利用免疫聚合酶链反应探讨HBsAg阴性/HBV DNA阳性的形成原因
作者：彭晓谋 姚集鲁 郭万里 陈雪娟
单位：510630 广州，中山医科大学附属第三医院
关键词：
中华传染病杂志990119 免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)结合了PCR的高度敏感性和免疫技术能检测各种抗原物质的特性，已被应用于癌蛋白、细胞受体及其它微量抗原物质的检测[1，2]。免疫PCR检测HBsAg的敏感性远远高于ELISA法[3]。临床检验中常出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的现象，约占临床检验患者的10%～25%[4]，其形成原因尚不十分清楚。目前常采用ELISA检测HBsAg，PCR检测HBV DNA。这两种方法的敏感性差别极大，不能全面正确阐明上述现象的形成原因。本研究利用高度敏感的免疫PCR提高HBsAg检测的敏感性，并对临床检验中出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因作进一步探讨。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
(一) 病例 452例有HBV DNA(PCR法)、HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc等资料的血清标本收集于1996年1月至1997年5月，均系本研究室的临检标本。全部病例均为HBV DNA阳性，23例为HBsAg阴性。23例HBsAg阴性者中，有16例2～8月前收到了另一血清标本。
(二) 试剂 抗-HBs单抗本研究室自制，多抗(羊抗)系DAKO公司产品。Biotin-二抗(兔抗羊IgG抗体)系GIBco BRL公司产品；439bp Biotin-DNA片段为自行研制；亲合素(Extra Avidin)系Sigma产品。
二、方法
(一) 免疫PCR检测HBsAg 抗-HBs单抗常规包被微量板，洗去过量的抗体后，加血清于37°C温育30分钟，再依次加入抗-HBs多抗、Biotin-二抗、亲合素和Biotin-DNA。彻底清洗后加入30μl蒸馏水，95°C DNA变性，取5μl进行PCR扩增。PCR条件和引物序列见参考文献[5]。产物为203bp。采用4份HBsAg和HBV DNA均阳性的不同稀释(5倍)血清来评价免疫PCR的敏感性。
, http://www.100md.com
(二) RIA检测HBsAg 23份HBsAg(-)/HBV DNA(+)血清同时采用RIA复查HBsAg。
(三) 复查HBV DNA 23份HBs-Ag(-)/HBV DNA(+)血清采用S基因和X基因区引物分别进行PCR扩增，复查HBV DNA。
(四) 单链构型多态性分析 双份血清若均为HBV DNA阳性则进行单链构型多态性(SSCP)分析，了解HBV DNA的突变情况。
结果
一、免疫PCR的敏感性
对梯度血清进行检测时发现，免疫PCR的敏感性高于RIA法5～125倍。
二、RIA和免疫PCR检测HBsAg
, 百拇医药
23例HBsAg(-)/HBV DNA(+)患者中，免疫PCR 检出12例，阳性率为52.2%，RIA检出10例，阳性率为43.5%。
三、复查HBV DNA
临检所用引物来自S基因，为了评价PCR污染在HBsAg(-)/HBV DNA(+)形成中的意义，本研究首先采用与临检同样的方法(S区引物)进行复查。结果仅10例呈阳性，阳性率为43.5%。然后，应用X区引物的PCR进行复查。与S区引物的结果相比，重复率达90%(9/10)，提示本研究的结果是准确的，而临检中存在污染。
四、HBsAg检出与HBV DNA检出的关系
HBsAg和HBV DNA检出的关系见表1。RIA法阳性者有1例为HBV DNA阴性，而免疫PCR检测HBsAg为阳性者HBV DNA均为阳性。
, 百拇医药
表1 HBsAg检出与HBV DNA检出的关系表 项 目
HBsAg(RIA)
HBsAg(immuno-PCR)
+
-
+
-
例数
10
13
12
11
, 百拇医药 HBV DNA(S区引物)阳性
9
1
10
0
HBV DNA(X区引物)阳性
8
1
9
0
五、免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系
免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系见表2。初步随访发现，23例HBsAg(—)/HBV DNA(+)患者中，1例为无HBV感染标志，该患者临床诊断为甲型肝炎，3次复查HBV血清标志均为阴性，2次复查为HBV DNA阴性，提示为PCR污染。免疫PCR阳性的2例单项抗-HBc(+)和3例伴其它抗原抗体的抗-HBs(+)患者1～3个月后复查HBV血清标志时HBsAg(+)。
