转化生长因子β1表达在小鼠放射性肺纤维化形成过程中的作用
作者：崔晓利 刘海玲 董秀癑 殷蔚伯
单位：300060 天津医科大学附属肿瘤医院(崔晓利)；中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院(刘海玲、董秀癑、殷蔚伯)
关键词：转化生长因子β1；聚合酶链反应；肺纤维化
中华放射肿瘤学杂志990115 【摘要】目的 探讨转化生长因子β1(TGFβ1)在小鼠放射性肺纤维化形成过程中表达变化及作用。方法 雄性C57BL小鼠，全肺1次照射13 Gy，不同时间取肺组织HE染色、Masson染色、VG染色观察肺纤维化形成。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定肺组织内TGF-β1的表达。结果 照射后8个月局部灶性纤维化形成。照射后36小时TGF-β1表达下降；照射后2个月TGF-β1表达升高；至照射后8个月，略呈下降趋势，但仍高于正常对照。结论 TGF-β1的表达在肺纤维化形成过程中起重要作用。
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The role of TGF-β1 expression in the formation of lung fibrosis in mice after thoracic irradiation
CUI Xiaoli*,LIU Hailing,DONG Xiuyue,et al.
*Tianjin Cancer Hospital,Tianjin 300060
【Abstract】Objective To study the role of expression of TGF-β1 in the formation of lung fibrosis in mice after thoracic irradiation. Methods Using the lungs of C57BL mice,we observed the histological changes stained with HE,Masson and VG up to 8 months after whole thorax irradiation.Expression of TGF-β1 was evaluated by RT-PCR technique. Results The expression of TGF-β1 decreased at H 36 after whole thoracic irradiation,increased in 2 months and remained elevated until 8 months when lung fibrosis appeared. Conclusions These studies clearly demonstrate that alterations in expression of TGF-β1 occur very early after pulmonary irradiation and may play a role in the development of chronic fibrosis
, 百拇医药
【Key words】Tranforming growth factor β1 Polymerase chain reaction Lung/fibrosis
放射性肺损伤包括放射性肺炎及放射性肺纤维化，它不仅限制放射剂量且增加患者死亡率。虽然有关此方面的临床报道很多，但其发病机理不清，缺乏简便易行的预测指标，成为胸部照射的棘手问题。随着分子生物学技术的发展，人们逐渐认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用起始并维持着放射性肺损伤的过程，这些细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF-α)，TGF-β1，血小板衍化生长因子(PDGF)等。为此作者对X线照射后小鼠肺组织中细胞因子TGF-β1表达的变化进行了测定。
1 材料与方法
1.1 肺照射及标本制备：近交系C57BL小鼠，雄性，18～22 g体重(中国医学科学院肿瘤医院动物中心提供)，8只一笼，饲料、饮水不限。
, 百拇医药
小鼠清醒状态固定板上，体表置2 cm厚蜡块，全肺单次照射13 Gy。Philips SL 75-10直线加速器8 MV-X线，剂量率＝490 cGy/min。
于照射后36小时、20天、2个月、7个月、8个月、9个月断颈活杀照射组及相同鼠龄对照组小鼠，左肺置于10%中性甲醛溶液中固定24小时，常规脱水、浸蜡、包埋、切片。分别行HE染色、Masson染色、VG染色观察肺纤维化形成。右肺置于液氮中保存。
1.2 TGF-β1测定：
(1)组织中总RNA的提取(TRIZOL试剂盒)
将照射后36小时、2个月、8个月3个时间点的小鼠肺组织各100 mg研磨成粉末，置于匀浆器中，加1 mL TRIZOL裂解液匀浆。室温孵育5分钟，加0.2 mL氯仿，强烈震荡15秒，室温孵育2～3分钟。4 ℃12 000 g离心15分钟，转水相于新管中，加异丙醇0.5 mL，室温孵育10分钟。4 ℃12 000 g离心10分钟，RNA沉淀。去上清，75%乙醇冲洗2次。真空抽干，溶于焦磷酸二乙酯(DEPC)处理的水中。
, 百拇医药
(2)RNA定量及电泳鉴定提取的RNA
取5 μL RNA溶液加600 μL DEPC处理的水，用Graphtoord UV-240紫外分光光度仪测A值。RNA纯度＝A260/A280，RNA浓度＝A260×40(μg/mL)×稀释倍数。RNA样本用变性RNA琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(3)RT-PCR(SUPERSCRIPT ONE-STEP RT-PCR SYSTEM 试剂盒)引物序列
