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编号:10240614
1,4萘醌和1,2萘醌化合物对肌质网钙通道Ryanodine受体的调节作用
http://www.100md.com 《航天医学与医学工程》 1999年第1期
     作者:夏若虹

    单位:武汉大学测试中心,武汉430072

    关键词:萘醌;钙通道(RyR);双相性行为

    航天医学与医学工程990110

    摘要:目的 研究萘醌-钙通道蛋白(NQ-RyR)的作用机制。方法 对NQ旋的1,4NQ、1,4NQ-2-sulfonate(1,4NQ2S)、1,2NQ、1,2NQ-4-sulfonate(1,2 NQ 4S)、2-CH3-1,4NQ和2-OH-1,4NQ等6种NQ与骨骼肌肌质网(SR)RyR的相互作用进行了观察和比较。结果 所有NQ都不同程度地激活钙通道引起钙流释放;1,4NQ、1,2NQ、1,2NQ、1,4NQ 2S和1,2NQ4S对RyR的调节表现出强烈的浓度依赖性的双相作用性;NQ通过氧化还原作用调控RyR的门控机制;NQ在氧化还原循环中产生的超氧等伴生物没有参与RyR的相互作用。结论 NQ对RyR的调控是通过氧化还原作用调节通道蛋白的门控状态。
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    中图分类号:Q582 文献标识码:A 文章编号:1002-0837(1999)01-0042-04

    The Modulation of 1,4NQs and 1,2NQs on Ryanodine Receptor in Sarcoplasmic Reticulum

    XIA Ruohong

    (Testing Center Wuhan Uniarsity,Wuhan 430000,China)

    Abstract:Objective To study the modulation mechanism of naphthoquinones(NQ) on ryanodine receptor(RyR) in sarcoplasmic reticulum.Methods The interactions of six naphthoquinones(1,4NQ,1,4NQ-2-sulfonate,1,2NQ-4-sulfonate,2-CH3-1,4 NQ and 2-OH-1,4 NQ) and rynodine reaptor in sarcoplasmic reticulum were observed and compared.Results All the NQs can activate the calcium release channel to some entent and induce Ca2+ transportation.The modulations of 1,4 NQ,1,2 NQ,1,4 NQ2S and 1,2 N are biphasic and depend on their concentrations.The mechanism of gating modulation depends on oxidation and reduction of NQ.The by-products of NQ during oxidation and reduction do not interact with RyR.Conclusion The modulation of NQ on RyR is realized by regulating the gating of RyR through oxidation and reduction.
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    Key words:naphthoquinones;calcium release channel(RyR);biphasic behavior.

    钙通道蛋白(RyR)以三种不同形式存在于动物大脑、神经、肌肉和动脉血管细胞等多种组织和器官中,并以相似的方式通过对内钙库的钙调动直接参与胞内Ca2+浓度的调节,从而调控着生物体的许多重要的生理和生化过程,并影响着细胞生命和细胞程序性死亡(apoptosis)[1,2]。由钙通道功能失常所导致的胞内[Ca2+]的空虚或沉积,可诱发一系列不可逆的生理生化变化而触发细胞和组织的病变。对RyR功能和对其门控机制的研究已成为当今此领域重要的课题。实验证明RyR能被许多物质所调节:或被激活,或被抑制。具有强烈氧化还原循环特性的醌类化合物,特别是萘醌(naphthoquinones,NQ),是这些调节剂中的特别的一类。一些NQ(如1,4NQ族)本身具有抑制肿瘤生长的效用,但实验中发现它们在毒性剂量下导致了细胞内钙大量外溢从而造成细胞不可逆的损伤,这说明它们能与钙通道发生作用从而导致了钙的反常调动;同时NQ也破坏了NADH-NAD,NADPH-NADP循环[3]。目前对这种NQ-RyR的作用机制尚不明晰。在本文中作者通过在美国Abramson钙通道实验室进行的一系列实验,首次对NQ族的1,4NQ, 1,4NQ-2-sulfonate (1,4NQ2S), 1,2NQ, 1,2NQ-4-sulfonate (1,2NQ4S), 2-CH3-1,4NQ和2-OH-1,4NQ等6种NQ与骨骼肌肌质网(SR)RyR的相互作用进行了观察和比较,并对其中的1,4NQ和1,2NQ做了更深入的研究。
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    方 法

