急性白血病患者血清α-L-岩藻糖苷酶的变化
作者：吴霜 郭树森 白书阁
单位：
关键词：
许多恶性肿瘤细胞有尿激酶受体 许多恶性肿瘤细胞有尿激酶受体(Urokinase receptor,uPAR CD87)高表达，并参与其浸润、转移等过程。进一步研究表明，uPAR还参与肿瘤细胞的增殖、分化和信号传导等[1]。近几年来的研究表明，部分白血病细胞也有uPAR的表达[2]。我们用流式细胞术检测了93例成人急性髓系白血病uPAR表达，并分析了uPAR表达与临床表现及预后的关系。另外，还检测了不同的白血病细胞株在诱导分化过程中的uPAR表达的改变。
材料和方法
1 临床资料 急性髓系白血病93例均为本院确诊的初治患者。男58例，女35例，年龄15～69岁，按FAB分型：M1 11例，M2 40例，M3 16例，M4 9例，M5 15例，M6 2例；急性淋巴细胞白血病患者30例中L1 20例，L2 7例，L3 3例。
, 百拇医药
2 主要试剂和材料 uPAR单抗为America Diagnostic公司产品。FITC-羊抗鼠单抗为邦定公司产品。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品。氟波酯(PMA)为Sigma公司产品，以无水乙醇配制成浓度为10μg/ml的贮存液，置-20℃保存。
3 流式细胞术检测方法 取骨髓用淋巴细胞分离液，常规分离制备单个核细胞悬液。0.01mol/L PBS洗涤，台盼蓝活细胞计数>0.95。10%兔血清孵育30分钟以封闭Fc受体。取2×106/ml细胞悬液
100μl，加uPAR单抗20μl(1∶50稀释)，室温孵育30分钟，阴性对照加鼠IgG，经PBS洗涤后，加FITC-羊抗鼠二抗20μl(1∶10稀释)，室温下避光30分钟，经PBS洗涤后流式细胞仪(Coulter公司，Epics XL型)检测。每例检测5000～10000个细胞，阳性判断标准为荧光阳性细胞>20%。培养白血病细胞株不经淋巴细胞分离液分离，余检测步骤相同。
, 百拇医药
4 白血病细胞株的诱导分化 白血病细胞株HL-60，U937，K562细胞由本所细胞生物学室提供，悬浮于RPMI 1640培养液(含15%胎牛血清)，分别加入PMA终浓度为30ng/ml。细胞起始密度为2×105/ml，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱，培养5天，分别于1，3，5天，取部分细胞观察细胞形态改变、硝基四氮唑蓝(NBT)还原反应，并用流式细胞术检测其uPAR表达的改变。
5 细胞形态观察及NBT还原试验 U937、K562、HL-60细胞经PMA作用1，3，5天后取部分培养细胞涂片，Wright’s染色，光镜下观察形态。部分培养细胞悬液加入等量0.2% NBT Hank’s液(无Ca2+，Mg2+)混匀后，37℃孵育30分钟离心制片，Wright’s染色，计数200个细胞中阳性细胞数。
6 统计学检验 采用t及χ2检验。
, 百拇医药
结果
1 临床病例uPAR表达检测 11例M1中2例表达阳性(18%)，40例M2中20例表达阳性(50%)，16例M3中11例阳性(68.7%)，9例M4中6例阳性，15例M5中13例阳性(86.7%)，2例M6及30例 ALL均为阴性。
2 髓系白血病uPAR表达与临床表现及预后的关系 见表1。
表1 uPAR表达与临床表现预后的关系
组别
例数
髓外浸润
(%)
, 百拇医药
白细胞计数
(×109/L)
出血
CR率
(%)
uPAR阳性
52
75.0
55.4±56.1
53.2
48.0
uPAR阴性
41
, 百拇医药
26.8
25.7±30.7
41.5
75.6
P值
<0.01
<0.01
>0.05
<0.01
3 U937，HL-60，K562细胞经PMA作用5天后，大部分成为贴壁细胞，形态向单核-巨噬细胞转变。NBT还原率的改变见图1。HL-60，K562细胞uPAR表达改变见图2。U937细胞在未经PMA作用前即已有(92.5±4.2)%的阳性表达率，故作用主要表现为荧光强度的改变，见图3。
, 百拇医药
图1 PMA诱导后NBT还原率的改变 图2 PMA诱导后uPAR表达的改变
图3 PMA诱导后U937细胞uPAR表达荧光强度的改变
讨论
Plesner等[2]检测了27例急性髓系白血病，其中12例(44.4%)为阳性表达，在ALL未见uPAR表达。本组93例急性髓系白血病中52例(55.9%)uPAR表达阳性，而30例急性淋巴细胞白血病均为阴性表达。说明uPAR可作为急性白血病细胞分型的指标之一。
Plesner等[2]的结果表明M5多见uPAR的表达，而M5往往有肝、脾、皮肤、粘膜等髓外组织浸润表现。因此，推测白血病细胞uPAR表达与其脱离骨髓进入外周血循环以及对髓外组织的浸润有关。本研究结果表明，uPAR表达阳性组发生髓外浸润的比例及外周血白细胞数明显高于uPAR表达阴性组，uPAR阳性组的CR率明显低于阴性组。因此，uPAR表达与髓系白血病的临床表现，生物学特性有关，可作为判断预后的指标之一。另外，Frade[3]曾报道在急性髓系白血病患者血浆尿激酶增高与出血倾向有关。本研究结果表明白血病细胞由于uPAR与出血无明显关系。说明白血病细胞由于表达uPAR而使其细胞表面纤溶活性增高主要与其浸润能力有关。
