骨髓涂片微量融合基因RNA的RT-PCR分析
作者：王阳 沈美凤 王玮 陆定伟 薛永权 陈子兴
单位：苏州医学院第一附属医院，苏州215006
关键词：骨髓；逆转录-聚合酶链反应；融合基因；玻璃涂片
骨髓涂片微量融合基因RNA的RT摘要 探讨利用常规储藏的骨髓涂片进行RNA分析的可能性。利用RT-PCR法对6例具有不同融合基因的白血病患者的RNA转录本进行检测。6例标本均获阳性结果。因此，对于保存的血片/病理切片进行特殊基因的RT-PCR检测切实可行。
Analysis of fusion genes RNA from glass slide smears using RT-PCR
WANG Yang,SHEN Meifeng,CHEN Zixin,et al.
, http://www.100md.com
(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhuo 215006)
Abstract In order to explore the possibility of using routinely prepared glass slide smears of bone marrow as sourse of cellular material for fusion genes RNA analysis,RT-PCR was used to detect RNA transcripts in 6 untreated leukemia patients with specific fusion genes.All the 6 samples show the positive results.This technique may be useful as a general approach in evaluating archival hematologic/pathologic specimens for the exprssion of critical gene products.
, http://www.100md.com
Key words fusion genes；bone marrow；RT-PCR；glsss slide smears
利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢性粒细胞白血病(CML)、t(8；21)急性粒细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)各自独特的融合基因(fusion gene)已在临床上逐步开展，它从RNA水平为白血病的诊断及微小残留病变(MRD)跟踪提供了更为灵敏的手段。应用骨髓涂片分析微量DNA的文献已见报道[1]。但利用骨髓涂片上残存微量RNA进行RT-PCR分析者国内文献尚未见到。然而此一技术却很重要，因为许多病例在做回顾性诊断时只剩有骨髓涂片或病理切片。本文对6例上述病人进行了骨髓涂片微量RNA的RT-PCR特异性融合基因检测，结果证明效果满意。
1 材料和方法
1.1 标本来源 6例病人，2例CML，2例t(8；21)AML，2例APL，年龄在21～54岁间，男2例，女4例。骨髓涂片均取自本院血液形态室。染色体检测资料显示上述6例病人均具有各自特异的染色体易位：CML：t(9；22)易位；t(8；21)AML：t(8；21)易位；APL：t(15；17)易位。骨髓涂片均已瑞氏染色。在做PCR前，6例骨髓涂片室温下已保存2～4个月。实验前，每例取骨髓涂片2～3张以备用。
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1.2 实验方法
1.2.1 RNA提取 显微镜下观察，估计细胞数。一般一张玻片即可，若镜下观察细胞数偏少，选用2～3张便可。用手术刀片从玻片上将骨髓细沫刮下，放入离心管中，开始RNA提取。方法仍为异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。产物最后用10 μl DEPC处理水悬浮。
1.2.2 逆转录 引物为六随机引物。反应体系共40 μl。MMLV：200 U(Promega)。RNA：上述RNA溶液5 μl。反应条件：37℃、1 h。
1.2.3 PCR方法 寡核苷酸引物由Beckman DNA合成仪合成，PAGE电泳纯化。具体序列见文献[2]。50 μl反应体系中含引物各为50 pmol/L，4×dNTP各为200 μmol/L，Mg2+1.5 mmol/L，95℃变性十分钟后加taq酶2.5 U(Sangon)。每次热循环时间为94℃ 45 s,44℃ 45 s，72℃ 90 s,30个周期。共二轮(筑巢式PCR)。最后取扩增反应液10 μl在1.5 g/dl琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果，摄像。反应设β-actin内对照及阴、阳性对照。
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2 结果