TGF-β1：
(F)5'-ACCTGCAAGACCATCGACAT-3'；
(R)5'-GGTTTTCTCATAGATGGCGT-3'。
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β-actin：
(F)5'-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3'；
(R)5'-GTAGCAGGTGGCGTTTACGAAGATC-3'。
反应体系为反应混合液12.5 μL，模板RNA 1 μL，TGF-β1引物1 μL，β-actin引物
1μL，RT/Taq酶1 μL，水9 μL，共25 μL。反应程序为(Perkin-Elmer 9600 PCR仪)：45 ℃30分钟，94 ℃2分钟，1个循环；94 ℃15秒，57 ℃30秒，72 ℃30秒，30个循环；72 ℃7分钟。
(4)1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物
取PCR产物16 μL电泳，紫外照相。应用Pharmacia LKB Ultro Scan扫描仪Gel Scan XL(2.1)软伴半定量分析扩增产物。
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2 结果
2.1 小鼠全肺照射1个月后，照射野内皮毛开始变白，至2个月全部变白(图1)，持续至7个月，开始长出黑毛。由皮毛变色的位置间接证明照射野之正确。
图1 照射2个月后，照射野内皮毛变白
(左为正常小鼠)
2.2 镜下可见：照射后8个月出现局部灶性纤维化区域，Masson染色见绿色胶原纤维，VG染色见红色胶原纤维，证实肺纤维化形成。正常对照组未见异常。
2.3 从肺组织中提取的RNA，测定A260/A280＝1.95～2.00。经甲醛变性凝胶电泳分析RNA提取质量，见18 S和28 S处分别出现一条很亮的条带，且28 S的亮度约为18 S的2倍，说明提取的总RNA未发生明显降解。
, 百拇医药
应用RT-PCR方法分析照射后小鼠肺组织中TGF-β1基因的表达，各标本均于279 bp处出现条带，亮度不一，说明照射后发生TGF-β1基因表达的改变。应用Pharmacia LKB Ultro Scan扫描仪Gel Scan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物，实验资料转化为图2。
图2 小鼠全肺照射后不同时间点肺组织
TGF-β1 mRNA表达情况
可见照射后36小时TGF-β1基因表达低于正常对照；至照射后2个月TGF-β1基因表达呈现升高趋势；照射后8个月，TGF-β1基因表达略呈下降，但仍高于正常对照。
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3 讨论
原始假设认为，肺纤维化的形成是由于肺实质细胞受损后由结缔组织替代的过程。随着分子生物学的进展，人们认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化。实验表明，照射后几小时到几天,大量生长因子合成、分泌并持续几个月之久，这些早期变化对晚期病理生理的改变具有深刻的影响。其中与肺纤维化关系密切的有TGF-β1，PDGF，TNF-α，白细胞介素-1(IL-1)，胰岛素生长因子-1(IGF-1)等，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用起始并维持着纤维化形成的过程[1-4]。
TGF-β1在细胞因子网络中占主导地位，它可趋化炎症细胞、成纤维细胞促进细胞合成IL-1，TNF-α，PDGF，亦可诱导渗入细胞和原处细胞产生更多TGF-β1，即自我诱导性地扩大生物学效应；同时调节细胞外基质(ECM)。一方面它能刺激ECM各种成分的合成增多，包括Ⅰ，Ⅲ型胶原、纤维连接素；另一方面，它可抑制蛋白水解酶的表达，抑制纤溶酶原、胶原酶原、基质酶原等酶原激活物产生诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而减少ECM的降解[5-9]。在多种因素导致的肺纤维化中(包括博莱霉素(BLM)、环磷酰胺(CTX)和放射)均发现TGF-β1含量增高[10-13]。放射治疗期间血浆中TGF-β1含量的变化可用于预测放射性肺损伤[14]。给予TGF-β1抗体可减轻BLM导致的肺纤维化[15]。可见TGF-β1含量的变化与肺纤维化有密切相关性。
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C57BL小鼠具有纤维化易感性，文献报告照射剂量为7～13 Gy，可引起广泛肺纤维化[16]。
用成熟的肺纤维化动物模型，在照射后一系列时间点观察肺纤维化形成过程，直至得到明确的组织学证据。在组织学证据的基础上，应用RT-PCR方法半定量检测细胞因子TGF-β1基因RNA水平在肺纤维化形成过程中的表达。结果发现照射后一短暂时间内(36小时)TGF-β1表达低于正常对照，到照射后2个月，TGF-β1升高，均高于相同鼠龄的正常对照组，照射后8个月，TGF-β1表达略呈下降趋势，但仍高于正常对照，提示细胞因子TGF-β1表达的变化与肺纤维化起始和形成密切相关。
参考文献
[1]Rodomann HP. Cellular basis of radiation-induced fibrosis. Radiother Oncol,1995,35 suppl 1:83-90.
, 百拇医药