, 百拇医药
表2 免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系 项 目
例数
immuno-PCR
阳性例数
阳性率(%)
无HBV标志
1
0
0
单项抗-HBs(+)
4
0
, 百拇医药
0
抗-HBs(+)/HBsAg或抗-HBc(+)
8
6
75**
单项抗-HBc(+)
5
3
60*
HBsAg(+)和/或抗-HBc(+)
5
3
, 百拇医药
60*
*后三组合并与单项抗-HBs(+)χ2统计，Fisher精确概率为0.0287；
**与单项抗-HBs(+)χ2统计，Fisher精确概率为0.0303
六、SSCP分析
6例患者双份血清为HBV DNA(S区引物)阳性。PCR产物为522bp，占S基因62.7%，包含了HBsAg主蛋白的主要抗原决定簇(氨基酸残基117～147)。以前后血清对比的方式进行SSCP分析发现，仅1例患者为SSCP阳性。
讨论
免疫PCR是目前检测抗原抗体最敏感的方法。用它来检测血清中的抗原时，敏感性高于ELISA约103倍[2]，检测血清中的HBsAg则可达0.5pg/L[3]。本研究发现，免疫PCR的敏感性也高于RIA法约5～125倍，应用于评价HBsAg(-)/HBV DNA(+)的形成原因也获得满意结果。因此，免疫PCR因其突出的高敏感性而有着广泛的应用前景。23例HBsAg(-)/HBV DNA(+)的患者中，12例免疫PCR检测为阳性，阳性率为52.2%。与原乙型肝炎标志(HBSAg、抗-HBS、HBeAg、抗-HBe、抗-HBC)比较发现，免疫PCR检测的阳性病例主要为单项抗-HBc(+)或抗-HBs(+)伴其它抗原抗体患者。因此，HBV感染的恢复早期，即抗-HBs(+)形成早期使HBsAg处于低水平是ELISA出现假阴性的主要原因。
, 百拇医药
肝病患者中HBsAg(-)/HBV DNA(+)的流行率为25%[4]，较本研究的流行率(5.1%，23/452)高。目前认为HBsAg(-)/HBV DNA(+)的形成原因是处于HBV感染恢复期和HBV基因突变[6，7]。但有关HBV基因突变的报道仅为横向比较，缺乏个体自身的前后纵向比较[6，7]，因此，无法区分基因突变和变异株感染。“a”决定簇的突变在HBsAg阳性与阴性患者中的频率差异无显著性[6]，因此，基因突变在HBsAg(-)/HBV DNA(+)形成中意义尚需进一步探讨。本研究结合免疫PCR对临床检查中出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因进行了全面分析。发现43.5%(10/23)的血清为ELISA的敏感性不高造成，56.5%(13/23)有可能是HBV DNA检测中的假阳性。进一步纵向比较6例患者的双份血清发现，S基因的主要抗原决定簇仅1例存在突变。因此，处于HBV感染恢复期是临检HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因之一，而突变可能不是主要原因。进一步增加病例数，延长随访时间可最终阐明这一问题。
, http://www.100md.com
PCR假阳性的主要原因是污染，PCR的污染问题似乎是较难控制的普遍问题，常规设立一个阴性对照不足以完全排除PCR的假阳性[8]。在大规模、长期的临床检验中，污染的问题更为突出。我室采用严格的措施控制污染，但仍存在低水平的污染。
本课题由广东省自然科学基金(970079)和广东省青年基金(97031)资助
参考文献
1 Sperl J, Paliwal V, Ramabhadran R, et al. Soluble T cell receptors: detection and quantitative assay in fluid phase via ELISA or immuno-PCR. J Immunol Methods, 1995, 186:181-194.
2 Suzuki A, Itoh F, Hinoda Y, et al. Double determinant immuno-polymerase chain reaction: a sensitive method for detecting of circulating antigens in sera. Jpn J Cancer Res, 1995, 86:885-889.
3 Maia M, Takashi H, Adler K, et al. Development of a two-site immuno-PCR assay for hepatitis B surface antigen. J Virol Methods, 1995, 52:273-286.
