外周血单个核细胞与血清中HBV DNA及其变异比较
作者：郭亚兵 张继锁 侯金林 姜荣龙 杨云芬 章廉 顾小维 骆抗先
单位：郭亚兵、侯金林、姜荣龙、杨云芬、章廉、顾小维、骆抗先 510515 广州，第一军医大学南方医院；张继锁 解放军第260医院
关键词：
中华传染病杂志990116 人外周血单个核细胞(PBMC)中存在HBV DNA[1]的生物学意义远未阐明。我们用动态观测PBMC中HBV DNA方法，研究PBMC中HBV DNA消长规律及其对干扰素的应答与疗效的影响。
材料与方法
一、病例来源
6例慢性乙型肝炎(乙肝)患者系1994年3月～1995年2月广州南方医院传染病科住院患者，男5例，女1例，平均年龄24.4岁(10～31岁)。均经肝穿刺活检病理诊断。6例血清HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA(+)、抗-HCV(—)。α-干扰素(Schering Plough,美国)治疗方案：3～6百万单位(MU)，每周3次，皮下注射，疗程3～6个月。外周血标本于治疗前后各1次、治疗中每间隔4～6周采集1次。
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二、方法
(一) PBMC分离 肝素抗凝全血5～10ml，加等量140mmol/L NaCl稀释后铺于淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟，取中间层细胞，用5ml生理盐水洗细胞3～4次。
(二) PBMC中HBV DNA检测 参照文献[2]方法提取细胞DNA。将细胞悬于细胞裂解液中(10mmol/L Tris.HCl pH8.2,100mmol/L EDTA pH8.0,0.5%SDS,20μg/ ml RNase)，37°C 1小时，加100μg/ ml蛋白酶K，50°C3小时，以苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。DNA沉淀溶于20μl ddH2O。取1μl DNA，用引物C1/C3进行PCR检测。即于标准PCR缓冲液中，加dNTP各200μmol，引物对各25pmol，总体积50μl,94°C 2分钟后加2.5U Taq DNA聚合酶。进行30～35次热循环：94°C 40秒，54°C 40秒，70°C 80秒；最后70°C 5分钟。取5μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于预测相对分子质量665bp处有明显荧光带者为阳性结果。
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(三) 血清HBV DNA检测 血清DNA提取参照文献[3]方法略修改：100μl血清，加100μl裂解液(25mmol/L,2.5mmol/L EDTA,1%SDS,2mg/ml proteinase K,10μl/ml tRNA)，68°C 2小时，酚和氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于10μl ddH2O，取5μl进行PCR检测，方法同上。
(四) HBV前C/C区核酸序列分析 引物序列见表1。用双脱氧末端终止法对PCR产物测序。取1μl 1∶100稀释PCR C1/C3产物，用C6/C2(C区)或CSP/PC1(前C区)内引物进行第二轮PCR(条件同上)，用异丙醇对PCR产物沉淀纯化。32P末端标记测序引物，按fmol测序试剂盒进行循环测序。电泳、放射自显影后，结果用DNASIS软件处理分析。
表1 HBV前C/C区寡核苷酸引物序列 引物
, http://www.100md.com 位置
序列(5′-3′)
C1
(2394-2370)R
GGCGGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGG
C3
(1730-1754)
CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT
C6
(2348-2330)R
ACGGATCCTAAACAACAGTAGTTTCCGG
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C2
(1955-1974)
TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
CSP
(1974-1955)R
GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
PC1
(1811-1834)
ACCATGCAACTTTTCACCTCTGC
R:antisense
结果
, 百拇医药
经干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清及PBMC中HBV DNA动态观察结果见表2。
表2 动态比较干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清与PBMC中HBV DNA 病例
号
INF(MU)
ALT(U/L)
HBeAg
HBV DNA
血清(PBMC)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
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1
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62
23
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+(-)
4
