脂质体免疫裂解试验检测人血清胰岛素的初步研究
作者：罗招凡 刘剑雄 张平安
单位：湖北医科大学第一附属医院检验科，武汉430060
关键词：胰岛素；脂质体；丽丝胺罗丹明B；分光光度法
临床检验杂志990105 摘要 建立补体介导的脂质体免疫裂解试验(LILA)以检验人血清中胰岛素含量。应用逆相蒸发法(REV)制备包裹有丽丝胺罗丹明B的大单层脂质体(LUVs)，通过碳二亚胺(EDCI)法偶联胰岛素抗原，当加入胰岛素抗原、一定量抗体，在补体参与下，建立竞争抑制测定模式。结果，丽丝胺罗丹明B吸光度值的改变与血清中胰岛素浓度呈线性关系，回归方程为，Y＝227.72-80.441X(r＝-0.9966)，批内变异系数(CV)为3.8%～8.5%，批间CV9.3%～13.0%，回收率为83.4%～114.0%，灵敏度为1.25 μU/ml，LILA(Y)和RIA(X)相关显著，Y＝1.03X+0.43(r＝0.977，P<0.001)。
, 百拇医药
Homogeneous determination of insulin in human serum using liposome immunolysis assay(LILA):A preliminary study
LUO Zhaofan, LIU Jianxiong, ZHANG Pingan
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Wuhan 430060)
Abstract To develope complement-mediated liposome immunolysis assay(LILA)for detecting insulin concentration in human serum.Reverse-phase evaporation (REV)method to prepare large unilamellar vesicles(LUVs)encapsulated sulforhodamine B,and obtained immunoliposome by using 1-ethy1-3(3-dimethylaminopropy1)carbodiimide(EDCI)which made insulin couple the LUVs.Competing-inhibition assay could be achieved upon the addition of free insulin and anti-insulin antibody in the presence of complement.The results revealed that there was a excellent negative correlation between the absorption change of sulforhodamine B and insulin concentration in serum(r＝-0.9966). The within-run CV and between-run CV were 3.8%～8.5%(n＝12)，9.3%～13.0%(n＝6)respectively.The recovery was 83.4%～114.0%.the sensitivity was 1.25 μU/ml.The correlation between LILA(Y) and RIA(X)was significant:Y=1.03X+0.43(r＝0.977,P<0.001).LILA is simple, rapid, specific,sensitive and stable method which is worthy to be studied and popularized.
, 百拇医药
Key Words Insulin；Liposome；Sulforhodamine B；Spectrophotometry
脂质体免疫裂解试验(LILA)[1～3]，是一种在体外利用补体使脂质体溶破释出内容指示剂而显示抗原抗体反应的免疫测定技术，国内尚无报道。本试验选用胰岛素为分析剂，建立竞争免疫测定模式。
1 材料和方法
1.1 仪器 ZFQ85A型旋转蒸发器；JC-3型超声处理机；透射电镜(日立H-600)；Beckman高速离心机；SN-682型放射免疫γ计数器；724微机型分光光度计。