[2]Graeme WM,Pharm B. Radiation and the lung:a revaluation of the mechanisms mediating pulmonary injury. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,31(2):361-369.
[3]Philip R,Carl J,Jacqueline P. A perpetual cascade of cytokines postirradiation leads to pulmonary fibrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,33(1):99-109.
[4]黄国成. β-转移生长因子与组织纤维化.国外医学临床生物化学检验学分册，1997，18
(1)：29-30.
, 百拇医药
[5]Ignotz RA. TGF-β stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix. J Biol Chem,1986,261(10):4337-4342.
[6]Westergren Thorssor GA. Altered expression of small proteoglycans,collagen and TGF-β in developing Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. J Clin Invest,1993,92(2);632-637.
[7]Sharplin J,Franko A. A quantitative histological study of strain-dependent difference in the effects of irradiation on mouse lung during the intermediate and late phases. Radiat Res,1989,119(1):15-31.
, http://www.100md.com
[8]Julian DD,Gordon S. The expression of early and late damage after thoracic irradiation:a comparison between CBA and C57BL mice. Radiat Res,1983,96(3):603-610.
[9]宾亮华. 生长因子与肺纤维化. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997，17(1)：19-21.
[10]Phan SH,Kunkel SL.Lung cytokine production in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Exp Lung Res,1992,18(1):29-43.
[11]Hoyt DG,Lazo JS. Alterations in pulmonary mRNA encoding procollagens,fibronectin and TGF-β precede Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1988,246(2):765-770.
, 百拇医药
[12]Khalil N,Bereznay M,Sporn M. Macrophage production of TGF-β and fibroblast collagen synthesis in chronic pulmonary inflammation. J Exp Med,1989,170(3):727-737.
[13]Hoyt DG,Lazo JS. Early increase in pulmonary mRNA encoding procollagens and TGF-β in mice sensitive to precede cyclophosphamide-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1989,249(1):38-43.
[14]Anscher MS,Murase T,Prescott DM. Changes in plasma TGF-β levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pneumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30(3):671-676.
, 百拇医药
[15]Giri SN,Hyde DM,Hollinger MA. Effect of antibody to TGF-β on bleomycin induced accumulation of lung collagen in mice. Thorax,1993,48(10):959-966.
[16]Franko AJ,Sharplin J,Ghahary A. Immunohistochemical localization of transforming growth factor and tumor necrosis factor in the lungs of fibrosis-prone and "non-fibrosing" mice during the latent period and early phase after irradiation. Radiat Res,1997,148(3):245-256.