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396
80
150
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5
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+
+
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-
+(+)
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6
0
75
144
105
94
30
+
-
-
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+(+)
-(+)
-(-)
Ⅰ：治疗前, Ⅱ：治疗中, Ⅲ：治疗结束后4周内； +：进行了HBV前C或C区测序; INF：干扰素累加量
6例血清HBV DNA于干扰素治疗平均5周(3～10周)内消失，其中2例于治疗结束后复转阳性。5例PBMC中HBV DNA平均15周(12～20周)阴转，1例始终阳性。随着治疗时间和剂量的累积，血清HBeAg阴转率增加。PBMC中HBV DNA的清除率也同样随时间和剂量的累积而增加。
对病例4和病例1，治疗前后的PBMC中HBV前C或C基因区进行序列测定(纵向比较)。治疗前后无论前C(病例1)或C区(病例4)序列均相同。病例4治疗前同一份血清标本分离的血清和PBMC横向比较，PBMC与血清中HBV毒株C区序列有1个核苷酸不同，PBMC中为野毒株，而血清中为变异株，即nt1913位的C被A替代(氨基酸P被T替代)。PBMC中HBV前C区均相同，未见A1896终止码变异。
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细胞最后一次洗液，PCR检测HBV DNA均为阴性。
讨论
6例慢性乙肝经干扰素治疗后，4例完全反应(即ALT正常，HBeAg阴转，血清HBV DNA消失)，2例部分反应(ALT波动或正常，血清HBV DNA阳性或HBeAg阳性)。HBeAg和PBMC中HBV DNA的阴转与干扰素治疗累积剂量呈正相关。因本研究病例为人为选择性，观察的例数和次数均较少，只能是观察疗效与指标等关系的大概趋势，在治疗规模与观察结果与以往报道无可比性。
PBMC中HBV DNA与血清中HBV DNA比较，PBMC中HBV有5例在治疗结束时消失，1例(病例4)始终阳性。PBMC中HBV DNA清除平均时间为15周。提示α-干扰素可清除PBMC中HBV DNA，但较血清中的病毒清除延迟。这也从一个侧面提示干扰素治疗时间不应少于15周。治疗中5例PBMC中HBV清除迟于血清中的病毒清除时间，作为IFN疗效观察指标，动态观察PBMC中HBV DNA可能更可靠。
, 百拇医药
PBMC中HBV DNA测序结果可初步分析为：(1) PBMC中感染的HBV与血清中不同，有二种可能：一是感染PBMC的HBV有某种选择性。有报道认为PBMC中HBV感染是通过骨髓造血干细胞的感染所致[5]，而且HBV是通过PBMC表面前S1受体介导的[6]。血清中存在的HBV是病毒在不同组织中(主要在肝脏)复制的混合群体。因此也可推断，PBMC不是HBV复制的主要场所。其二，PBMC中HBV在宿主免疫压力筛选下保持相对稳定，而血清中HBV则相对易变[7]，由此形成了不同于血清存在的优势毒株。(2) PBMC中HBV毒株前C区未发现变异，因此PBMC中HBV持续存在的原因可能与病毒变异相关性小。(3) PBMC中HBV在干扰素治疗前后未发生前C/C区变异，提示干扰素可能并不诱导PBMC中HBV发生变异。这一结果与干扰素治疗并不增加HBV前C变异相吻合[8]。但因观测例数较少，以上分析有待进一步验证。
参考文献
, 百拇医药
1 Chong JO, Jenk LB. Hepatitis B virus in lymphocytes of seronegative carriers. Lancet, 1984, 2:395-396.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. 9-16.
3 骆抗先，周荣，梁炽森，等.PCR鉴定HBsAg阴性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染.中华内科杂志，1991，30：21-24.
4 章廉，冯筱榕，骆抗先，等.重组α-2b干扰素治疗慢性乙型肝炎患者临床研究。第一军医大学学报，1993，13：135-140.
, 百拇医药
5 Romet LJL, McLane MF, Elfassi E, et al. Hepatitis B virus infection in cultured human lymphoblastoid cells. Science, 1983, 221:667-669.
6 Pontisso P, Locasciulli N, Schiavon E, et al. Hepatitis B virus binds to peripheral blood mononuclear cells via the pre S1 protein. Hepatology, 1991, 12:203[209.
7 Blum HE. Hepatitis B virus: significance of naturally occurring mutants. Intervirology, 1993, 35:40-50.
8 Lok ASF, Akarca US, Greene S. Predictive value of precore hepatitis B virus mutations in spontaneous antigen clearance. Hepatology, 1995, 21:19-24.