1.2 二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酸磷脂酰乙醇胺(DPPE)、胆固醇(Chol)、丽丝胺罗丹明B、碳二亚胺(EDCI)，均为Sigma产品；胰岛素干粉(徐州生物化学制药厂)、胰岛素标准品(中国原子能科学院同位素所)、溶血素(武汉生物制品研究所)；250 U/ml补体(取2～3只体重约450 g左右的健康雄性豚鼠的心血，即时分离血清，混合分管冻存于-30℃冰箱，用时取出一管，试验前用溶血素行效价滴定)，豚鼠抗人胰岛素IgG均为本室自制；氯仿、乙醚、氯化镁、氯化钙、巴比妥盐、明胶均为国产分析纯试剂。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 制备包裹有丽丝胺罗丹明B的大单层脂质体(LUVs) 采用逆相蒸发法(REV)[4]，即在50 ml圆底烧瓶内，将36 μmol DPPC、33 μmol Chol、6 μmol DPPE溶于3 ml氯仿/乙醚(V/V＝1:2)中，置于旋转蒸发器上，于38℃减压条件下旋转蒸发30 min，速度选择190 r/min，除去有机溶剂，形成一均匀薄膜，然后用12 ml氯仿/乙醚(V/V＝1∶2)复溶，再加入4 ml的0.1 mol/L丽丝胺罗丹明B(溶于pH 7.4 VB液)，超声破碎2～3 min，形成均质乳相，复置旋转蒸发器上，42℃减压条件下，旋转蒸发1 h，速度选择150 r/min，大量气泡停止产生后再蒸发20 min，以去除残存的有机溶剂。为了分离未包裹的丽丝胺罗丹明B，选用20 000×g连续反复离心5次，至上清液无色清亮为止。离心缓冲液用pH 7.4的VB液。最后将离心沉淀重悬于3 ml pH 7.4 GBV液中，经0.45 μm的微孔滤膜过滤处理，在电镜下观察并摄片。
, 百拇医药
1.3.2 制备免疫脂质体 采用EDCI法[5]，稍加改进。实验分两组，一组为加EDCI，另一组不加EDCI，取0.3 ml自制脂质体于实验各管，第一组各管内分别加入0.4 ml的20%EDCI(溶于pH 7.4 GVB液)和4 ml的1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml胰岛素液(溶于pH 7.4 GVB液)的混合反应液；第二组EDCI液用GVB液取代，混合各管后于24℃静置2 h，12 000×g 4℃离心，弃上清液，用GVB液重复洗涤离心5次，弃上清液，最后将各管沉淀脂质体重悬于0.3 ml GVB液，各取10 μl脂质体稀释104倍，放射免疫法(RIA，在本院内分泌实验室完成)测定免疫脂质体上偶联胰岛素浓度。余脂质体置4℃冰箱备用。
1.3.3 LILA检测胰岛素 免疫脂质体用前稀释100倍，实验稀释液均为GVB液。取150 μl系列标准胰岛素液(0、5、10、20、40、80、160、320 μU/ml)或待测血清样品(试验前经56℃ 30 min灭活)和100 μl 1∶160豚鼠抗人胰岛素IgG混合，加100 μl免疫脂质体，3.0 U(CH50单位)补体混合后，用GVB液稀释至500 μl，于37℃温浴1 h，加2 ml 0.01 mol/L EDTA-VB液[6]，置4℃ 20 min终止反应，在565 nm处读取吸光度值。对照管用GVB液取代豚鼠抗人胰岛素IgG。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 REV法制备LUVs评估，电镜下脂质体形态圆形(见图1)，直径420±30 nm，呈较均一的大单层脂质体。
Figure1 Electron-microscopic morphology of LUVs(large unilamellar vesicles)encapsulated with sulforhodamine B(×3000)
图1 LUVs包裹丽丝胺罗丹明B的电镜下形态( ×30 000)
2.2 LUVs偶联胰岛素情况 用RIA测定EDCI组和无EDCI组胰岛素含量，结果见表1。
表1 EDCI法偶联胰岛素于LUVs的结果
, http://www.100md.com
Table1 The value of insulin coupled with LUVs by EDCI initial concen.
of insulin
(mg/ml)
insulin concen.
by EDCI
(mU/μmol DPPE)
insulin concen.