    试剂和材料 醌类试剂,GSH,ATP,EGTA,antipyralazo III(APIII)等试剂及SOD,过氧化酶等酶类购于Sigma Chemical Co.。[3H]-ryanodine和ryanodine购于Du Port,其中[3H]-ryanodine的比放射活性为75~80μci/mmol。所有SR囊泡样品均根据MacLennan的方法由新西兰雄性白兔后肢及双侧背部骨肌(fast muscle)制备[4]。样品悬浮于含5 mM imidzazde的10%蔗糖溶液中(pH7.4),贮于-80℃。

    Ca2+运输实验 在以不同浓度的醌作为激活剂的条件下,测量最大Ca2+释放率。双波长(720~790 nm)动态Ca2+-光谱仪(8452A,Aewlett Packard)被用于检测溶液(0.2 mg/ml SR,10单位CP,约1 μg/mlCPK,200 μM APIII,100 mM KCl,20 mM Hepes,pH7.0)中游离Ca2+浓度的动态变化[5]。所用醌类试剂,酶类和GSH等被证明在此波段中对吸收信号无明显影响。加入1 mM Mg2+-ATPase触发囊泡对外钙的摄取,加入醌激发钙释放。
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    [3H]-ryanodine结合实验 [3H]-ryanodine 结合实验参照Pessah的方法进行[6]:0.5mg/ml的SR样品悬浮于实验液中(1 nM[3H]-ryanodine,14 nM ryanodine,250 μM KCL,15 μM NaCl,25 mM Hepes及10 μM CaCl2,pH 7.1)。不同的通道调节剂将根据要求以设定的浓度分别加入悬浮液, 37℃温育3 h,然后由气动过滤器过滤掉游离的Ryanodine。所得液体由同位素液闪计数器测量放射性活性。由于Ryanodine仅与开放态RyR结合,测得的放射活性则反映了呈开放态的RyR数。经非特异性标记样品由上述终溶液中加入200倍的ryanodine所获得。特异性标记总剂量由在终溶液中加入3 ml闪烁液而获得。所得数据经Sigma程序计算并绘出结合曲线。曲线的高度正比于每mg膜蛋白中开放态RyR的摩尔浓度。

    由于受到实验性质及样品条件限制,以上各Ryanodine结合曲线均由2~4组重复实验中最具代表性的单组数据绘制而成。
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    结 果

    利用双波长钙浓度动态光谱和[3H]-ryanodine结合等技术和方法,分别观察了以上6种NQ与兔骨肌SR囊泡的RyR相互作用,并对其作用形式和结果进行比较和分类,主要实验结果如下:

    1.所有的被考察的NQ均能不同程度地激活钙通道引起钙流释放(图1)。在实验室环境下,它们能不同程度地激发分离SR囊泡内存的Ca2+释放,其中1,4NQ类比1,2NQ类作用效果更明显。

    a.1,4NQ;b.1,4NQ+GSH;c.1,2NQ;d.1,4NQ 2S;e.1,2NQ4S;f.2-CH3-1,4 NQ;g.2-CH-1,4NQ;F.2-CH3-1,4NQ+GSH
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    图1 10μM萘醌化合物的钙释放率

    利用双波长光谱法测定试验悬浮液中的游离钙浓度(n=4,P<0.02)

    Fig.1 Ca2+ release rates for 10 μM naphthoquinones

    The experiments were carried out by a dual wave length spectrophotometer for the determination of free Ca2+ concentration in the test buffer (n=4,P<0.02)

    2.1,4NQ,1,2NQ,1,4NQ2S,和1,2 NQ4S对RyR的调节表现出强烈的浓度依赖性的双相作用性(图2)。低浓度的NQ提高了RyR的开放率(图2中特异结合值),高浓度的NQ(特别是1,2NQ类)降低了其开放率,其中1,2NQ的抑制浓度均低于相应的1,4NQ的抑制浓度。其余的两种醌双相性不明显,也不像上述四种萘醌那样能显著改变通道的开放率。
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    图2 在Ryanodine结合试验中萘醌根据与RyR的相互作用的不同可被分为两种类型

    每条曲线中的第一个数据点为对照(n=2,P<0.01)

    Fig.2 Two types of NQ interact with RyR in Ryanodine binding experiments

    The first point in each trace is for the controls.(n=2,P<0.01)

    3.NQ通过氧化还原作用调控RyR的门控机制。GSH对醌的前处理没有激发钙流释放(图1),也使半抑制浓度IC50从20 μM增加到>100 μM(图3)。
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    图3 GSH 降低了由1,4 NQ和1,2 NQ所产生的对ryanodine结合的抑制