(收稿：1998-05-12 修回：1998-06-19), 百拇医药
单位：300060 天津医科大学附属肿瘤医院(崔晓利)；中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院(刘海玲、董秀癑、殷蔚伯)
关键词：转化生长因子β1；聚合酶链反应；肺纤维化
中华放射肿瘤学杂志990115 【摘要】目的 探讨转化生长因子β1(TGFβ1)在小鼠放射性肺纤维化形成过程中表达变化及作用。方法 雄性C57BL小鼠，全肺1次照射13 Gy，不同时间取肺组织HE染色、Masson染色、VG染色观察肺纤维化形成。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定肺组织内TGF-β1的表达。结果 照射后8个月局部灶性纤维化形成。照射后36小时TGF-β1表达下降；照射后2个月TGF-β1表达升高；至照射后8个月，略呈下降趋势，但仍高于正常对照。结论 TGF-β1的表达在肺纤维化形成过程中起重要作用。
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The role of TGF-β1 expression in the formation of lung fibrosis in mice after thoracic irradiation
CUI Xiaoli*,LIU Hailing,DONG Xiuyue,et al.
*Tianjin Cancer Hospital,Tianjin 300060
【Abstract】Objective To study the role of expression of TGF-β1 in the formation of lung fibrosis in mice after thoracic irradiation. Methods Using the lungs of C57BL mice,we observed the histological changes stained with HE,Masson and VG up to 8 months after whole thorax irradiation.Expression of TGF-β1 was evaluated by RT-PCR technique. Results The expression of TGF-β1 decreased at H 36 after whole thoracic irradiation,increased in 2 months and remained elevated until 8 months when lung fibrosis appeared. Conclusions These studies clearly demonstrate that alterations in expression of TGF-β1 occur very early after pulmonary irradiation and may play a role in the development of chronic fibrosis
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【Key words】Tranforming growth factor β1 Polymerase chain reaction Lung/fibrosis
放射性肺损伤包括放射性肺炎及放射性肺纤维化，它不仅限制放射剂量且增加患者死亡率。虽然有关此方面的临床报道很多，但其发病机理不清，缺乏简便易行的预测指标，成为胸部照射的棘手问题。随着分子生物学技术的发展，人们逐渐认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用起始并维持着放射性肺损伤的过程，这些细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF-α)，TGF-β1，血小板衍化生长因子(PDGF)等。为此作者对X线照射后小鼠肺组织中细胞因子TGF-β1表达的变化进行了测定。
1 材料与方法
1.1 肺照射及标本制备：近交系C57BL小鼠，雄性，18～22 g体重(中国医学科学院肿瘤医院动物中心提供)，8只一笼，饲料、饮水不限。
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小鼠清醒状态固定板上，体表置2 cm厚蜡块，全肺单次照射13 Gy。Philips SL 75-10直线加速器8 MV-X线，剂量率＝490 cGy/min。
于照射后36小时、20天、2个月、7个月、8个月、9个月断颈活杀照射组及相同鼠龄对照组小鼠，左肺置于10%中性甲醛溶液中固定24小时，常规脱水、浸蜡、包埋、切片。分别行HE染色、Masson染色、VG染色观察肺纤维化形成。右肺置于液氮中保存。
1.2 TGF-β1测定：
(1)组织中总RNA的提取(TRIZOL试剂盒)
将照射后36小时、2个月、8个月3个时间点的小鼠肺组织各100 mg研磨成粉末，置于匀浆器中，加1 mL TRIZOL裂解液匀浆。室温孵育5分钟，加0.2 mL氯仿，强烈震荡15秒，室温孵育2～3分钟。4 ℃12 000 g离心15分钟，转水相于新管中，加异丙醇0.5 mL，室温孵育10分钟。4 ℃12 000 g离心10分钟，RNA沉淀。去上清，75%乙醇冲洗2次。真空抽干，溶于焦磷酸二乙酯(DEPC)处理的水中。
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(2)RNA定量及电泳鉴定提取的RNA