4 骆抗先.HBsAg阴性的HBV感染.见：骆抗先，主编.乙型肝炎基础与临床.北京：人民卫生出版社，1997.246-259., 百拇医药
单位：510630 广州，中山医科大学附属第三医院
关键词：
中华传染病杂志990119 免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)结合了PCR的高度敏感性和免疫技术能检测各种抗原物质的特性，已被应用于癌蛋白、细胞受体及其它微量抗原物质的检测[1，2]。免疫PCR检测HBsAg的敏感性远远高于ELISA法[3]。临床检验中常出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的现象，约占临床检验患者的10%～25%[4]，其形成原因尚不十分清楚。目前常采用ELISA检测HBsAg，PCR检测HBV DNA。这两种方法的敏感性差别极大，不能全面正确阐明上述现象的形成原因。本研究利用高度敏感的免疫PCR提高HBsAg检测的敏感性，并对临床检验中出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因作进一步探讨。
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材料与方法
一、材料
(一) 病例 452例有HBV DNA(PCR法)、HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc等资料的血清标本收集于1996年1月至1997年5月，均系本研究室的临检标本。全部病例均为HBV DNA阳性，23例为HBsAg阴性。23例HBsAg阴性者中，有16例2～8月前收到了另一血清标本。
(二) 试剂 抗-HBs单抗本研究室自制，多抗(羊抗)系DAKO公司产品。Biotin-二抗(兔抗羊IgG抗体)系GIBco BRL公司产品；439bp Biotin-DNA片段为自行研制；亲合素(Extra Avidin)系Sigma产品。
二、方法
(一) 免疫PCR检测HBsAg 抗-HBs单抗常规包被微量板，洗去过量的抗体后，加血清于37°C温育30分钟，再依次加入抗-HBs多抗、Biotin-二抗、亲合素和Biotin-DNA。彻底清洗后加入30μl蒸馏水，95°C DNA变性，取5μl进行PCR扩增。PCR条件和引物序列见参考文献[5]。产物为203bp。采用4份HBsAg和HBV DNA均阳性的不同稀释(5倍)血清来评价免疫PCR的敏感性。
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(二) RIA检测HBsAg 23份HBsAg(-)/HBV DNA(+)血清同时采用RIA复查HBsAg。
(三) 复查HBV DNA 23份HBs-Ag(-)/HBV DNA(+)血清采用S基因和X基因区引物分别进行PCR扩增，复查HBV DNA。
(四) 单链构型多态性分析 双份血清若均为HBV DNA阳性则进行单链构型多态性(SSCP)分析，了解HBV DNA的突变情况。
结果
一、免疫PCR的敏感性
对梯度血清进行检测时发现，免疫PCR的敏感性高于RIA法5～125倍。
二、RIA和免疫PCR检测HBsAg
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23例HBsAg(-)/HBV DNA(+)患者中，免疫PCR 检出12例，阳性率为52.2%，RIA检出10例，阳性率为43.5%。
三、复查HBV DNA
临检所用引物来自S基因，为了评价PCR污染在HBsAg(-)/HBV DNA(+)形成中的意义，本研究首先采用与临检同样的方法(S区引物)进行复查。结果仅10例呈阳性，阳性率为43.5%。然后，应用X区引物的PCR进行复查。与S区引物的结果相比，重复率达90%(9/10)，提示本研究的结果是准确的，而临检中存在污染。
四、HBsAg检出与HBV DNA检出的关系
HBsAg和HBV DNA检出的关系见表1。RIA法阳性者有1例为HBV DNA阴性，而免疫PCR检测HBsAg为阳性者HBV DNA均为阳性。
, 百拇医药
表1 HBsAg检出与HBV DNA检出的关系表 项 目
HBsAg(RIA)
HBsAg(immuno-PCR)
+
-
+
-
例数
10
13
12
11
, 百拇医药 HBV DNA(S区引物)阳性
9
1
10
0
HBV DNA(X区引物)阳性
8
1
9
0
五、免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系
免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系见表2。初步随访发现，23例HBsAg(—)/HBV DNA(+)患者中，1例为无HBV感染标志，该患者临床诊断为甲型肝炎，3次复查HBV血清标志均为阴性，2次复查为HBV DNA阴性，提示为PCR污染。免疫PCR阳性的2例单项抗-HBc(+)和3例伴其它抗原抗体的抗-HBs(+)患者1～3个月后复查HBV血清标志时HBsAg(+)。