    (n=3,P<0.01)

    Fig.3 GSH decreased the inhibition of ryanodine binding induced by 1,4 NQ and 1,2 NQ

    (n=3,P<0.01)

    4.NQ在氧化还原循环中产生的超氧等伴生物没有参与与RyR的相互作用。加入SOD和过氧化酶后的结果显示,它们并不对由NQ引起的钙外流产生明显的影响(数据省略)。

    分析与讨论

    在肌细胞的兴奋-收缩耦合(ECC)过程中,氧化还原调控机制非常重要。内源氧化剂的耗尽能改变ECC的特性,肌肉自发性的收缩活动加速了肌细胞中自由基的生成,同时激活的肌细胞能积累内源氧化剂和直接导致肌肉收缩运动的丧失。氧化还原机制是通过控制钙库的RyR的门控(gating)状态而实现对ECC的调控的。这种调控或是通过氧化还原环境的变化或是氧化剂直接与RyR上的活性巯基相互作用而实现。
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    由上述结果可知,所考察的NQ对RyR的调控通过氧化还原作用调节通道蛋白的门控状态。这些NQ可被分为两大类:单相性NQ和双相性NQ。2-CH3-1,4NQ和2-OH-1,4NQ属于前者,它们能激活RyR,表现为提高RyR的开放率并激发SR囊泡的钙流。其余四种属于后者,能双相性地调控RyR,表现为低浓度的NQ激活RyR而高浓度的NQ抑制RyR,其中1,2NQ族表现出更甚的抑制性。单相性的NQ仅能识别其激活部位,表现为调节钙的跨膜转运,但在ryanodine结合实验中对通道开放率的提高没有另一类明显;而双相性的NQ则能先后分别识别RyR上的激活和抑制部位,它们既能调节钙的转运也能在ryanodine结合实验中明显改变通道的门控状态。事实上进一步的实验表明,通道蛋白上的这两个活性部位是由巯基占据的(结果及分析已另行文)[7]。由此可知,NQ 可以通过激活细胞器上的钙通道而导致钙从内钙库外流,从而使胞内钙浓度升高。这意味着由此所导致的持续性高[Ca2+]将会改变胞内外的离子梯度,影响膜的离子通透性和其它离子通道的正常运转,从而破坏细胞正常的活动。对于第二类NQ,高剂量和作用时间的延长会使通道处于关闭状态。在这种状态下,细胞内由钙中介的所有生命活动都会受到抑制,从而细胞的活性也会因此降低。又由于NQ在氧化RyR上作用部位的巯基的同时也会消耗掉细胞内的内源性还原剂GSH,因此也会破坏胞内的氧化还原环境和电子传递链。目前还不清楚NQ的这些作用是否与其抑制瘤细胞的能力有着直接的关系,这方面尚待进行进一步的研究。
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    [致谢]感谢我的导师Janathan Abramsion的指导和帮助,我所有的工作和研究都是在他的指导下完成的。

    [参考文献]

    [1] Dulhunty AF,Junankar KR, Ahern GP et al. Ion channels in the sarcoplasmic reticulum of striated muscle[J]. Acta Physiol Scand,1996, 156:375~385

    [2] Kamishima T, McCarron JG. Regulation of the cytosolic Ca2+ concentration by Ca2+ stores in single smooth muscle cells from rat cerebral arteries[J]. J Physiol,1997, 501: 497~508
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    [3] Smith MT, Evans CG, Thor H et al.quinone-induced oxidation injury to cells and tissues[M]. oxidative stress. academic press,1985: 91~113

    [4] Maclennan DH. Purification and properties of an adenosine triphosphatase from sarcoplasmic reticulum[J].J Biol Chem,1970, 245: 4508~4518

    [5] Abramson JJ, Buck E, Salama G et al. Mechanism of anthraquinone-induced calcium release form skeletal muscle sarcoplasmic reticulum[J].J Biol Chem, 1988, 263: 19750~19758
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    [6] Pessah IN, Stambuk RA,Casida JE. Ca2+-activated ryanodine bnding: mechanism of sensitivity and intensity modulation by Mg2+, caffeine,and adenine nucleotides[J].Mol Pharmacol,1986, 31: 232~238

    [7] 夏若虹.1,4 Naphthoguinone与免骨肌肌质网钙通道相互作用表现出的双相特性.生物物理学报,1998,14(3):429~436

    收稿日期:1998-04-14, 百拇医药