呼吸道合胞病毒PCR序列分析方法的建立和应用*
作者：陈杭薇 钱桂生 邬光惠 李继成 尤兰华
单位：陈杭薇 钱桂生：第三军医大学新桥医院呼吸科研究所，重庆 400037；邬光惠：北京军区总医院肝病研究所，北京 100700；李继成 尤兰华：北京军区总医院呼吸科
关键词：呼吸道合胞病毒；PCR；序列分析
军医进修学院学报990101 摘要 目的：探讨呼吸道合胞病毒cDNA(RSV cDNA)序列分析的方法。方法：将PCR扩增与核酸序列分析技术相结合，以γ32P-ATP标记T7Promoter为测序引物，Taq DNA聚合酶直接测序。结果：测序梯清晰，可读性好。RSV NS和N基因区虽较稳定，但仍有颠换突变。结论：RSV的变异性决定了它对人类的反复感染，PCR测序方法较简便，在临床标本的检测和变异的观察中有重要意义。
中国图书资料分类法分类号 R56
, 百拇医药
The establishment and application of themethod to respiratorysyncytialVirus polymerase chain reactionsequencingstrategy
Chenhangwei, Qian Guisheng,Wu Guanghui, Li Jicheng, You Lanhua
(Respiratory Disease Research Institute, Xinqiaohospital, Thirdmilitary
Medical University, ChongQing, 400037)
Abstract Objective：Tosearch themethod of respiratorysyncytialVirus cDNA(RSV cDNA)sequencingstrategy.Methods:The polymerase chain reaction (PCR) was combined with thesequencingstrategy by using γ32P-ATP labeled T7 Promoter assequencing primer and the thermostable DNA polymerose as directedsequencingstrategy.Results：Thesequencing ladder was clear and readable. Although NS、N genes of RSV were ratherstable, there werestill exchangingmutations.Conclusion:The PCRsequencingstrategy is asimple and reliablemethod for detecting RSV and itsVariability in patients with recurrent RSV infections.
, http://www.100md.com
Key words respiratorysyncytialVirus; PCR;sequencingstrategy
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病因〔1，2〕，也是成人急性呼吸道感染的病原之一〔3，4〕。RSV属副粘病毒科，肺炎病毒属，是有包膜的单链负股RNA病毒〔5，6〕。对RSV临床检测中基因扩增产物的鉴定，流行病学研究中基因分型的验证和变异的观察，在一定程度上要依赖RSV cDNA序列分析。近来，国外学者建立了PCR直接序列分析方法〔7〕，将PCR扩增与核酸序列分析技术相结合，完成序列分析过程。为探讨该方法在RSV检测中应用的可能性，将此方法改良后引入RSV的研究中，发现其具有一定的实用性与应用前景。
1 材料和方法
1.1 引物设计和反转录(RT)-PCR扩增 参照文献〔6，8〕设计两对引物，行反转录-套式PCR〔9〕。
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1.2 单链构象多态性分析(SSCP)
1.2.1 SSCP电泳 取 5μl RT-PCR扩增的产物，与等量变性上样缓冲液混匀，加 1 滴石蜡油，95°C变性 5min，立即置冰水浴 5min，然后上样于已制备好的 8% 聚丙烯酰胺凝胶上，40V 8°C 条件下电泳 5h。
1.2.2 银染色 取下凝胶，固定 1h，0.1% AgNO3液染色 30min，2.5% Na2CO3液显色至条带清晰，用 1% 乙酸终止反应，水洗干净判断结果(图 1)。
左：RSV 中：Marker 右：1296
图 1 与RSV相比，1296显示细小的变异常带(SSCP)
, 百拇医药
1.3 PCR产物纯化 50μl PCR产物用 1.2% 低溶点琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下所需片段条带，-20°C过液，PARA膜包裹挤出凝胶中液体，移入EP管中，常规酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70% 乙醇洗 3 遍，抽干后复溶于 10μl水。
1.4 DNA重组 1.5ml EP管中加入载体pTAg 1μl，以上PCR纯化物 6μl，10×连接缓冲液 1μl，T4DNA连接酶 2U，加去离子水至总体积 10μl，16°C过夜。再将连接的重组质粒转化大肠杆菌。