of non-EDCI
(mU/μmol DPPE)
0.0625
, 百拇医药
350.0
75.1
0.125
452.6
128.5
0.25
562.5
275.1
0.5
723.1
364.2
1
904.3
, http://www.100md.com
430.4
2.3 豚鼠抗人胰岛素IgG和补体的最适加入量使用方阵滴定确定。通过实验选择偶联一定胰岛素的脂质体，得到比较理想的吸光度值和标准曲线。
2.4 线性 系列标准品免疫脂质体(350 mU胰岛素/μmol DPPE)1:160稀释抗体3.0 U(CH50)补体混合反应后，得标准曲线,见图2。
Figure2 Standard curve of insulin by LILA
图2 LILA检测胰岛素标准曲线
2.5 灵敏度 将80 μU/ml的标准品倍比稀释后，用LILA检测其吸光度值，每份3管平行测定，得本法灵敏度为1.25 μU/ml。
, 百拇医药
2.6 精密度 批内重复试验，4份样品，每份作12管，变异系数为3.8%～8.5%；批间重复试验，5份样品在不同时间测定6次，变异系数为9.3%～13.2%。
2.7 方法的准确性 在2份含有不同胰岛素浓度的血清中加入不同含量的胰岛素(标准品)，然后测得回收率为83.4%～114.0%，平均为101.67%。
2.8 LILA和RIA的相关性 用LILA(Y)和RIA(X)同时随机检测28份临床血清样品(来自本院门诊病人，试验前样品经56℃ 30 min灭活处理)。两者存在显著相关，Y＝1.03X+0.43(r＝0.977,P<0.001)，结果见图3
Figure3 The correlation of human serum insulin by RIA and LILA
, http://www.100md.com
图3 用RIA和LILA检测人血清胰岛素相关性
3 讨论
脂质体是一种人工合成的双分子类脂膜性微球，近年来，国外已利用脂质体膜内水相空间可包裹大量的指示剂分子，膜表面可偶联抗原或抗体以获得免疫脂质体等特性而用于体外的诊断实验[7,8]。反应在液相的均相状态中进行，无需几次温浴及分离步骤，无放射线污染，与EIA和RIA相比，有其独特的优越性，制备包裹率高的LUVs和偶联有抗原或抗体的免疫脂质体是整个实验的关键。本文采用REV法制备LUVs，在电镜下形态均一，呈圆形，平均包裹率为41.35%，于4℃冰箱存放6个月后测得其泄漏率为1.47%，基本稳定。为了将胰岛素偶联于脂质体上我们选用EDCI作交联剂。EDCI[9]是一种很强的化学交联剂，其水溶性极好，反应条件温和，能使脂质体DPPE提供的氨基和胰岛素上的羧基脱水缩合而形成酰胺键，实现两者的交联。从附表可知偶联的胰岛素浓度不仅与有无EDCI有关，而且还与胰岛素的初始浓度有关，这一线性关系保证了脂质体上须偶联一定量的胰岛素可通过控制胰岛素的初始浓度来实现。LILA的建立，与抗原、抗体、活性补体三者的存在与否及浓度密切相关，当抗原抗体特异结合后，才会激活补体，通过补体的膜攻击单位，使脂质体溶破释出染料物质丽丝胺罗丹明B[10]，后者是一种新型示踪染料，当包裹于脂质体时形成二聚体结构，最大吸收峰在530 nm处，当脂质体溶破，其稀释游离于周围水相，最大吸收峰转移至565 nm处。用此原理可得其吸光度值的改变量与标准胰岛素浓度两者间的回归方程。
, 百拇医药
通过LILA检测人血清胰岛素的初步研究，表明LILA是一种快速、简便、灵敏、特异和易于朝自动化方向发展的分析方法，为临床相关物质的测定提供了一条新途径[11]。
(本文承湖北医科大学化学教研室胡泉源讲师帮助，特此致谢!)
*中山医科大学孙逸仙纪念医院检验科,广州 510120
参考文献
1 Rongen H A H,Bult A,Van Bennekon W P.J Immunol Methods,1997，204：105～133
2 Frost S J,Chakraborty J,Firth G B.J Immunol Methods,1996，194：105～111
, http://www.100md.com
3 Frost S J,Chakraborty J,Firth G B.Clin Chem,1996，42(6)：874～879
4 Szoka F Jr,Papahajopoulos D.Proc Natl Acad Sci USA,1978，75(9)：4194～4198
5 Hashimoto Y,Endon H,and Sugawara M.In:Gregoriadis G(Ed).Liposome Technology(Vol 3),Florida:CRC Press,1984.44～45
6 Schreier H,Valentino K,Heath B P,et al.Life Science,1989，45(20)：1919～1930
