血清山梨醇脱氢酶的连续监测法
作者：孙玉蓉 戴晨阳 张孝山
单位：天津市传染病医院，天津300192
关键词：山梨醇脱氢酶；连续监测法；肝细胞损伤
临床检验杂志990103 摘要 建立了用D-果糖作为底物测定山梨醇脱氢酶活性的连续监测法。此酶的最适pH 7.4(25℃),Km值71.43 mmol/L,D-果糖的终浓度363 mmol/L，批内、批间CV<8.65%，线性范围高达60 U/L。此方法适用于各种自动生化分析仪，可作为肝细胞损伤的特异性诊断指标。
山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH,EC 1.1.1.14)主要存在于肝脏组织，多数位于肝细胞浆，少量存在于肝细胞线粒体基质中，其他脏器，如脾、脑、心脏、肾脏、肠和骨骼肌等含量甚少。由于其肝脏特异性，血液中酶活性的改变在一定程度上可特异性地反应肝脏功能和肝细胞损伤变化。本文参考Gerlach[1]方法，建立了以D-果糖为底物的测定山梨醇脱氢酶的连续监测法。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 自动生化分析仪(Cobas Mira)、紫外可见分光光度计(Shimadzu UV-240)。
1.1.2 试剂 NADH(Boehringer Mannheim)、D-果糖(华美生物工程公司)和三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海试剂三厂)。
1.1.3 试剂1 100 mmol/L pH 7.4(25℃)的Tris-HCl缓冲液，其中含NADH 0.35 mmol/L，4℃存放至少可稳定一周。试剂2 4 mol/L D-果糖水溶液，称取果糖7.2 g加双蒸水溶解，稀释至10 ml，4℃存放至少可稳定四周。
1.1.4 大鼠肝组织抽提液 选择健康，体重为200～250 g的Sprague-Dowley大鼠，巴比妥钠腹腔麻醉，剖腹取肝脏。肝脏用4℃生理盐水反复冲洗至积血消失，在冰槽中用匀浆器粉碎至糜状，加生理盐水至10 ml，继续研磨成匀浆，最后加入等量的1%Triton X-100混匀，置于冰槽中停留10分钟，再混匀，然后以3000 r/min离心10分钟，小心取上清液分装。
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1.2 方法
1.2.1 反应原理 D-果糖和NADH在山梨醇脱氢酶的催化下生成山梨醇和NAD，根据340 nm波长下因NADH耗消引起吸光度的变化，计算SDH活性。一个酶活力单位为37℃下每分钟催化底物生成1 μmol产物所需的酶量；以U/L表示。反应式如下：
1.2.2 测定参数 反应方式：R-S-SR1(试剂1/样品/试剂2)；温度：37℃；波长：340 nm；于第一点(每点25秒)加入样品20 μl、稀释液15 μl和试剂1(R1)150 μl后，预孵育175秒，在第8点加入启动试剂(R2)20 μl和稀释液15 μl，测定第9点至16点的吸光度变化。计算公式如下：
2 实验与结果
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2.1 最适pH选择 用pH 7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0(25℃)的Tris-HCl缓冲液分别配制工作试剂，其他条件不变，测定20倍稀释的肝组织抽提液中的SDH活性在pH 7.4时最高。
2.2 米氏常数测定 用pH 7.4Tris-HCl缓冲液配制试剂1(R1)，再配制一系列浓度不同的底物溶液(5 mmol/L～600 mmol/L)作启动试剂(R2)对肝组织抽提液进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响，按Lineweaver-Burk法进行作图，求得SDH对果糖的Km值为71.43 mmol/L，见图1。当底物的反应浓度超过400 mmol/L时，D-果糖对SDH活性有明显的抑制作用，见图2。因此，参考原方法[1],本试验的底物反应浓度确定为363.6 mmol/L，为Km值的5.1倍。
图1 D-果糖浓度与酶促反应速度的关系
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图2 D-果糖浓度与酶活性的抑制情况
2.3 方法线性范围 把肝组织抽提液用100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，25℃)稀释成不同浓度进行测定，结果显示在60 U/L下时线性良好。回归方程：Y＝0.0063+0.0005X,r＝0.984。因此，临床测定结果大于60 U/L时应稀释5倍重做。