, 百拇医药
本研究结果表明，U937、HL-60、K562细胞经PMA诱导分化后uPAR表达增加，而且与分化程度成正比。说明uPAR可作为髓系白血病细胞诱导分化较好的指标。另外，Nustrat等[4]的研究表明，在PMA诱导HL-60细胞分化过程中，uPA可促进其分化，而uPA单抗可抑制PMA的诱导分化作用。因此，uPAR在诱导细胞分化过程中的作用，尚有待进一步的研究。
本课题受国家教委留学回国人员科研基金(96-644)及苏州医学院青年科技基金资助
参考文献
[1] Dan Ф K, Behrendt N, Brunner N, et al. The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion. Fibrinolysis, 1994, 8:189-203.
, http://www.100md.com
[2] Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M, et al. Expression of the receptor for urokinase-type plasminogen activation in normal and neoplastic blood cells and hematopoietic tissue. Am J Clin Pathol, 1994, 102:835-841.
[3] Frade LJG, Sureda A, Torrado MC, et al. High plasma urokinase-type plasminogen activator levels are present in patients with acute nonlymphoblastic leukemia. Acta Haemotol, 1992;88:7-10.
[4] Nusrat AR, Harold A, Chapman JR. An autocrine role for urokinase in phorbol ester-mediated differentiation of myeloid cell lines. J Clin Invest, 1991, 87:1091-1097.
收稿：1998-02-02 修回：1998-05-11
(校对：张吉贤), 百拇医药
单位：
关键词：
许多恶性肿瘤细胞有尿激酶受体 许多恶性肿瘤细胞有尿激酶受体(Urokinase receptor,uPAR CD87)高表达，并参与其浸润、转移等过程。进一步研究表明，uPAR还参与肿瘤细胞的增殖、分化和信号传导等[1]。近几年来的研究表明，部分白血病细胞也有uPAR的表达[2]。我们用流式细胞术检测了93例成人急性髓系白血病uPAR表达，并分析了uPAR表达与临床表现及预后的关系。另外，还检测了不同的白血病细胞株在诱导分化过程中的uPAR表达的改变。
材料和方法
1 临床资料 急性髓系白血病93例均为本院确诊的初治患者。男58例，女35例，年龄15～69岁，按FAB分型：M1 11例，M2 40例，M3 16例，M4 9例，M5 15例，M6 2例；急性淋巴细胞白血病患者30例中L1 20例，L2 7例，L3 3例。
, 百拇医药
2 主要试剂和材料 uPAR单抗为America Diagnostic公司产品。FITC-羊抗鼠单抗为邦定公司产品。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品。氟波酯(PMA)为Sigma公司产品，以无水乙醇配制成浓度为10μg/ml的贮存液，置-20℃保存。
3 流式细胞术检测方法 取骨髓用淋巴细胞分离液，常规分离制备单个核细胞悬液。0.01mol/L PBS洗涤，台盼蓝活细胞计数>0.95。10%兔血清孵育30分钟以封闭Fc受体。取2×106/ml细胞悬液
100μl，加uPAR单抗20μl(1∶50稀释)，室温孵育30分钟，阴性对照加鼠IgG，经PBS洗涤后，加FITC-羊抗鼠二抗20μl(1∶10稀释)，室温下避光30分钟，经PBS洗涤后流式细胞仪(Coulter公司，Epics XL型)检测。每例检测5000～10000个细胞，阳性判断标准为荧光阳性细胞>20%。培养白血病细胞株不经淋巴细胞分离液分离，余检测步骤相同。
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4 白血病细胞株的诱导分化 白血病细胞株HL-60，U937，K562细胞由本所细胞生物学室提供，悬浮于RPMI 1640培养液(含15%胎牛血清)，分别加入PMA终浓度为30ng/ml。细胞起始密度为2×105/ml，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱，培养5天，分别于1，3，5天，取部分细胞观察细胞形态改变、硝基四氮唑蓝(NBT)还原反应，并用流式细胞术检测其uPAR表达的改变。