1.5 重组质粒的提取、纯化和鉴定
1.5.1 提取 从 37°C 培养过夜的大肠杆菌受体菌平板中用无菌牙签挑取单个菌落，转到含 3.5ml LB培养液的试管，37°C 振摇过夜。次日取 2ml菌液置于 EP管中，8000g×5min离心后弃上清，顺序应用Tris-HCL、NaOH-SDS以及NaAC液提取质粒，再次离心后，转移上清于另一EP管中，加等体积异丙醇，室温 10min后离心，去上清，70% 乙醇洗 3 遍，真空抽干，复溶于去离子水 50μl。
, 百拇医药
1.5.2 纯化 以上提取质粒，加 10mg/ml RNA酶 3μl，37°C 30min。加去离子水至总体积 200μl，酚/氯仿抽提 2 次，取上清转移另一EP管中。再加无水乙醇、NH4AC、糖原-20°C过夜沉淀，离心去上清，70% 乙醇洗 3 遍，抽干后去离子水 30μl复溶。
1.5.3 鉴定 限制酶酶切分析。DNA质粒 5μl，10×缓冲液4μl，HindⅢ 2μl，EcoR 12μl，加去离子水补至总体积 34μl，37°C 1h，1% 琼脂糖垂直电泳观察条带。
1.6 测序反应
1.6.1 测序引物标记 以上纯化质粒以T7 Promoter为测序引物，0.5ml EP管内加入引物 1μl，γ32P-ATP 1μl，T4多核苷酸激酶 1U，5×缓冲液 1μl，总量为 4μl。37 °C 30min后，55°C 5min使酶失活，-20 °C备用。
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1.6.2 测序反应 在EP管内加入模板 5μl，标记物 4μl，Taq DNA聚合酶 1.25U，10×缓冲液 3.5μl，再加去离子水至总体积 35μl，混匀。4 个分别含d/ddATP、dd CTP、d/ddGTP、d/ddTTP混合液 2μl的0.5ml离心管内各加此混合液 8μl，短暂离心，液体石蜡封顶，置于PCR扩增仪上 95°C 5min变性后进入循环，95°C 45s，58°C 45s，72°C 90s，30 个循环完毕后加 5μl终止液终止反应。电泳前 95°C 变性 5min，然后冰浴，立即上样，每孔约 7μl。
1.7 测序电泳及放射自显影。
2 结果
2.1 RSV RNA的RT-PCR扩增 经PT-套式PCR扩增后可获得 471 bp的RSV cDNA片段。
2.2 RSVsSCP分析 采集 1 例近期有感冒症状的肺癌患者鼻咽分泌物(1296)，应用RT-PCR扩增，得到RSV cDNA片段。1296与RSV病毒液相比有基本相同的粗而清晰的条带，但也有不相同位置的细小条带(图 1)。
, 百拇医药
2.3 RSV cDNA序列分析 经扩增产物DNA重组，大肠杆菌转化，克隆筛选鉴定，进一步提纯质粒行序列分析，结果发现有G-T颠换突变(图 2)。
图 2 呼吸道合胞病毒培养液(RSV)和患者鼻咽分泌物(1296)测序结果
1296与RSV比较，NS、N基因区有G-T置换突变
3 讨论
阐明RSV在感染过程中的变异对呼吸道病毒感染发病机制的了解会有认识上的飞跃。发现一种变异只能表明存在而已。而对不同群体所感染的RSV变异情况的了解需要一种较简便易行的序列分析方法。PCR序列分析方法可能满足这一要求。
本研究应用首都儿科研究所病毒室标准A型RSV作阳性对照，检测出了 1 例感冒的肺癌患者鼻咽分泌物中的RSV片段。SSCP分析结果显示患者标本与RSV液的基因序列大致相同，但又有小的变异的单链构型。测序结果与RSV阳性对照基因序列亦大致相同，仅发现其中三个碱基有差异，即两个C-T颠换，一个G-T颠换，图 2所示为G-T置换突变。患者标本与阳性对照大致相同但又不完全一致的结果显示了PCR测序的可靠性。
, 百拇医药
RSV的抗原变异主要存在于G蛋白〔10〕，而NS、N、F、P等蛋白则比较保守。本研究设计的引物部位位于NS和N基因之内，并参考一些国外文献报道的RSV序列完成，因此所扩增出的基因片段应该是相对稳定的，但是仍然检测出了变异。RSV的感染在儿童和免疫功能较低下的成人身上能够反复发生，其原因可能就在于此。
*“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，编号96M011
参考文献
[1]Haoqiang Z, Teresa CTP,Valerie BR et al.strain-specific reverse transcriptase PCR assay:means to distinguish candidateVaccine from wild-typestrains of respiratorysyncytialVirus. J Clinmicrobi, 1996，34∶334
, 百拇医药
[2]Van-Milaan AJ,sprengermJ, Rothbarth PH et al. Detection of respiratorysyncytialVirus by RNA-polymerase chain reaction and differentiation ofsubgroups with oligonucleotide probes. JmedVirol, 1994，44∶80