6例初诊患者，PCR结果示均有β-actin阳性条带，说明6例患者均有微量的完整mRNA存在。同时6例患者经筑巢式RT-PCR分析亦出现各自特异的条带。本实验中CML的t(9；22)易位形成的bcr-abl融合基因经筑巢式RT-PCR扩增产物为165 bp。t(8；21)AML染色体易位形成的融合基因AML-ETO其RT-PCR扩增后最终为154 bp产物。而APL的PML-RARα融合基因经扩增后二例均为151 bp的长型产物。图1为1例t(8；21)AML患者出现了154 bp特异性条带，同阳性对照第二轮PCR产物一致。阳性对照中另一条带为202 bp，为PCR第一轮产物。由于阳性对照是t(8；21)AML初诊患者的冻存骨髓，因RNA完整性破坏较少，当然更为敏感。
1 2 3 4
, 百拇医药
300 bp
200 bp
100 bp
1为Marker，上海生工公司购得；2为阴性对照；3为该标本；4为阳性对照。
图1 1例t(8；21)AML患者骨髓涂片RT-PCR检测结果
3 讨论
应用PCR方法分析基因改变，以对患者进行分子诊断及微小残留病变的跟踪是近年来发展起来的一项实用新技术。然而，临床上反复穿剌采取大量骨髓，不仅麻烦，也常常不易使患者接受，这在一定程度上限制了它的应用。利用骨髓涂片进行PCR分析，不仅可以避免上述不便，而且由于骨髓涂片便于贮存和运输，对暂无条件进行基因分析的实验室，可留待条件具备后再进行分析或寄运分子生物学实验室分析。然而一般认为较长时间保存的骨髓涂片不宜进行RNA的分子生物学研究，因为其中含有的mRNA绝大多数已逐步降解[3]。本实验表明：即使常规条件下保存较长时间的骨髓涂片仍有微量完整的mRNA，这些mRNA经逆转录后，借助于筑巢式PCR的强大扩增能力，仍能对一些疾病进行RNA水平的分子生物学研究。这为疾病的回顾性研究无凝提供了新的方法，不仅对血液学，而且对病理学研究提供了借鉴。
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另外，文献报告骨髓涂片RNA的RT-PCR分析，对白血病的微量残留病变检测也具有重要意义。Curtis[4]对3例骨髓移植后的CML患者进行了骨髓涂片的RT-PCR分析，结果发现2例bcr-abl融合基因产物仍然存在，1例后来复发。这一结果拓展了骨髓涂片RT-PCR分析的临床应用价值，也是本工作进一步努力的方向。
*苏州医学院第二附属医院(215004)
参考文献
1 Fey M F,Pilkington S P,Summers C,et al.Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides.Brit.J.Haematiolgy,1987,67:489～492
, http://www.100md.com 2 陈竺,等.造血系统亚性肿瘤,分子生物学与疾病.百家出版社,1994
3 J.萨姆布鲁克,等.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1995
4 Hanson C A,Holbrook E A,Sheldon S,et al.Detection of philadelphia chromosome-positve cells from glass slides smears using the polymerase chain reaction.Am J Path，1990,137：1～7
(1998-05-26收稿，1998-10-22修回), 百拇医药
单位：苏州医学院第一附属医院，苏州215006
关键词：骨髓；逆转录-聚合酶链反应；融合基因；玻璃涂片
骨髓涂片微量融合基因RNA的RT摘要 探讨利用常规储藏的骨髓涂片进行RNA分析的可能性。利用RT-PCR法对6例具有不同融合基因的白血病患者的RNA转录本进行检测。6例标本均获阳性结果。因此，对于保存的血片/病理切片进行特殊基因的RT-PCR检测切实可行。
Analysis of fusion genes RNA from glass slide smears using RT-PCR
WANG Yang,SHEN Meifeng,CHEN Zixin,et al.
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(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhuo 215006)
Abstract In order to explore the possibility of using routinely prepared glass slide smears of bone marrow as sourse of cellular material for fusion genes RNA analysis,RT-PCR was used to detect RNA transcripts in 6 untreated leukemia patients with specific fusion genes.All the 6 samples show the positive results.This technique may be useful as a general approach in evaluating archival hematologic/pathologic specimens for the exprssion of critical gene products.
