血清乙型肝炎病毒核酸定量检测与临床关系
作者：杨湛 黄海 冼超
单位：510060 广州市第八人民医院
关键词：
中华传染病杂志990118 在乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染过程中，病毒量在病程中的变化规律一直为人们关注。近年建立的定量PCR方法，为定量观察病毒提供了一个灵敏的指标。采用这一方法，我们动态观察了32例慢性乙型肝炎(乙肝)患者自然病程中血清HBV DNA拷贝数与肝功能、临床类型及在重叠感染时的关系，现将结果报告如下。
材料和方法
一、病例选择与病原学诊断标准
全部病例为1996年2月至5月本院住院患者，共32例，男28例，女4例；年龄12～51岁，平均32.6岁。所有患者HBsAg阳性，病程在6个月以上。按照1995年第五次全国传染与寄生虫病学术会议修订的诊断标准，其中符合病毒性肝炎慢性轻度6例，中度22例，重度4例。入院后重复2次检测有抗-HAV-IgM(+)，或抗-HCV(+)和HCV RNA(+)(PCR法)；或抗-HDV-IgM(+)；或抗-HEV-IgM/IgG(+)者，分别诊断为乙肝重叠甲、丙、丁、戊肝。32例中乙肝单独感染22例(68.8%)，乙肝与其它肝炎病毒重叠感染10例(31.3%)，其中乙+戊5例，乙+丙3例，乙+丁+甲2例。
, http://www.100md.com
二、检测方法
(一) 肝炎病毒抗体检测 均采用EIA方法。抗-HCV试剂盒购自天津普生科技有限公司；抗-HAV-IgM、抗-HDV-IgM、HBsAg试剂盒购自珠海丽珠生物技术公司；抗-HEV-IgM/IgG试剂盒购自美国Genelabs公司。每份标本均经2次阳性后确认。
(二) HCV RNA检测 采用RT-PCR，试剂盒购自中国军事医学科学院。
(三) HBV DNA定量检测 血清样本提取核酸模板，然后以定量PCR检测HBV DNA拷贝数，具体方法见文献[1]。入院时及每2周检测1次，直至ALT恢复正常。
(四) 肝功能检测 采用全自动生化分析仪，入院时及每2周检测1次，直至ALT恢复正常。
三、治疗
, 百拇医药
每日静脉滴注复方丹参、肝安等，口服常规护肝药物，未使用抗病毒药及降酶药。
结果
一、治疗前后血清HBV DNA拷贝数和ALT的关系
见表1。
表1 HBV DNA拷贝数
与ALT的关系(
) 项目
HBV DNA
(E拷贝/μl)
ALT(U/L)
治疗前
, 百拇医药
3.38±1.72
863±112
治疗后
1.83±1.94*
51±13
*:与治疗前比较P<0.01
二、HBV单独感染与重叠感染血清HBV DNA定量检测结果
见图1。治疗前两组间HBV DNA拷贝数无差异，治疗后两组比较差异有显著性。
图1 HBV单独感染与混合感染组血清HBV DNA定量检测结果
, 百拇医药
三、轻、中、重度组血清HBV DNA定量检测结果
见图2。治疗前轻、重组间HBV DNA拷贝数差异有显著性，而轻、中组间和中、重组间比较差异无显著性。治疗后三组之间差异无显著性。
图2 轻、中、重度慢乙肝患者血清HBV DNA定量检测结果
讨论
慢性乙肝病程迁延，了解这一过程中病毒量的变化与临床的关系，对深入研究乙肝的临床过程和指导治疗有重要意义。本研究采用定量PCR方法检测血清中HBV拷贝数，结果32例患者中最高为每微升血清106.4拷贝(6.4E拷贝/μl)，5例阴性。全部病例若按>4E拷贝/μl、2～4E拷贝/μl、<2E拷贝/μl等将病毒量分为高、中、低三度，则高滴度占26.0%，中等滴度占62.9%，低滴度占11.2%。治疗前，ALT在最高值时HBV DNA平均值为(3.38±1.72)E拷贝/μl，治疗后，ALT恢复正常或接近正常时，HBV DNA平均值降至(1.83±1.94)E拷贝/μl。两者相比，差异有显著性。进一步分析HBV DNA与ALT的伴随关系，每2周1次追踪检测资料显示82.1%患者两者升降趋势一致或基本一致。以上结果提示大多数患者血清病毒水平并非衡定不变，而是随肝脏炎症情况波动，恢复期病毒减少，应是患者自身免疫系统清除的结果。这与既往的研究报告相符[2]。但是，有小部分患者(17.9%)血清HBV DNA与ALT无关，即在ALT波动过程中HBV DNA始终处于相对稳定水平。原因之一可能是引起本次ALT升高的主导病毒并非HBV[3]，另外，也与病程有关，动物实验发现，HBV感染100周后，病毒量与ALT异常可以不一致[4]。
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治疗前HBV DNA拷贝数平均值在HBV单独感染和重叠感染两组无差异，但ALT降至正常时，单独感染组的平均值显著高于混合组，HBV DNA阴转率也低于后者，分别为31.8%和85.7%。提示HBV与其它嗜肝病毒同时感染时，后者对HBV有干扰或抑制作用。这种现象已有许多报告，我们通过对HBV DNA动态定量观察，进一步证实了这一点。病毒相互干扰机制包括通过提高非特异免疫功能和直接干扰等两方面，研究发现，某些病毒能够通过竞争性抑制易感细胞膜受体或合成抑制蛋白等方式干扰另一病毒复制[5]，但嗜肝病毒间干扰的确切机制还不清楚。从本研究结果分析，对HBV的干扰主要可能是非特异免疫机制，因为发生在疾病恢复期。这种干扰是一过性还是持久性，不同嗜肝病毒对HBV干扰程度的区别如何等问题都需要进一步研究。