7 Kobatake S,Yamamoto S,Matsunra S,et al. Clin Chem,1996，42(S6)：9112
, 百拇医药
8 Iaskowski T D,Martins T B,Litwin C M.Clin Chem,1997，43(6)：9248
9 洪孝山，孙曼雯 主编.蛋白质连接技术.北京：中国医药科技出版社，1993.1～43
10 Frost S J,Firth G B, Chakraborty J.J Liposome Res，1994，4：1159～1182
11 李金明.国外医学临床生物化学与检验分册，1993，3：116～119
(1998-05-13收稿，1998-08-25修回), 百拇医药
单位：湖北医科大学第一附属医院检验科，武汉430060
关键词：胰岛素；脂质体；丽丝胺罗丹明B；分光光度法
临床检验杂志990105 摘要 建立补体介导的脂质体免疫裂解试验(LILA)以检验人血清中胰岛素含量。应用逆相蒸发法(REV)制备包裹有丽丝胺罗丹明B的大单层脂质体(LUVs)，通过碳二亚胺(EDCI)法偶联胰岛素抗原，当加入胰岛素抗原、一定量抗体，在补体参与下，建立竞争抑制测定模式。结果，丽丝胺罗丹明B吸光度值的改变与血清中胰岛素浓度呈线性关系，回归方程为，Y＝227.72-80.441X(r＝-0.9966)，批内变异系数(CV)为3.8%～8.5%，批间CV9.3%～13.0%，回收率为83.4%～114.0%，灵敏度为1.25 μU/ml，LILA(Y)和RIA(X)相关显著，Y＝1.03X+0.43(r＝0.977，P<0.001)。
, 百拇医药
Homogeneous determination of insulin in human serum using liposome immunolysis assay(LILA):A preliminary study
LUO Zhaofan, LIU Jianxiong, ZHANG Pingan
(First Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Wuhan 430060)
Abstract To develope complement-mediated liposome immunolysis assay(LILA)for detecting insulin concentration in human serum.Reverse-phase evaporation (REV)method to prepare large unilamellar vesicles(LUVs)encapsulated sulforhodamine B,and obtained immunoliposome by using 1-ethy1-3(3-dimethylaminopropy1)carbodiimide(EDCI)which made insulin couple the LUVs.Competing-inhibition assay could be achieved upon the addition of free insulin and anti-insulin antibody in the presence of complement.The results revealed that there was a excellent negative correlation between the absorption change of sulforhodamine B and insulin concentration in serum(r＝-0.9966). The within-run CV and between-run CV were 3.8%～8.5%(n＝12)，9.3%～13.0%(n＝6)respectively.The recovery was 83.4%～114.0%.the sensitivity was 1.25 μU/ml.The correlation between LILA(Y) and RIA(X)was significant:Y=1.03X+0.43(r＝0.977,P<0.001).LILA is simple, rapid, specific,sensitive and stable method which is worthy to be studied and popularized.
, 百拇医药
Key Words Insulin；Liposome；Sulforhodamine B；Spectrophotometry
脂质体免疫裂解试验(LILA)[1～3]，是一种在体外利用补体使脂质体溶破释出内容指示剂而显示抗原抗体反应的免疫测定技术，国内尚无报道。本试验选用胰岛素为分析剂，建立竞争免疫测定模式。