2.4 不精密度试验 批内不精密度：在同一时间，对高、中、低值样品测定20次，均值(
)分别为：36.8、9.28和4.02 U/L，CV分别为：3.97%、7.11%和8.03%。日间不精密度：用上述血清，每天测定一次，连续20天，测定均值(
)分别为：36.3、9.42和3.96 U/L，CV分别为：4.23%、7.75%和8.6%。
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2.5 参考值 应用本法对66例肝功能正常的健康献血员(男子36例，女子30例，年龄范围17～50岁，平均36岁)进行测定，血清SDH活性呈正态分布，
±s为3.02±1.01 U/L，故正常值上限定为5 U/L。
3 讨论
SDH主要存在于肝组织，在细胞内主要位于细胞浆和线粒体[1,2]，其他脏器含量甚少，血清浓度变化在一定范围内可反映肝细胞损伤情况。我们对住院肝病病人进行检测，发现其在急性肝炎时，阳性率为92.1%，这与Asada[3]报告的阳性率(87%)基本相似。一般认为，SDH常在急性肝炎的黄疸前期或肝炎早期升高，发病一周后达到峰值，升高幅度大致与转氨酶相平衡，恢复到正常范围的时间较转氨酶(ALT，AST)为早。另外，在阻塞性黄疸及其他疾病，一般不升高，即使偶尔升高，也是因为并发肝实质损伤之故。因此它能较早期、敏感、特异地反映肝损伤情况，特别对肝细胞黄疸和阻塞性黄疸的鉴别有一定价值。
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有报告指出肝脏是内毒素休克时侵犯的靶器官，肝实质细胞最易累及受损[4,5]，因此内毒素休克时常出现肝损伤[5]。内毒素休克导致低氧血症和肝脏缺血时，肝脏中央小叶细胞严重受损，此酶活性显著升高[4]。用2和5 mg/kg内毒素处理大鼠，发现β-葡萄糖醛酸酶(β-GD)和乳酸脱氢酶(LDH)均显著升高，而SDH未明显升高，用药后8 h和24 h大鼠死亡率分别为21%和29%；用10 mg/kg内毒素处理大鼠后，则三种酶均显著升高，此时，用药后8 h和24 h大鼠死亡率分别达到84%和100%，表明SDH升高与死亡率密切相关[6]，血清SDH明显升高者，其死亡率亦高，故血清SDH可作为内毒素休克的一项良好监测指标。
比色法[7]作者报告急性肝炎血清中SDH活性最高可达15.5 U/L，是参考值上限的6.2倍；而我们用动力学法可达93 U/L，是此参考值上限的18.6倍，造成这一差别的原因可能是由于反应原理不同，前者反应方向是由山梨醇到果糖，反应pH是9.8；而我们采用的反应方向是由果糖到山梨醇，反应pH是7.4。
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研究时还发现，当底物浓度超过400 mmol/L时，D-果糖对SDH活性有明显的抑制作用。因此本实验所用的反应浓度为363 mmol/L,为Km值的5.1倍。
参考文献
1 Gerlach U,Hiby W.In Methods of Enzymatic Analysis. 3rd ed.Vol 3.(Bergmeyer HU ed.),New York Academic Press，1983.112～117
2 Wilkinson T H. The principle and practice of diagnostic enzymology.Edward Arnold，1976.45
3 Asada M,et al. Sorbitol dehydrogenase and hepatocellular injury and experimental and clinical study.Gastroenterlogy，1963，44：578
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4 Bradley S G.Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins. Annu Rev Microbiol，1979，33：67
5 Editorial.Endotoxin and cirrhosis. Lancent，1982，8267：318
6 Singh I S, Ghosh J J. Serum sorbital dehydrogenase:a suitable indicator for monitoring the severity of endotoxic shock.Ircs Med Sci，1985，13：362