5 细胞形态观察及NBT还原试验 U937、K562、HL-60细胞经PMA作用1，3，5天后取部分培养细胞涂片，Wright’s染色，光镜下观察形态。部分培养细胞悬液加入等量0.2% NBT Hank’s液(无Ca2+，Mg2+)混匀后，37℃孵育30分钟离心制片，Wright’s染色，计数200个细胞中阳性细胞数。
6 统计学检验 采用t及χ2检验。
, 百拇医药
结果
1 临床病例uPAR表达检测 11例M1中2例表达阳性(18%)，40例M2中20例表达阳性(50%)，16例M3中11例阳性(68.7%)，9例M4中6例阳性，15例M5中13例阳性(86.7%)，2例M6及30例 ALL均为阴性。
2 髓系白血病uPAR表达与临床表现及预后的关系 见表1。
表1 uPAR表达与临床表现预后的关系
组别
例数
髓外浸润
(%)
, 百拇医药
白细胞计数
(×109/L)
出血
CR率
(%)
uPAR阳性
52
75.0
55.4±56.1
53.2
48.0
uPAR阴性
41
, 百拇医药
26.8
25.7±30.7
41.5
75.6
P值
<0.01
<0.01
>0.05
<0.01
3 U937，HL-60，K562细胞经PMA作用5天后，大部分成为贴壁细胞，形态向单核-巨噬细胞转变。NBT还原率的改变见图1。HL-60，K562细胞uPAR表达改变见图2。U937细胞在未经PMA作用前即已有(92.5±4.2)%的阳性表达率，故作用主要表现为荧光强度的改变，见图3。
, 百拇医药
图1 PMA诱导后NBT还原率的改变 图2 PMA诱导后uPAR表达的改变
图3 PMA诱导后U937细胞uPAR表达荧光强度的改变
讨论
Plesner等[2]检测了27例急性髓系白血病，其中12例(44.4%)为阳性表达，在ALL未见uPAR表达。本组93例急性髓系白血病中52例(55.9%)uPAR表达阳性，而30例急性淋巴细胞白血病均为阴性表达。说明uPAR可作为急性白血病细胞分型的指标之一。
Plesner等[2]的结果表明M5多见uPAR的表达，而M5往往有肝、脾、皮肤、粘膜等髓外组织浸润表现。因此，推测白血病细胞uPAR表达与其脱离骨髓进入外周血循环以及对髓外组织的浸润有关。本研究结果表明，uPAR表达阳性组发生髓外浸润的比例及外周血白细胞数明显高于uPAR表达阴性组，uPAR阳性组的CR率明显低于阴性组。因此，uPAR表达与髓系白血病的临床表现，生物学特性有关，可作为判断预后的指标之一。另外，Frade[3]曾报道在急性髓系白血病患者血浆尿激酶增高与出血倾向有关。本研究结果表明白血病细胞由于uPAR与出血无明显关系。说明白血病细胞由于表达uPAR而使其细胞表面纤溶活性增高主要与其浸润能力有关。
, 百拇医药
本研究结果表明，U937、HL-60、K562细胞经PMA诱导分化后uPAR表达增加，而且与分化程度成正比。说明uPAR可作为髓系白血病细胞诱导分化较好的指标。另外，Nustrat等[4]的研究表明，在PMA诱导HL-60细胞分化过程中，uPA可促进其分化，而uPA单抗可抑制PMA的诱导分化作用。因此，uPAR在诱导细胞分化过程中的作用，尚有待进一步的研究。
本课题受国家教委留学回国人员科研基金(96-644)及苏州医学院青年科技基金资助
参考文献
[1] Dan Ф K, Behrendt N, Brunner N, et al. The urokinase receptor: protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion. Fibrinolysis, 1994, 8:189-203.
, http://www.100md.com
[2] Plesner T, Ralfkiaer E, Wittrup M, et al. Expression of the receptor for urokinase-type plasminogen activation in normal and neoplastic blood cells and hematopoietic tissue. Am J Clin Pathol, 1994, 102:835-841.
[3] Frade LJG, Sureda A, Torrado MC, et al. High plasma urokinase-type plasminogen activator levels are present in patients with acute nonlymphoblastic leukemia. Acta Haemotol, 1992;88:7-10.
[4] Nusrat AR, Harold A, Chapman JR. An autocrine role for urokinase in phorbol ester-mediated differentiation of myeloid cell lines. J Clin Invest, 1991, 87:1091-1097.
收稿：1998-02-02 修回：1998-05-11
(校对：张吉贤), 百拇医药