1 材料和方法
1.1 仪器 ZFQ85A型旋转蒸发器；JC-3型超声处理机；透射电镜(日立H-600)；Beckman高速离心机；SN-682型放射免疫γ计数器；724微机型分光光度计。
1.2 二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酸磷脂酰乙醇胺(DPPE)、胆固醇(Chol)、丽丝胺罗丹明B、碳二亚胺(EDCI)，均为Sigma产品；胰岛素干粉(徐州生物化学制药厂)、胰岛素标准品(中国原子能科学院同位素所)、溶血素(武汉生物制品研究所)；250 U/ml补体(取2～3只体重约450 g左右的健康雄性豚鼠的心血，即时分离血清，混合分管冻存于-30℃冰箱，用时取出一管，试验前用溶血素行效价滴定)，豚鼠抗人胰岛素IgG均为本室自制；氯仿、乙醚、氯化镁、氯化钙、巴比妥盐、明胶均为国产分析纯试剂。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 制备包裹有丽丝胺罗丹明B的大单层脂质体(LUVs) 采用逆相蒸发法(REV)[4]，即在50 ml圆底烧瓶内，将36 μmol DPPC、33 μmol Chol、6 μmol DPPE溶于3 ml氯仿/乙醚(V/V＝1:2)中，置于旋转蒸发器上，于38℃减压条件下旋转蒸发30 min，速度选择190 r/min，除去有机溶剂，形成一均匀薄膜，然后用12 ml氯仿/乙醚(V/V＝1∶2)复溶，再加入4 ml的0.1 mol/L丽丝胺罗丹明B(溶于pH 7.4 VB液)，超声破碎2～3 min，形成均质乳相，复置旋转蒸发器上，42℃减压条件下，旋转蒸发1 h，速度选择150 r/min，大量气泡停止产生后再蒸发20 min，以去除残存的有机溶剂。为了分离未包裹的丽丝胺罗丹明B，选用20 000×g连续反复离心5次，至上清液无色清亮为止。离心缓冲液用pH 7.4的VB液。最后将离心沉淀重悬于3 ml pH 7.4 GBV液中，经0.45 μm的微孔滤膜过滤处理，在电镜下观察并摄片。
, 百拇医药
1.3.2 制备免疫脂质体 采用EDCI法[5]，稍加改进。实验分两组，一组为加EDCI，另一组不加EDCI，取0.3 ml自制脂质体于实验各管，第一组各管内分别加入0.4 ml的20%EDCI(溶于pH 7.4 GVB液)和4 ml的1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml胰岛素液(溶于pH 7.4 GVB液)的混合反应液；第二组EDCI液用GVB液取代，混合各管后于24℃静置2 h，12 000×g 4℃离心，弃上清液，用GVB液重复洗涤离心5次，弃上清液，最后将各管沉淀脂质体重悬于0.3 ml GVB液，各取10 μl脂质体稀释104倍，放射免疫法(RIA，在本院内分泌实验室完成)测定免疫脂质体上偶联胰岛素浓度。余脂质体置4℃冰箱备用。
1.3.3 LILA检测胰岛素 免疫脂质体用前稀释100倍，实验稀释液均为GVB液。取150 μl系列标准胰岛素液(0、5、10、20、40、80、160、320 μU/ml)或待测血清样品(试验前经56℃ 30 min灭活)和100 μl 1∶160豚鼠抗人胰岛素IgG混合，加100 μl免疫脂质体，3.0 U(CH50单位)补体混合后，用GVB液稀释至500 μl，于37℃温浴1 h，加2 ml 0.01 mol/L EDTA-VB液[6]，置4℃ 20 min终止反应，在565 nm处读取吸光度值。对照管用GVB液取代豚鼠抗人胰岛素IgG。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 REV法制备LUVs评估，电镜下脂质体形态圆形(见图1)，直径420±30 nm，呈较均一的大单层脂质体。
Figure1 Electron-microscopic morphology of LUVs(large unilamellar vesicles)encapsulated with sulforhodamine B(×3000)
图1 LUVs包裹丽丝胺罗丹明B的电镜下形态( ×30 000)
2.2 LUVs偶联胰岛素情况 用RIA测定EDCI组和无EDCI组胰岛素含量，结果见表1。
表1 EDCI法偶联胰岛素于LUVs的结果
, http://www.100md.com
Table1 The value of insulin coupled with LUVs by EDCI initial concen.
of insulin
(mg/ml)
insulin concen.
by EDCI
(mU/μmol DPPE)
insulin concen.