7 上海第二医学院瑞金医院检验科.血清山梨醇脱氢酶比色法的临床应用初步报告.中华医学检验杂志，1979，2：82
(1998-03-09收稿，1998-07-31修回), http://www.100md.com
单位：天津市传染病医院，天津300192
关键词：山梨醇脱氢酶；连续监测法；肝细胞损伤
临床检验杂志990103 摘要 建立了用D-果糖作为底物测定山梨醇脱氢酶活性的连续监测法。此酶的最适pH 7.4(25℃),Km值71.43 mmol/L,D-果糖的终浓度363 mmol/L，批内、批间CV<8.65%，线性范围高达60 U/L。此方法适用于各种自动生化分析仪，可作为肝细胞损伤的特异性诊断指标。
山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH,EC 1.1.1.14)主要存在于肝脏组织，多数位于肝细胞浆，少量存在于肝细胞线粒体基质中，其他脏器，如脾、脑、心脏、肾脏、肠和骨骼肌等含量甚少。由于其肝脏特异性，血液中酶活性的改变在一定程度上可特异性地反应肝脏功能和肝细胞损伤变化。本文参考Gerlach[1]方法，建立了以D-果糖为底物的测定山梨醇脱氢酶的连续监测法。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 自动生化分析仪(Cobas Mira)、紫外可见分光光度计(Shimadzu UV-240)。
1.1.2 试剂 NADH(Boehringer Mannheim)、D-果糖(华美生物工程公司)和三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海试剂三厂)。
1.1.3 试剂1 100 mmol/L pH 7.4(25℃)的Tris-HCl缓冲液，其中含NADH 0.35 mmol/L，4℃存放至少可稳定一周。试剂2 4 mol/L D-果糖水溶液，称取果糖7.2 g加双蒸水溶解，稀释至10 ml，4℃存放至少可稳定四周。
1.1.4 大鼠肝组织抽提液 选择健康，体重为200～250 g的Sprague-Dowley大鼠，巴比妥钠腹腔麻醉，剖腹取肝脏。肝脏用4℃生理盐水反复冲洗至积血消失，在冰槽中用匀浆器粉碎至糜状，加生理盐水至10 ml，继续研磨成匀浆，最后加入等量的1%Triton X-100混匀，置于冰槽中停留10分钟，再混匀，然后以3000 r/min离心10分钟，小心取上清液分装。
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1.2 方法
1.2.1 反应原理 D-果糖和NADH在山梨醇脱氢酶的催化下生成山梨醇和NAD，根据340 nm波长下因NADH耗消引起吸光度的变化，计算SDH活性。一个酶活力单位为37℃下每分钟催化底物生成1 μmol产物所需的酶量；以U/L表示。反应式如下：
1.2.2 测定参数 反应方式：R-S-SR1(试剂1/样品/试剂2)；温度：37℃；波长：340 nm；于第一点(每点25秒)加入样品20 μl、稀释液15 μl和试剂1(R1)150 μl后，预孵育175秒，在第8点加入启动试剂(R2)20 μl和稀释液15 μl，测定第9点至16点的吸光度变化。计算公式如下：
2 实验与结果
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2.1 最适pH选择 用pH 7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，8.0(25℃)的Tris-HCl缓冲液分别配制工作试剂，其他条件不变，测定20倍稀释的肝组织抽提液中的SDH活性在pH 7.4时最高。
2.2 米氏常数测定 用pH 7.4Tris-HCl缓冲液配制试剂1(R1)，再配制一系列浓度不同的底物溶液(5 mmol/L～600 mmol/L)作启动试剂(R2)对肝组织抽提液进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响，按Lineweaver-Burk法进行作图，求得SDH对果糖的Km值为71.43 mmol/L，见图1。当底物的反应浓度超过400 mmol/L时，D-果糖对SDH活性有明显的抑制作用，见图2。因此，参考原方法[1],本试验的底物反应浓度确定为363.6 mmol/L，为Km值的5.1倍。
图1 D-果糖浓度与酶促反应速度的关系
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图2 D-果糖浓度与酶活性的抑制情况