取5 μL RNA溶液加600 μL DEPC处理的水，用Graphtoord UV-240紫外分光光度仪测A值。RNA纯度＝A260/A280，RNA浓度＝A260×40(μg/mL)×稀释倍数。RNA样本用变性RNA琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
(3)RT-PCR(SUPERSCRIPT ONE-STEP RT-PCR SYSTEM 试剂盒)引物序列
TGF-β1：
(F)5'-ACCTGCAAGACCATCGACAT-3'；
(R)5'-GGTTTTCTCATAGATGGCGT-3'。
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β-actin：
(F)5'-CGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACC-3'；
(R)5'-GTAGCAGGTGGCGTTTACGAAGATC-3'。
反应体系为反应混合液12.5 μL，模板RNA 1 μL，TGF-β1引物1 μL，β-actin引物
1μL，RT/Taq酶1 μL，水9 μL，共25 μL。反应程序为(Perkin-Elmer 9600 PCR仪)：45 ℃30分钟，94 ℃2分钟，1个循环；94 ℃15秒，57 ℃30秒，72 ℃30秒，30个循环；72 ℃7分钟。
(4)1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物
取PCR产物16 μL电泳，紫外照相。应用Pharmacia LKB Ultro Scan扫描仪Gel Scan XL(2.1)软伴半定量分析扩增产物。
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2 结果
2.1 小鼠全肺照射1个月后，照射野内皮毛开始变白，至2个月全部变白(图1)，持续至7个月，开始长出黑毛。由皮毛变色的位置间接证明照射野之正确。
图1 照射2个月后，照射野内皮毛变白
(左为正常小鼠)
2.2 镜下可见：照射后8个月出现局部灶性纤维化区域，Masson染色见绿色胶原纤维，VG染色见红色胶原纤维，证实肺纤维化形成。正常对照组未见异常。
2.3 从肺组织中提取的RNA，测定A260/A280＝1.95～2.00。经甲醛变性凝胶电泳分析RNA提取质量，见18 S和28 S处分别出现一条很亮的条带，且28 S的亮度约为18 S的2倍，说明提取的总RNA未发生明显降解。
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应用RT-PCR方法分析照射后小鼠肺组织中TGF-β1基因的表达，各标本均于279 bp处出现条带，亮度不一，说明照射后发生TGF-β1基因表达的改变。应用Pharmacia LKB Ultro Scan扫描仪Gel Scan XL(2.1)软件半定量分析扩增产物，实验资料转化为图2。
图2 小鼠全肺照射后不同时间点肺组织
TGF-β1 mRNA表达情况
可见照射后36小时TGF-β1基因表达低于正常对照；至照射后2个月TGF-β1基因表达呈现升高趋势；照射后8个月，TGF-β1基因表达略呈下降，但仍高于正常对照。
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3 讨论
原始假设认为，肺纤维化的形成是由于肺实质细胞受损后由结缔组织替代的过程。随着分子生物学的进展，人们认识到单一靶细胞或靶组织受损的概念已无法解释照射后一系列的动态变化。实验表明，照射后几小时到几天,大量生长因子合成、分泌并持续几个月之久，这些早期变化对晚期病理生理的改变具有深刻的影响。其中与肺纤维化关系密切的有TGF-β1，PDGF，TNF-α，白细胞介素-1(IL-1)，胰岛素生长因子-1(IGF-1)等，细胞因子媒介的多细胞间的相互作用起始并维持着纤维化形成的过程[1-4]。
TGF-β1在细胞因子网络中占主导地位，它可趋化炎症细胞、成纤维细胞促进细胞合成IL-1，TNF-α，PDGF，亦可诱导渗入细胞和原处细胞产生更多TGF-β1，即自我诱导性地扩大生物学效应；同时调节细胞外基质(ECM)。一方面它能刺激ECM各种成分的合成增多，包括Ⅰ，Ⅲ型胶原、纤维连接素；另一方面，它可抑制蛋白水解酶的表达，抑制纤溶酶原、胶原酶原、基质酶原等酶原激活物产生诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而减少ECM的降解[5-9]。在多种因素导致的肺纤维化中(包括博莱霉素(BLM)、环磷酰胺(CTX)和放射)均发现TGF-β1含量增高[10-13]。放射治疗期间血浆中TGF-β1含量的变化可用于预测放射性肺损伤[14]。给予TGF-β1抗体可减轻BLM导致的肺纤维化[15]。可见TGF-β1含量的变化与肺纤维化有密切相关性。
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C57BL小鼠具有纤维化易感性，文献报告照射剂量为7～13 Gy，可引起广泛肺纤维化[16]。
用成熟的肺纤维化动物模型，在照射后一系列时间点观察肺纤维化形成过程，直至得到明确的组织学证据。在组织学证据的基础上，应用RT-PCR方法半定量检测细胞因子TGF-β1基因RNA水平在肺纤维化形成过程中的表达。结果发现照射后一短暂时间内(36小时)TGF-β1表达低于正常对照，到照射后2个月，TGF-β1升高，均高于相同鼠龄的正常对照组，照射后8个月，TGF-β1表达略呈下降趋势，但仍高于正常对照，提示细胞因子TGF-β1表达的变化与肺纤维化起始和形成密切相关。
参考文献
[1]Rodomann HP. Cellular basis of radiation-induced fibrosis. Radiother Oncol,1995,35 suppl 1:83-90.