, 百拇医药
表2 免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系 项 目
例数
immuno-PCR
阳性例数
阳性率(%)
无HBV标志
1
0
0
单项抗-HBs(+)
4
0
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0
抗-HBs(+)/HBsAg或抗-HBc(+)
8
6
75**
单项抗-HBc(+)
5
3
60*
HBsAg(+)和/或抗-HBc(+)
5
3
, 百拇医药
60*
*后三组合并与单项抗-HBs(+)χ2统计，Fisher精确概率为0.0287；
**与单项抗-HBs(+)χ2统计，Fisher精确概率为0.0303
六、SSCP分析
6例患者双份血清为HBV DNA(S区引物)阳性。PCR产物为522bp，占S基因62.7%，包含了HBsAg主蛋白的主要抗原决定簇(氨基酸残基117～147)。以前后血清对比的方式进行SSCP分析发现，仅1例患者为SSCP阳性。
讨论
免疫PCR是目前检测抗原抗体最敏感的方法。用它来检测血清中的抗原时，敏感性高于ELISA约103倍[2]，检测血清中的HBsAg则可达0.5pg/L[3]。本研究发现，免疫PCR的敏感性也高于RIA法约5～125倍，应用于评价HBsAg(-)/HBV DNA(+)的形成原因也获得满意结果。因此，免疫PCR因其突出的高敏感性而有着广泛的应用前景。23例HBsAg(-)/HBV DNA(+)的患者中，12例免疫PCR检测为阳性，阳性率为52.2%。与原乙型肝炎标志(HBSAg、抗-HBS、HBeAg、抗-HBe、抗-HBC)比较发现，免疫PCR检测的阳性病例主要为单项抗-HBc(+)或抗-HBs(+)伴其它抗原抗体患者。因此，HBV感染的恢复早期，即抗-HBs(+)形成早期使HBsAg处于低水平是ELISA出现假阴性的主要原因。
, 百拇医药
肝病患者中HBsAg(-)/HBV DNA(+)的流行率为25%[4]，较本研究的流行率(5.1%，23/452)高。目前认为HBsAg(-)/HBV DNA(+)的形成原因是处于HBV感染恢复期和HBV基因突变[6，7]。但有关HBV基因突变的报道仅为横向比较，缺乏个体自身的前后纵向比较[6，7]，因此，无法区分基因突变和变异株感染。“a”决定簇的突变在HBsAg阳性与阴性患者中的频率差异无显著性[6]，因此，基因突变在HBsAg(-)/HBV DNA(+)形成中意义尚需进一步探讨。本研究结合免疫PCR对临床检查中出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因进行了全面分析。发现43.5%(10/23)的血清为ELISA的敏感性不高造成，56.5%(13/23)有可能是HBV DNA检测中的假阳性。进一步纵向比较6例患者的双份血清发现，S基因的主要抗原决定簇仅1例存在突变。因此，处于HBV感染恢复期是临检HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因之一，而突变可能不是主要原因。进一步增加病例数，延长随访时间可最终阐明这一问题。
, http://www.100md.com
PCR假阳性的主要原因是污染，PCR的污染问题似乎是较难控制的普遍问题，常规设立一个阴性对照不足以完全排除PCR的假阳性[8]。在大规模、长期的临床检验中，污染的问题更为突出。我室采用严格的措施控制污染，但仍存在低水平的污染。
本课题由广东省自然科学基金(970079)和广东省青年基金(97031)资助
参考文献
1 Sperl J, Paliwal V, Ramabhadran R, et al. Soluble T cell receptors: detection and quantitative assay in fluid phase via ELISA or immuno-PCR. J Immunol Methods, 1995, 186:181-194.
2 Suzuki A, Itoh F, Hinoda Y, et al. Double determinant immuno-polymerase chain reaction: a sensitive method for detecting of circulating antigens in sera. Jpn J Cancer Res, 1995, 86:885-889.
3 Maia M, Takashi H, Adler K, et al. Development of a two-site immuno-PCR assay for hepatitis B surface antigen. J Virol Methods, 1995, 52:273-286.
4 骆抗先.HBsAg阴性的HBV感染.见：骆抗先，主编.乙型肝炎基础与临床.北京：人民卫生出版社，1997.246-259., 百拇医药