min,先后用2.5%戊二醛4℃固定和1%OsO4固定,常规脱水,Epon812包埋,LKB NOVA切片机超薄切片,枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色,JEM-1200EX透射电镜观察。
1.2.2 扫描电镜样品制备:将共同培养不同时间收集的细胞悬液,滴在载玻片上,待细胞沉淀后吸弃液体,以2.5%戊二醛4℃固定,以1%OsO4后固定,2%单宁酸染色,乙醇逐级脱水,临界点干燥,离子溅射镀金,H-450扫描电镜观察。
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2 结果
2.1 透射电镜观察:CTL体积小,与外周血淋巴细胞结构相似,核圆形或椭圆形,核异染色质聚集,胞浆中细胞器很少,仅有散在的游离核糖体及很少的线粒体。BGC-823细胞体积大,呈多角形彼此紧贴在一起,核大而圆,可见双核,核内无明显异染色质存在,胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,细胞表面可见微绒毛状突起。在效、靶细胞共同培养1和2 h后靶细胞彼此分离,变成圆形,细胞表面突起增多,并可见以下现象:①CTL与BGC-823细胞紧密贴近;②CTL的伪足与靶细胞突起镶嵌;③CTL突起伸长紧贴靶细胞(图1),常常可见到几个CTL包围1个靶细胞。随着培养时间的延长,一部分靶细胞胞浆浓缩,电子密度增大,胞膜完整,细胞内出现许多密度较大的圆形团块,细胞明显变形;一部分靶细胞内出现大空泡,胞浆内细胞器结构不清。共同培养6和8 h后,一部分靶细胞核膜皱缩呈波浪状,异染色质明显增多,靠边或固缩,呈典型的半月形(图2)。部分靶细胞核碎裂,细胞裂解部分脱落形成有完整胞膜的凋亡小体;部分靶细胞则呈变性坏死状态,胞膜破裂,细胞内容物流出,出现许多散在的结构不清的细胞碎片(图3)。CTL出现巨大伪足,细胞器增多,以线粒体为主。
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2.2 扫描电镜观察:CTL体积小呈球形,表面较光滑,而BGC-823细胞体积大,表面有许多小突起。当效、靶细胞共同培养后,可见2～3个CTL紧贴BGC-823细胞(图4),一些CTL伸出伪足贴近靶细胞,而另一些CTL细胞的伪足包裹靶细胞。靶细胞表面出现许多圆形或不整形小孔,内容物流出,靶细胞呈镂空状。
图1 CTL紧贴靶细胞,细胞突起伸向靶细胞(B)(透射电镜)
图2 靶细胞凋亡,染色质呈半月形(透射电镜)
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图4 CTL包围靶细胞(B)(扫描电镜)
Figure 1 CTL surrounded target cells closly and CTL projected to target cells(B)(TEM)
Figure 2 Apoptosis of target cells with semi-lunar shape of chromatin(TEM)
Figure 3 Dissolution and necrosis of target cells(↑)(TEM)
Figure 4 CTL surrounded target cells(B)(TEM)
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3 讨论
CTL杀伤靶细胞的过程可概括为5步:①CTL识别靶细胞,②CTL与靶细胞结合,③靶细胞发生变化,④靶细胞死亡,⑤CTL再循环〔2〕。本研究通过透射电镜及扫描电镜观察效应细胞与靶细胞共同培养后,效应细胞很快靠近靶细胞,胞体与胞体密切相贴或效应细胞伸出伪足,将靶细胞包围,或紧贴靶细胞膜,有插入靶细胞的趋势。随之靶细胞发生一系列变化,例如:靶细胞膜不完整,细胞表面出现许多小孔,胞浆浓缩,核内异染色质增多,边化,核固缩,碎裂,细胞裂解-细胞凋亡。目前认为CTL细胞通常表现Fas和穿孔素介导的机制使靶细胞DNA断裂致细胞死亡〔3〕。导致靶细胞发生这种变化通过以下两条途径完成:一是CTL表面的Fas配体与靶细胞膜上的Fas分子相互作用,交叉连接细胞内的“死亡位点”(death domain)〔4,5〕 ,二是CTL产生的穿孔素作用到靶细胞膜使其完整性破坏,表面形成小孔,CTL通过这些小孔把自身的酶成份颗粒酶-B(granzyme B)注入靶细胞,并在Ca2+参与下启动靶细胞凋亡信号,使靶细胞DNA裂解而发生凋亡〔6〕,凋亡细胞及凋亡小体可被邻近细胞吞噬。部分靶细胞表现为细胞肿胀,细胞器结构不清,破碎,核肿胀,胞膜不完整,内容物流出,细胞溶解坏死。这是由于CTL与靶细胞TCR接触而识别抗原, 通过CD3分子传导信号 ,从而活化磷脂酶C,使胞浆内Ca2+升高,激活蛋白酶C,通过穿孔素形成的小孔将溶细胞介质注入靶细胞,使靶细胞溶解〔7〕。本文不仅观察到细胞死亡的两种方式,还发现CTL与靶细胞共同孵育后,CTL胞浆内细胞器增多,以线粒体为主,这些形态表现可能与CTL与靶细胞作用后,功能活跃,主动进攻靶细胞需大量耗能有关。本研究结果提供了CTL杀伤靶细胞的形态学依据。(本文图见插图第1页)
, 百拇医药
参考文献
1.Pamela MP,John RO,Refeat MS,et al.Natural killer-sensitive targets stimulate production of TNF-α but not TNF-β(lymphotoxin) by highly purified human peripheral blood large granular lymphocytes.J Immunol,1986,137(8):2592
2.Lisa JB,Lof L,Patrik R,et al.Increased activity of L-type Ca2+ channels exposed to serum from patients with type I diabetes.Science,1993,261(5117):86
3.Stalder T,Hahn S,Erb P.Fas antigen is the major target molecule for CD+4 T cell-mediated cytotoxicity.J Immunol.1994,152(2):1127
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4.Christoph R.Pro-oxidats and mitochondrial Ca2+ their relationship to apoptosis and oncogenesis.FEBS Lett,1993,325(1～2):104
5.Lianfa S,Chin Minkan,James CP,et al.Purfication of three cytotoxic lymphocyte granule serine proteinase that induce apoptosis through distinct substrate and target cell interactions.J Exp Med,1992,176:1521
6.John WS,Lishan S,Pierre HK.Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leakemia cells expressing both cytolysin and granzyme A.Cell,1992,71:315
7.Bella F,Gideon B,Dalia R,et al.Effects of purified perforin and granzyme A from cytotoxic T lymphocytes on guinea pig ventricular myocytes.Cardiovasc Res,1994,28:643
(1998-10-26 收稿), http://www.100md.com