[3]Montagne JRL. RSV pneumonia, a community-acquired infection in adults. Lancet, 1997，349∶149
[4]陈杭薇，李继成，付丽萍 等.呼吸道合胞病毒在成人急性呼吸道感染患者中的分布.中华结核和呼吸杂志，1990，13∶348
[5]董继华，江汉珍，周生华 等.呼吸道合胞病毒G基因的扩增.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15∶355
, 百拇医药
[6]Johnson PR, Collins PL. The 1B(NS2), 1C(NS1) and N proteins ofhuman respiratorysyncytialVirus (RSV) of antigenicsubgroups A and B:sequence conservation and divergence with in RSV genomic RNA. J GenVirol，1989，70∶1539
[7]RaoVB,saunders NB. A rapid polymerase chain reaction directedsequencing atrategy using a thermostable DNA polymerase from thermus flavus. Gene, 1992，113∶17
[8]Freymuth F, Eugene G,Vabret A et al. Detection of respiratorysyncytialVirus by reverse transcription-PCR andhybridization with a DNA enzyme immunoassay. J Clinmicrobiol, 1995，33∶3352
[9]陈杭薇，邬光惠，李继成 等.反转录-聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测中的应用.军医进修学院学报，1997，18∶114
[10]Cane PA,matthews DA, Pringle CR. Identification ofVariable domains of the attachment (G) protein ofsubgroup A respiratorysyncytialViruses. J GenVirol, 1991，72∶2091
(1998—06—13收稿，1998—08—04修回), 百拇医药
单位：陈杭薇 钱桂生：第三军医大学新桥医院呼吸科研究所，重庆 400037；邬光惠：北京军区总医院肝病研究所，北京 100700；李继成 尤兰华：北京军区总医院呼吸科
关键词：呼吸道合胞病毒；PCR；序列分析
军医进修学院学报990101 摘要 目的：探讨呼吸道合胞病毒cDNA(RSV cDNA)序列分析的方法。方法：将PCR扩增与核酸序列分析技术相结合，以γ32P-ATP标记T7Promoter为测序引物，Taq DNA聚合酶直接测序。结果：测序梯清晰，可读性好。RSV NS和N基因区虽较稳定，但仍有颠换突变。结论：RSV的变异性决定了它对人类的反复感染，PCR测序方法较简便，在临床标本的检测和变异的观察中有重要意义。
中国图书资料分类法分类号 R56
, 百拇医药
The establishment and application of themethod to respiratorysyncytialVirus polymerase chain reactionsequencingstrategy
Chenhangwei, Qian Guisheng,Wu Guanghui, Li Jicheng, You Lanhua
(Respiratory Disease Research Institute, Xinqiaohospital, Thirdmilitary
Medical University, ChongQing, 400037)
Abstract Objective：Tosearch themethod of respiratorysyncytialVirus cDNA(RSV cDNA)sequencingstrategy.Methods:The polymerase chain reaction (PCR) was combined with thesequencingstrategy by using γ32P-ATP labeled T7 Promoter assequencing primer and the thermostable DNA polymerose as directedsequencingstrategy.Results：Thesequencing ladder was clear and readable. Although NS、N genes of RSV were ratherstable, there werestill exchangingmutations.Conclusion:The PCRsequencingstrategy is asimple and reliablemethod for detecting RSV and itsVariability in patients with recurrent RSV infections.