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[2]Graeme WM,Pharm B. Radiation and the lung:a revaluation of the mechanisms mediating pulmonary injury. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,31(2):361-369.
[3]Philip R,Carl J,Jacqueline P. A perpetual cascade of cytokines postirradiation leads to pulmonary fibrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1995,33(1):99-109.
[4]黄国成. β-转移生长因子与组织纤维化.国外医学临床生物化学检验学分册，1997，18
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[5]Ignotz RA. TGF-β stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix. J Biol Chem,1986,261(10):4337-4342.
[6]Westergren Thorssor GA. Altered expression of small proteoglycans,collagen and TGF-β in developing Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. J Clin Invest,1993,92(2);632-637.
[7]Sharplin J,Franko A. A quantitative histological study of strain-dependent difference in the effects of irradiation on mouse lung during the intermediate and late phases. Radiat Res,1989,119(1):15-31.
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[8]Julian DD,Gordon S. The expression of early and late damage after thoracic irradiation:a comparison between CBA and C57BL mice. Radiat Res,1983,96(3):603-610.
[9]宾亮华. 生长因子与肺纤维化. 国外医学生理、病理科学与临床分册，1997，17(1)：19-21.
[10]Phan SH,Kunkel SL.Lung cytokine production in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Exp Lung Res,1992,18(1):29-43.
[11]Hoyt DG,Lazo JS. Alterations in pulmonary mRNA encoding procollagens,fibronectin and TGF-β precede Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1988,246(2):765-770.
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[13]Hoyt DG,Lazo JS. Early increase in pulmonary mRNA encoding procollagens and TGF-β in mice sensitive to precede cyclophosphamide-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther,1989,249(1):38-43.
[14]Anscher MS,Murase T,Prescott DM. Changes in plasma TGF-β levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pneumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30(3):671-676.
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[15]Giri SN,Hyde DM,Hollinger MA. Effect of antibody to TGF-β on bleomycin induced accumulation of lung collagen in mice. Thorax,1993,48(10):959-966.
[16]Franko AJ,Sharplin J,Ghahary A. Immunohistochemical localization of transforming growth factor and tumor necrosis factor in the lungs of fibrosis-prone and "non-fibrosing" mice during the latent period and early phase after irradiation. Radiat Res,1997,148(3):245-256.
(收稿：1998-05-12 修回：1998-06-19), 百拇医药