按病变不同程度观察轻、中、重各组治疗前HBV DNA拷贝数平均值，发现病毒量与病变程度成反比，因此，肝脏炎症程度似可作为估计病毒量的间接指标并指导抗病毒治疗时机选择。
, http://www.100md.com
经散点图观察和统计学处理证实，HBV DNA拷贝数与ALT恢复正常所需时间存在一定程度正相关(r=0.46,P<0.05)。这可以解释有些患者病情虽轻，但病程迁延。
参考文献
1 张复春，吴婉芬，董慧卿，等.定量PCR检测HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24-27.
2 Ranki M, Schatzl HM, Zachoval R, et al. Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studing viral replication activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology, 1995, 21:1492-1499.
, 百拇医药
3 Koike K, Yasuda K, Yotsukyanagi H, et al. Dominant replication of either virus in dual infection with hepatitis viruses B and C. J Med Virol, 1995, 45:236-239.
4 黄果勇，葛宪民，陈杰，等.熊猴实验感染人乙型肝炎病毒的血清学及分子生物学的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1993，13：245-248.
5 Bour S, Geleziunas R, Wainberg MA. The human immunodeficiency virus type Ⅰ (HIV-1) CD4 receptor and its central role in promotion of HIV-1 infection. Microbiol Rev, 1995,59:63-93.
(收稿：1997-01-15 修回：1998-05-18), http://www.100md.com
单位：510060 广州市第八人民医院
关键词：
中华传染病杂志990118 在乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染过程中，病毒量在病程中的变化规律一直为人们关注。近年建立的定量PCR方法，为定量观察病毒提供了一个灵敏的指标。采用这一方法，我们动态观察了32例慢性乙型肝炎(乙肝)患者自然病程中血清HBV DNA拷贝数与肝功能、临床类型及在重叠感染时的关系，现将结果报告如下。
材料和方法
一、病例选择与病原学诊断标准
全部病例为1996年2月至5月本院住院患者，共32例，男28例，女4例；年龄12～51岁，平均32.6岁。所有患者HBsAg阳性，病程在6个月以上。按照1995年第五次全国传染与寄生虫病学术会议修订的诊断标准，其中符合病毒性肝炎慢性轻度6例，中度22例，重度4例。入院后重复2次检测有抗-HAV-IgM(+)，或抗-HCV(+)和HCV RNA(+)(PCR法)；或抗-HDV-IgM(+)；或抗-HEV-IgM/IgG(+)者，分别诊断为乙肝重叠甲、丙、丁、戊肝。32例中乙肝单独感染22例(68.8%)，乙肝与其它肝炎病毒重叠感染10例(31.3%)，其中乙+戊5例，乙+丙3例，乙+丁+甲2例。
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二、检测方法
(一) 肝炎病毒抗体检测 均采用EIA方法。抗-HCV试剂盒购自天津普生科技有限公司；抗-HAV-IgM、抗-HDV-IgM、HBsAg试剂盒购自珠海丽珠生物技术公司；抗-HEV-IgM/IgG试剂盒购自美国Genelabs公司。每份标本均经2次阳性后确认。
(二) HCV RNA检测 采用RT-PCR，试剂盒购自中国军事医学科学院。
(三) HBV DNA定量检测 血清样本提取核酸模板，然后以定量PCR检测HBV DNA拷贝数，具体方法见文献[1]。入院时及每2周检测1次，直至ALT恢复正常。
(四) 肝功能检测 采用全自动生化分析仪，入院时及每2周检测1次，直至ALT恢复正常。
三、治疗
, 百拇医药
每日静脉滴注复方丹参、肝安等，口服常规护肝药物，未使用抗病毒药及降酶药。
结果
一、治疗前后血清HBV DNA拷贝数和ALT的关系
见表1。
表1 HBV DNA拷贝数
与ALT的关系(
) 项目HBV DNA
(E拷贝/μl)
ALT(U/L)
治疗前
, 百拇医药
3.38±1.72
863±112
治疗后
1.83±1.94*
51±13
*:与治疗前比较P<0.01
二、HBV单独感染与重叠感染血清HBV DNA定量检测结果