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Key words respiratorysyncytialVirus; PCR;sequencingstrategy
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病因〔1，2〕，也是成人急性呼吸道感染的病原之一〔3，4〕。RSV属副粘病毒科，肺炎病毒属，是有包膜的单链负股RNA病毒〔5，6〕。对RSV临床检测中基因扩增产物的鉴定，流行病学研究中基因分型的验证和变异的观察，在一定程度上要依赖RSV cDNA序列分析。近来，国外学者建立了PCR直接序列分析方法〔7〕，将PCR扩增与核酸序列分析技术相结合，完成序列分析过程。为探讨该方法在RSV检测中应用的可能性，将此方法改良后引入RSV的研究中，发现其具有一定的实用性与应用前景。
1 材料和方法
1.1 引物设计和反转录(RT)-PCR扩增 参照文献〔6，8〕设计两对引物，行反转录-套式PCR〔9〕。
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1.2 单链构象多态性分析(SSCP)
1.2.1 SSCP电泳 取 5μl RT-PCR扩增的产物，与等量变性上样缓冲液混匀，加 1 滴石蜡油，95°C变性 5min，立即置冰水浴 5min，然后上样于已制备好的 8% 聚丙烯酰胺凝胶上，40V 8°C 条件下电泳 5h。
1.2.2 银染色 取下凝胶，固定 1h，0.1% AgNO3液染色 30min，2.5% Na2CO3液显色至条带清晰，用 1% 乙酸终止反应，水洗干净判断结果(图 1)。
左：RSV 中：Marker 右：1296
图 1 与RSV相比，1296显示细小的变异常带(SSCP)
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1.3 PCR产物纯化 50μl PCR产物用 1.2% 低溶点琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下所需片段条带，-20°C过液，PARA膜包裹挤出凝胶中液体，移入EP管中，常规酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70% 乙醇洗 3 遍，抽干后复溶于 10μl水。
1.4 DNA重组 1.5ml EP管中加入载体pTAg 1μl，以上PCR纯化物 6μl，10×连接缓冲液 1μl，T4DNA连接酶 2U，加去离子水至总体积 10μl，16°C过夜。再将连接的重组质粒转化大肠杆菌。
1.5 重组质粒的提取、纯化和鉴定
1.5.1 提取 从 37°C 培养过夜的大肠杆菌受体菌平板中用无菌牙签挑取单个菌落，转到含 3.5ml LB培养液的试管，37°C 振摇过夜。次日取 2ml菌液置于 EP管中，8000g×5min离心后弃上清，顺序应用Tris-HCL、NaOH-SDS以及NaAC液提取质粒，再次离心后，转移上清于另一EP管中，加等体积异丙醇，室温 10min后离心，去上清，70% 乙醇洗 3 遍，真空抽干，复溶于去离子水 50μl。
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1.5.2 纯化 以上提取质粒，加 10mg/ml RNA酶 3μl，37°C 30min。加去离子水至总体积 200μl，酚/氯仿抽提 2 次，取上清转移另一EP管中。再加无水乙醇、NH4AC、糖原-20°C过夜沉淀，离心去上清，70% 乙醇洗 3 遍，抽干后去离子水 30μl复溶。
1.5.3 鉴定 限制酶酶切分析。DNA质粒 5μl，10×缓冲液4μl，HindⅢ 2μl，EcoR 12μl，加去离子水补至总体积 34μl，37°C 1h，1% 琼脂糖垂直电泳观察条带。
1.6 测序反应
1.6.1 测序引物标记 以上纯化质粒以T7 Promoter为测序引物，0.5ml EP管内加入引物 1μl，γ32P-ATP 1μl，T4多核苷酸激酶 1U，5×缓冲液 1μl，总量为 4μl。37 °C 30min后，55°C 5min使酶失活，-20 °C备用。
, http://www.100md.com
1.6.2 测序反应 在EP管内加入模板 5μl，标记物 4μl，Taq DNA聚合酶 1.25U，10×缓冲液 3.5μl，再加去离子水至总体积 35μl，混匀。4 个分别含d/ddATP、dd CTP、d/ddGTP、d/ddTTP混合液 2μl的0.5ml离心管内各加此混合液 8μl，短暂离心，液体石蜡封顶，置于PCR扩增仪上 95°C 5min变性后进入循环，95°C 45s，58°C 45s，72°C 90s，30 个循环完毕后加 5μl终止液终止反应。电泳前 95°C 变性 5min，然后冰浴，立即上样，每孔约 7μl。
1.7 测序电泳及放射自显影。
2 结果
2.1 RSV RNA的RT-PCR扩增 经PT-套式PCR扩增后可获得 471 bp的RSV cDNA片段。