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Key words fusion genes；bone marrow；RT-PCR；glsss slide smears
利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢性粒细胞白血病(CML)、t(8；21)急性粒细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)各自独特的融合基因(fusion gene)已在临床上逐步开展，它从RNA水平为白血病的诊断及微小残留病变(MRD)跟踪提供了更为灵敏的手段。应用骨髓涂片分析微量DNA的文献已见报道[1]。但利用骨髓涂片上残存微量RNA进行RT-PCR分析者国内文献尚未见到。然而此一技术却很重要，因为许多病例在做回顾性诊断时只剩有骨髓涂片或病理切片。本文对6例上述病人进行了骨髓涂片微量RNA的RT-PCR特异性融合基因检测，结果证明效果满意。
1 材料和方法
1.1 标本来源 6例病人，2例CML，2例t(8；21)AML，2例APL，年龄在21～54岁间，男2例，女4例。骨髓涂片均取自本院血液形态室。染色体检测资料显示上述6例病人均具有各自特异的染色体易位：CML：t(9；22)易位；t(8；21)AML：t(8；21)易位；APL：t(15；17)易位。骨髓涂片均已瑞氏染色。在做PCR前，6例骨髓涂片室温下已保存2～4个月。实验前，每例取骨髓涂片2～3张以备用。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 RNA提取 显微镜下观察，估计细胞数。一般一张玻片即可，若镜下观察细胞数偏少，选用2～3张便可。用手术刀片从玻片上将骨髓细沫刮下，放入离心管中，开始RNA提取。方法仍为异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。产物最后用10 μl DEPC处理水悬浮。
1.2.2 逆转录 引物为六随机引物。反应体系共40 μl。MMLV：200 U(Promega)。RNA：上述RNA溶液5 μl。反应条件：37℃、1 h。
1.2.3 PCR方法 寡核苷酸引物由Beckman DNA合成仪合成，PAGE电泳纯化。具体序列见文献[2]。50 μl反应体系中含引物各为50 pmol/L，4×dNTP各为200 μmol/L，Mg2+1.5 mmol/L，95℃变性十分钟后加taq酶2.5 U(Sangon)。每次热循环时间为94℃ 45 s,44℃ 45 s，72℃ 90 s,30个周期。共二轮(筑巢式PCR)。最后取扩增反应液10 μl在1.5 g/dl琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果，摄像。反应设β-actin内对照及阴、阳性对照。
, http://www.100md.com
2 结果
6例初诊患者，PCR结果示均有β-actin阳性条带，说明6例患者均有微量的完整mRNA存在。同时6例患者经筑巢式RT-PCR分析亦出现各自特异的条带。本实验中CML的t(9；22)易位形成的bcr-abl融合基因经筑巢式RT-PCR扩增产物为165 bp。t(8；21)AML染色体易位形成的融合基因AML-ETO其RT-PCR扩增后最终为154 bp产物。而APL的PML-RARα融合基因经扩增后二例均为151 bp的长型产物。图1为1例t(8；21)AML患者出现了154 bp特异性条带，同阳性对照第二轮PCR产物一致。阳性对照中另一条带为202 bp，为PCR第一轮产物。由于阳性对照是t(8；21)AML初诊患者的冻存骨髓，因RNA完整性破坏较少，当然更为敏感。
1 2 3 4
, 百拇医药
300 bp
200 bp
100 bp
1为Marker，上海生工公司购得；2为阴性对照；3为该标本；4为阳性对照。
图1 1例t(8；21)AML患者骨髓涂片RT-PCR检测结果
3 讨论
应用PCR方法分析基因改变，以对患者进行分子诊断及微小残留病变的跟踪是近年来发展起来的一项实用新技术。然而，临床上反复穿剌采取大量骨髓，不仅麻烦，也常常不易使患者接受，这在一定程度上限制了它的应用。利用骨髓涂片进行PCR分析，不仅可以避免上述不便，而且由于骨髓涂片便于贮存和运输，对暂无条件进行基因分析的实验室，可留待条件具备后再进行分析或寄运分子生物学实验室分析。然而一般认为较长时间保存的骨髓涂片不宜进行RNA的分子生物学研究，因为其中含有的mRNA绝大多数已逐步降解[3]。本实验表明：即使常规条件下保存较长时间的骨髓涂片仍有微量完整的mRNA，这些mRNA经逆转录后，借助于筑巢式PCR的强大扩增能力，仍能对一些疾病进行RNA水平的分子生物学研究。这为疾病的回顾性研究无凝提供了新的方法，不仅对血液学，而且对病理学研究提供了借鉴。
, http://www.100md.com
另外，文献报告骨髓涂片RNA的RT-PCR分析，对白血病的微量残留病变检测也具有重要意义。Curtis[4]对3例骨髓移植后的CML患者进行了骨髓涂片的RT-PCR分析，结果发现2例bcr-abl融合基因产物仍然存在，1例后来复发。这一结果拓展了骨髓涂片RT-PCR分析的临床应用价值，也是本工作进一步努力的方向。
*苏州医学院第二附属医院(215004)
参考文献
1 Fey M F,Pilkington S P,Summers C,et al.Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides.Brit.J.Haematiolgy,1987,67:489～492
, http://www.100md.com 2 陈竺,等.造血系统亚性肿瘤,分子生物学与疾病.百家出版社,1994
3 J.萨姆布鲁克,等.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1995
4 Hanson C A,Holbrook E A,Sheldon S,et al.Detection of philadelphia chromosome-positve cells from glass slides smears using the polymerase chain reaction.Am J Path，1990,137：1～7
(1998-05-26收稿，1998-10-22修回), 百拇医药