of non-EDCI
(mU/μmol DPPE)
0.0625
, 百拇医药
350.0
75.1
0.125
452.6
128.5
0.25
562.5
275.1
0.5
723.1
364.2
1
904.3
, http://www.100md.com
430.4
2.3 豚鼠抗人胰岛素IgG和补体的最适加入量使用方阵滴定确定。通过实验选择偶联一定胰岛素的脂质体，得到比较理想的吸光度值和标准曲线。
2.4 线性 系列标准品免疫脂质体(350 mU胰岛素/μmol DPPE)1:160稀释抗体3.0 U(CH50)补体混合反应后，得标准曲线,见图2。
Figure2 Standard curve of insulin by LILA
图2 LILA检测胰岛素标准曲线
2.5 灵敏度 将80 μU/ml的标准品倍比稀释后，用LILA检测其吸光度值，每份3管平行测定，得本法灵敏度为1.25 μU/ml。
, 百拇医药
2.6 精密度 批内重复试验，4份样品，每份作12管，变异系数为3.8%～8.5%；批间重复试验，5份样品在不同时间测定6次，变异系数为9.3%～13.2%。
2.7 方法的准确性 在2份含有不同胰岛素浓度的血清中加入不同含量的胰岛素(标准品)，然后测得回收率为83.4%～114.0%，平均为101.67%。
2.8 LILA和RIA的相关性 用LILA(Y)和RIA(X)同时随机检测28份临床血清样品(来自本院门诊病人，试验前样品经56℃ 30 min灭活处理)。两者存在显著相关，Y＝1.03X+0.43(r＝0.977,P<0.001)，结果见图3
Figure3 The correlation of human serum insulin by RIA and LILA
, http://www.100md.com
图3 用RIA和LILA检测人血清胰岛素相关性
3 讨论
脂质体是一种人工合成的双分子类脂膜性微球，近年来，国外已利用脂质体膜内水相空间可包裹大量的指示剂分子，膜表面可偶联抗原或抗体以获得免疫脂质体等特性而用于体外的诊断实验[7,8]。反应在液相的均相状态中进行，无需几次温浴及分离步骤，无放射线污染，与EIA和RIA相比，有其独特的优越性，制备包裹率高的LUVs和偶联有抗原或抗体的免疫脂质体是整个实验的关键。本文采用REV法制备LUVs，在电镜下形态均一，呈圆形，平均包裹率为41.35%，于4℃冰箱存放6个月后测得其泄漏率为1.47%，基本稳定。为了将胰岛素偶联于脂质体上我们选用EDCI作交联剂。EDCI[9]是一种很强的化学交联剂，其水溶性极好，反应条件温和，能使脂质体DPPE提供的氨基和胰岛素上的羧基脱水缩合而形成酰胺键，实现两者的交联。从附表可知偶联的胰岛素浓度不仅与有无EDCI有关，而且还与胰岛素的初始浓度有关，这一线性关系保证了脂质体上须偶联一定量的胰岛素可通过控制胰岛素的初始浓度来实现。LILA的建立，与抗原、抗体、活性补体三者的存在与否及浓度密切相关，当抗原抗体特异结合后，才会激活补体，通过补体的膜攻击单位，使脂质体溶破释出染料物质丽丝胺罗丹明B[10]，后者是一种新型示踪染料，当包裹于脂质体时形成二聚体结构，最大吸收峰在530 nm处，当脂质体溶破，其稀释游离于周围水相，最大吸收峰转移至565 nm处。用此原理可得其吸光度值的改变量与标准胰岛素浓度两者间的回归方程。
, 百拇医药
通过LILA检测人血清胰岛素的初步研究，表明LILA是一种快速、简便、灵敏、特异和易于朝自动化方向发展的分析方法，为临床相关物质的测定提供了一条新途径[11]。
(本文承湖北医科大学化学教研室胡泉源讲师帮助，特此致谢!)
*中山医科大学孙逸仙纪念医院检验科,广州 510120
参考文献
1 Rongen H A H,Bult A,Van Bennekon W P.J Immunol Methods,1997，204：105～133
2 Frost S J,Chakraborty J,Firth G B.J Immunol Methods,1996，194：105～111
, http://www.100md.com
3 Frost S J,Chakraborty J,Firth G B.Clin Chem,1996，42(6)：874～879
4 Szoka F Jr,Papahajopoulos D.Proc Natl Acad Sci USA,1978，75(9)：4194～4198
5 Hashimoto Y,Endon H,and Sugawara M.In:Gregoriadis G(Ed).Liposome Technology(Vol 3),Florida:CRC Press,1984.44～45
6 Schreier H,Valentino K,Heath B P,et al.Life Science,1989，45(20)：1919～1930
7 Kobatake S,Yamamoto S,Matsunra S,et al. Clin Chem,1996，42(S6)：9112
, 百拇医药
8 Iaskowski T D,Martins T B,Litwin C M.Clin Chem,1997，43(6)：9248
9 洪孝山，孙曼雯 主编.蛋白质连接技术.北京：中国医药科技出版社，1993.1～43
10 Frost S J,Firth G B, Chakraborty J.J Liposome Res，1994，4：1159～1182
11 李金明.国外医学临床生物化学与检验分册，1993，3：116～119
(1998-05-13收稿，1998-08-25修回), 百拇医药