2.2 RSVsSCP分析 采集 1 例近期有感冒症状的肺癌患者鼻咽分泌物(1296)，应用RT-PCR扩增，得到RSV cDNA片段。1296与RSV病毒液相比有基本相同的粗而清晰的条带，但也有不相同位置的细小条带(图 1)。
, 百拇医药
2.3 RSV cDNA序列分析 经扩增产物DNA重组，大肠杆菌转化，克隆筛选鉴定，进一步提纯质粒行序列分析，结果发现有G-T颠换突变(图 2)。
图 2 呼吸道合胞病毒培养液(RSV)和患者鼻咽分泌物(1296)测序结果
1296与RSV比较，NS、N基因区有G-T置换突变
3 讨论
阐明RSV在感染过程中的变异对呼吸道病毒感染发病机制的了解会有认识上的飞跃。发现一种变异只能表明存在而已。而对不同群体所感染的RSV变异情况的了解需要一种较简便易行的序列分析方法。PCR序列分析方法可能满足这一要求。
本研究应用首都儿科研究所病毒室标准A型RSV作阳性对照，检测出了 1 例感冒的肺癌患者鼻咽分泌物中的RSV片段。SSCP分析结果显示患者标本与RSV液的基因序列大致相同，但又有小的变异的单链构型。测序结果与RSV阳性对照基因序列亦大致相同，仅发现其中三个碱基有差异，即两个C-T颠换，一个G-T颠换，图 2所示为G-T置换突变。患者标本与阳性对照大致相同但又不完全一致的结果显示了PCR测序的可靠性。
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RSV的抗原变异主要存在于G蛋白〔10〕，而NS、N、F、P等蛋白则比较保守。本研究设计的引物部位位于NS和N基因之内，并参考一些国外文献报道的RSV序列完成，因此所扩增出的基因片段应该是相对稳定的，但是仍然检测出了变异。RSV的感染在儿童和免疫功能较低下的成人身上能够反复发生，其原因可能就在于此。
*“九五”军队医药卫生科研基金资助项目，编号96M011
参考文献
[1]Haoqiang Z, Teresa CTP,Valerie BR et al.strain-specific reverse transcriptase PCR assay:means to distinguish candidateVaccine from wild-typestrains of respiratorysyncytialVirus. J Clinmicrobi, 1996，34∶334
, 百拇医药
[2]Van-Milaan AJ,sprengermJ, Rothbarth PH et al. Detection of respiratorysyncytialVirus by RNA-polymerase chain reaction and differentiation ofsubgroups with oligonucleotide probes. JmedVirol, 1994，44∶80
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, 百拇医药
[6]Johnson PR, Collins PL. The 1B(NS2), 1C(NS1) and N proteins ofhuman respiratorysyncytialVirus (RSV) of antigenicsubgroups A and B:sequence conservation and divergence with in RSV genomic RNA. J GenVirol，1989，70∶1539
[7]RaoVB,saunders NB. A rapid polymerase chain reaction directedsequencing atrategy using a thermostable DNA polymerase from thermus flavus. Gene, 1992，113∶17
[8]Freymuth F, Eugene G,Vabret A et al. Detection of respiratorysyncytialVirus by reverse transcription-PCR andhybridization with a DNA enzyme immunoassay. J Clinmicrobiol, 1995，33∶3352
[9]陈杭薇，邬光惠，李继成 等.反转录-聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测中的应用.军医进修学院学报，1997，18∶114
[10]Cane PA,matthews DA, Pringle CR. Identification ofVariable domains of the attachment (G) protein ofsubgroup A respiratorysyncytialViruses. J GenVirol, 1991，72∶2091
(1998—06—13收稿，1998—08—04修回), 百拇医药