(收稿：1996-09-09 修回：1998-05-11), http://www.100md.com
单位：郭亚兵、侯金林、姜荣龙、杨云芬、章廉、顾小维、骆抗先 510515 广州，第一军医大学南方医院；张继锁 解放军第260医院
关键词：
中华传染病杂志990116 人外周血单个核细胞(PBMC)中存在HBV DNA[1]的生物学意义远未阐明。我们用动态观测PBMC中HBV DNA方法，研究PBMC中HBV DNA消长规律及其对干扰素的应答与疗效的影响。
材料与方法
一、病例来源
6例慢性乙型肝炎(乙肝)患者系1994年3月～1995年2月广州南方医院传染病科住院患者，男5例，女1例，平均年龄24.4岁(10～31岁)。均经肝穿刺活检病理诊断。6例血清HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV DNA(+)、抗-HCV(—)。α-干扰素(Schering Plough,美国)治疗方案：3～6百万单位(MU)，每周3次，皮下注射，疗程3～6个月。外周血标本于治疗前后各1次、治疗中每间隔4～6周采集1次。
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二、方法
(一) PBMC分离 肝素抗凝全血5～10ml，加等量140mmol/L NaCl稀释后铺于淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟，取中间层细胞，用5ml生理盐水洗细胞3～4次。
(二) PBMC中HBV DNA检测 参照文献[2]方法提取细胞DNA。将细胞悬于细胞裂解液中(10mmol/L Tris.HCl pH8.2,100mmol/L EDTA pH8.0,0.5%SDS,20μg/ ml RNase)，37°C 1小时，加100μg/ ml蛋白酶K，50°C3小时，以苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。DNA沉淀溶于20μl ddH2O。取1μl DNA，用引物C1/C3进行PCR检测。即于标准PCR缓冲液中，加dNTP各200μmol，引物对各25pmol，总体积50μl,94°C 2分钟后加2.5U Taq DNA聚合酶。进行30～35次热循环：94°C 40秒，54°C 40秒，70°C 80秒；最后70°C 5分钟。取5μl PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，于预测相对分子质量665bp处有明显荧光带者为阳性结果。
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(三) 血清HBV DNA检测 血清DNA提取参照文献[3]方法略修改：100μl血清，加100μl裂解液(25mmol/L,2.5mmol/L EDTA,1%SDS,2mg/ml proteinase K,10μl/ml tRNA)，68°C 2小时，酚和氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于10μl ddH2O，取5μl进行PCR检测，方法同上。
(四) HBV前C/C区核酸序列分析 引物序列见表1。用双脱氧末端终止法对PCR产物测序。取1μl 1∶100稀释PCR C1/C3产物，用C6/C2(C区)或CSP/PC1(前C区)内引物进行第二轮PCR(条件同上)，用异丙醇对PCR产物沉淀纯化。32P末端标记测序引物，按fmol测序试剂盒进行循环测序。电泳、放射自显影后，结果用DNASIS软件处理分析。
表1 HBV前C/C区寡核苷酸引物序列 引物
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序列(5′-3′)
C1
(2394-2370)R
GGCGGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGG
C3
(1730-1754)
CTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATT
C6
(2348-2330)R
ACGGATCCTAAACAACAGTAGTTTCCGG
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C2
(1955-1974)
TTGCCTTCTGACTTCTTTCC
CSP
(1974-1955)R
GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
PC1
(1811-1834)
ACCATGCAACTTTTCACCTCTGC
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结果
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经干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清及PBMC中HBV DNA动态观察结果见表2。
表2 动态比较干扰素治疗的6例慢性乙肝患者血清与PBMC中HBV DNA 病例
号
INF(MU)
ALT(U/L)
HBeAg
HBV DNA
血清(PBMC)