见图1。治疗前两组间HBV DNA拷贝数无差异，治疗后两组比较差异有显著性。
图1 HBV单独感染与混合感染组血清HBV DNA定量检测结果
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三、轻、中、重度组血清HBV DNA定量检测结果
见图2。治疗前轻、重组间HBV DNA拷贝数差异有显著性，而轻、中组间和中、重组间比较差异无显著性。治疗后三组之间差异无显著性。
图2 轻、中、重度慢乙肝患者血清HBV DNA定量检测结果
讨论
慢性乙肝病程迁延，了解这一过程中病毒量的变化与临床的关系，对深入研究乙肝的临床过程和指导治疗有重要意义。本研究采用定量PCR方法检测血清中HBV拷贝数，结果32例患者中最高为每微升血清106.4拷贝(6.4E拷贝/μl)，5例阴性。全部病例若按>4E拷贝/μl、2～4E拷贝/μl、<2E拷贝/μl等将病毒量分为高、中、低三度，则高滴度占26.0%，中等滴度占62.9%，低滴度占11.2%。治疗前，ALT在最高值时HBV DNA平均值为(3.38±1.72)E拷贝/μl，治疗后，ALT恢复正常或接近正常时，HBV DNA平均值降至(1.83±1.94)E拷贝/μl。两者相比，差异有显著性。进一步分析HBV DNA与ALT的伴随关系，每2周1次追踪检测资料显示82.1%患者两者升降趋势一致或基本一致。以上结果提示大多数患者血清病毒水平并非衡定不变，而是随肝脏炎症情况波动，恢复期病毒减少，应是患者自身免疫系统清除的结果。这与既往的研究报告相符[2]。但是，有小部分患者(17.9%)血清HBV DNA与ALT无关，即在ALT波动过程中HBV DNA始终处于相对稳定水平。原因之一可能是引起本次ALT升高的主导病毒并非HBV[3]，另外，也与病程有关，动物实验发现，HBV感染100周后，病毒量与ALT异常可以不一致[4]。
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治疗前HBV DNA拷贝数平均值在HBV单独感染和重叠感染两组无差异，但ALT降至正常时，单独感染组的平均值显著高于混合组，HBV DNA阴转率也低于后者，分别为31.8%和85.7%。提示HBV与其它嗜肝病毒同时感染时，后者对HBV有干扰或抑制作用。这种现象已有许多报告，我们通过对HBV DNA动态定量观察，进一步证实了这一点。病毒相互干扰机制包括通过提高非特异免疫功能和直接干扰等两方面，研究发现，某些病毒能够通过竞争性抑制易感细胞膜受体或合成抑制蛋白等方式干扰另一病毒复制[5]，但嗜肝病毒间干扰的确切机制还不清楚。从本研究结果分析，对HBV的干扰主要可能是非特异免疫机制，因为发生在疾病恢复期。这种干扰是一过性还是持久性，不同嗜肝病毒对HBV干扰程度的区别如何等问题都需要进一步研究。
按病变不同程度观察轻、中、重各组治疗前HBV DNA拷贝数平均值，发现病毒量与病变程度成反比，因此，肝脏炎症程度似可作为估计病毒量的间接指标并指导抗病毒治疗时机选择。
, http://www.100md.com
经散点图观察和统计学处理证实，HBV DNA拷贝数与ALT恢复正常所需时间存在一定程度正相关(r=0.46,P<0.05)。这可以解释有些患者病情虽轻，但病程迁延。
参考文献
1 张复春，吴婉芬，董慧卿，等.定量PCR检测HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24-27.
2 Ranki M, Schatzl HM, Zachoval R, et al. Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studing viral replication activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology, 1995, 21:1492-1499.
, 百拇医药
3 Koike K, Yasuda K, Yotsukyanagi H, et al. Dominant replication of either virus in dual infection with hepatitis viruses B and C. J Med Virol, 1995, 45:236-239.
4 黄果勇，葛宪民，陈杰，等.熊猴实验感染人乙型肝炎病毒的血清学及分子生物学的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1993，13：245-248.
5 Bour S, Geleziunas R, Wainberg MA. The human immunodeficiency virus type Ⅰ (HIV-1) CD4 receptor and its central role in promotion of HIV-1 infection. Microbiol Rev, 1995,59:63-93.
(收稿：1997-01-15 修回：1998-05-18), http://www.100md.com