2.3 方法线性范围 把肝组织抽提液用100 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，25℃)稀释成不同浓度进行测定，结果显示在60 U/L下时线性良好。回归方程：Y＝0.0063+0.0005X,r＝0.984。因此，临床测定结果大于60 U/L时应稀释5倍重做。
2.4 不精密度试验 批内不精密度：在同一时间，对高、中、低值样品测定20次，均值(
)分别为：36.8、9.28和4.02 U/L，CV分别为：3.97%、7.11%和8.03%。日间不精密度：用上述血清，每天测定一次，连续20天，测定均值()分别为：36.3、9.42和3.96 U/L，CV分别为：4.23%、7.75%和8.6%。, 百拇医药
2.5 参考值 应用本法对66例肝功能正常的健康献血员(男子36例，女子30例，年龄范围17～50岁，平均36岁)进行测定，血清SDH活性呈正态分布，
±s为3.02±1.01 U/L，故正常值上限定为5 U/L。3 讨论
SDH主要存在于肝组织，在细胞内主要位于细胞浆和线粒体[1,2]，其他脏器含量甚少，血清浓度变化在一定范围内可反映肝细胞损伤情况。我们对住院肝病病人进行检测，发现其在急性肝炎时，阳性率为92.1%，这与Asada[3]报告的阳性率(87%)基本相似。一般认为，SDH常在急性肝炎的黄疸前期或肝炎早期升高，发病一周后达到峰值，升高幅度大致与转氨酶相平衡，恢复到正常范围的时间较转氨酶(ALT，AST)为早。另外，在阻塞性黄疸及其他疾病，一般不升高，即使偶尔升高，也是因为并发肝实质损伤之故。因此它能较早期、敏感、特异地反映肝损伤情况，特别对肝细胞黄疸和阻塞性黄疸的鉴别有一定价值。
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有报告指出肝脏是内毒素休克时侵犯的靶器官，肝实质细胞最易累及受损[4,5]，因此内毒素休克时常出现肝损伤[5]。内毒素休克导致低氧血症和肝脏缺血时，肝脏中央小叶细胞严重受损，此酶活性显著升高[4]。用2和5 mg/kg内毒素处理大鼠，发现β-葡萄糖醛酸酶(β-GD)和乳酸脱氢酶(LDH)均显著升高，而SDH未明显升高，用药后8 h和24 h大鼠死亡率分别为21%和29%；用10 mg/kg内毒素处理大鼠后，则三种酶均显著升高，此时，用药后8 h和24 h大鼠死亡率分别达到84%和100%，表明SDH升高与死亡率密切相关[6]，血清SDH明显升高者，其死亡率亦高，故血清SDH可作为内毒素休克的一项良好监测指标。
比色法[7]作者报告急性肝炎血清中SDH活性最高可达15.5 U/L，是参考值上限的6.2倍；而我们用动力学法可达93 U/L，是此参考值上限的18.6倍，造成这一差别的原因可能是由于反应原理不同，前者反应方向是由山梨醇到果糖，反应pH是9.8；而我们采用的反应方向是由果糖到山梨醇，反应pH是7.4。
, 百拇医药
研究时还发现，当底物浓度超过400 mmol/L时，D-果糖对SDH活性有明显的抑制作用。因此本实验所用的反应浓度为363 mmol/L,为Km值的5.1倍。
参考文献
1 Gerlach U,Hiby W.In Methods of Enzymatic Analysis. 3rd ed.Vol 3.(Bergmeyer HU ed.),New York Academic Press，1983.112～117
2 Wilkinson T H. The principle and practice of diagnostic enzymology.Edward Arnold，1976.45
3 Asada M,et al. Sorbitol dehydrogenase and hepatocellular injury and experimental and clinical study.Gastroenterlogy，1963，44：578
, 百拇医药
4 Bradley S G.Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins. Annu Rev Microbiol，1979，33：67
5 Editorial.Endotoxin and cirrhosis. Lancent，1982，8267：318
6 Singh I S, Ghosh J J. Serum sorbital dehydrogenase:a suitable indicator for monitoring the severity of endotoxic shock.Ircs Med Sci，1985，13：362
7 上海第二医学院瑞金医院检验科.血清山梨醇脱氢酶比色法的临床应用初步报告.中华医学检验杂志，1979，2：82
(1998-03-09收稿，1998-07-31修回), http://www.100md.com