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Ⅰ：治疗前, Ⅱ：治疗中, Ⅲ：治疗结束后4周内； +：进行了HBV前C或C区测序; INF：干扰素累加量
6例血清HBV DNA于干扰素治疗平均5周(3～10周)内消失，其中2例于治疗结束后复转阳性。5例PBMC中HBV DNA平均15周(12～20周)阴转，1例始终阳性。随着治疗时间和剂量的累积，血清HBeAg阴转率增加。PBMC中HBV DNA的清除率也同样随时间和剂量的累积而增加。
对病例4和病例1，治疗前后的PBMC中HBV前C或C基因区进行序列测定(纵向比较)。治疗前后无论前C(病例1)或C区(病例4)序列均相同。病例4治疗前同一份血清标本分离的血清和PBMC横向比较，PBMC与血清中HBV毒株C区序列有1个核苷酸不同，PBMC中为野毒株，而血清中为变异株，即nt1913位的C被A替代(氨基酸P被T替代)。PBMC中HBV前C区均相同，未见A1896终止码变异。
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细胞最后一次洗液，PCR检测HBV DNA均为阴性。
讨论
6例慢性乙肝经干扰素治疗后，4例完全反应(即ALT正常，HBeAg阴转，血清HBV DNA消失)，2例部分反应(ALT波动或正常，血清HBV DNA阳性或HBeAg阳性)。HBeAg和PBMC中HBV DNA的阴转与干扰素治疗累积剂量呈正相关。因本研究病例为人为选择性，观察的例数和次数均较少，只能是观察疗效与指标等关系的大概趋势，在治疗规模与观察结果与以往报道无可比性。
PBMC中HBV DNA与血清中HBV DNA比较，PBMC中HBV有5例在治疗结束时消失，1例(病例4)始终阳性。PBMC中HBV DNA清除平均时间为15周。提示α-干扰素可清除PBMC中HBV DNA，但较血清中的病毒清除延迟。这也从一个侧面提示干扰素治疗时间不应少于15周。治疗中5例PBMC中HBV清除迟于血清中的病毒清除时间，作为IFN疗效观察指标，动态观察PBMC中HBV DNA可能更可靠。
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PBMC中HBV DNA测序结果可初步分析为：(1) PBMC中感染的HBV与血清中不同，有二种可能：一是感染PBMC的HBV有某种选择性。有报道认为PBMC中HBV感染是通过骨髓造血干细胞的感染所致[5]，而且HBV是通过PBMC表面前S1受体介导的[6]。血清中存在的HBV是病毒在不同组织中(主要在肝脏)复制的混合群体。因此也可推断，PBMC不是HBV复制的主要场所。其二，PBMC中HBV在宿主免疫压力筛选下保持相对稳定，而血清中HBV则相对易变[7]，由此形成了不同于血清存在的优势毒株。(2) PBMC中HBV毒株前C区未发现变异，因此PBMC中HBV持续存在的原因可能与病毒变异相关性小。(3) PBMC中HBV在干扰素治疗前后未发生前C/C区变异，提示干扰素可能并不诱导PBMC中HBV发生变异。这一结果与干扰素治疗并不增加HBV前C变异相吻合[8]。但因观测例数较少，以上分析有待进一步验证。
参考文献
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1 Chong JO, Jenk LB. Hepatitis B virus in lymphocytes of seronegative carriers. Lancet, 1984, 2:395-396.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. 9-16.
3 骆抗先，周荣，梁炽森，等.PCR鉴定HBsAg阴性慢性活动性肝炎中的乙型肝炎病毒感染.中华内科杂志，1991，30：21-24.
4 章廉，冯筱榕，骆抗先，等.重组α-2b干扰素治疗慢性乙型肝炎患者临床研究。第一军医大学学报，1993，13：135-140.
, 百拇医药
5 Romet LJL, McLane MF, Elfassi E, et al. Hepatitis B virus infection in cultured human lymphoblastoid cells. Science, 1983, 221:667-669.
6 Pontisso P, Locasciulli N, Schiavon E, et al. Hepatitis B virus binds to peripheral blood mononuclear cells via the pre S1 protein. Hepatology, 1991, 12:203[209.
7 Blum HE. Hepatitis B virus: significance of naturally occurring mutants. Intervirology, 1993, 35:40-50.
8 Lok ASF, Akarca US, Greene S. Predictive value of precore hepatitis B virus mutations in spontaneous antigen clearance. Hepatology, 1995, 21:19-24.
(收稿：1996-09-09 修回：1998-05-11), http://www.100md.com