猪源杀菌性/通透性增加蛋白对革兰阴性菌的作用
作者：周红 郑江 肖光夏
单位：400038 重庆，第三军医大学烧伤研究所
关键词：
中华传染病杂志990114 杀菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein, BPI)是一种存在于人及哺乳动物中性粒细胞(PMN)嗜天青颗粒中的蛋白质，相对分子质量约为55 000，具有特异杀死革兰阴性(G-)菌及中和内毒素的作用。我们已成功地从猪PMN中提取纯化BPI，并对其体内外生物活性进行了研究。现将其对革兰阴性菌的杀菌作用作一报道。
材料与方法
一、实验材料
(一) 细菌 大肠杆菌、绿脓杆菌等均为我室分离并鉴定。
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(二) 放线菌素D(Act D) Fluka产品。
(三) 3H-亮氨酸 中国原子能研究所产品。
(四) 猪源BPI 由我室按照Weiss的方法提取并纯化[1]。
二、实验方法
(一) 猪源BPI对G-菌杀菌活性的测定 将细菌培养至对数生长期，吸取0.4ml菌液(9×107cfu/ ml)，加入一定量纯化的猪源BPI， 37°C培养30分钟后，梯度稀释后进行菌落计数。
(二) 半乳糖对猪源BPI杀灭J5菌作用的影响 将J5菌接种于含有5mmol/L半乳糖及无半乳糖的TEM培养液中，37°C振荡培养18小时后，再转移至新鲜培养液中4小时，吸取0.4ml菌液(9×107cfu/ ml)，加入BPI 1μg,37°C温育30分钟后，梯度稀释后进行菌落计数。
, 百拇医药
(三) 猪源BPI增加G-菌外膜通透性能力的测定 利用细菌对Act D的不通透性，测定在BPI存在与不存在情况下，Act D对3H亮氨酸的掺入情况的影响。
(四) 猪源BPI对J5菌形态学的影响 将J5菌接种于无半乳糖的TEM培养液中，按方法1中所述进行BPI杀菌实验。常规方法收集菌体并制作透射电镜标本，菲利浦透射电镜观察并拍照。
三、统计分析
t检验方法进行均数比较。
结果
一、猪源BPI对G-菌杀菌活性及通透性增加能力的测定
猪源BPI具有强大的杀灭G-菌作用和增加G-菌外膜通透性的能力，对G+菌无影响，见表1。
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表1 各种细菌对BPI的敏感性 细菌
增加通
透性活性
杀菌活性
革兰阴性菌
大肠杆菌
++++～++
++++～++
痢疾杆菌
++
++
绿脓杆菌
++++～++
, 百拇医药
++++～++
沙雷氏菌
++++～+++
++++～+++
肺炎杆菌
++++～+++
++++～+++
阴沟杆菌
+++
+++
革兰阳性菌
金黄色葡
萄球菌
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—
0
表皮葡
萄球菌
—
0
链球菌
—
0
注：1～4+表示BPI产生>90%杀菌或增加通透性活性的蛋白质用量；++++：<1μg,+++:1～2.5μg,++:2.5～5μg,+：5～10μg,0:>20μg无效；—：表明该菌对放线菌素D敏感
二、半乳糖对猪源BPI杀灭J5菌作用的影响
, http://www.100md.com
在无半乳糖TEM培养液中生长的J5菌对BPI敏感，BPI杀菌率为84.3%，而在有半乳糖培养液中生长的J5菌对BPI较不敏感，BPI杀菌率为14%。
三、猪源BPI对J5菌形态的影响
在透射电镜下观察，正常J5菌形态完整，细菌内外膜清晰、完整，胞质成份均匀。而当加入猪源BPI 30分钟后，细菌外膜破碎，胞质浊化甚至流出，细菌周围出现碎片。
讨论
猪源BPI对许多G-菌具有增加其外膜通透性并将之杀灭的作用，其中包括大肠杆菌、绿脓杆菌、沙雷菌等，而对G+菌无此作用，说明BPI特异地作用于G-菌。但各种菌之间乃至同种细菌之间对BPI的敏感性不同。这与文献报告的人源、兔源BPI的作用相似[1，2]。关于BPI的杀菌机制目前尚不清楚。但从对猪源BPI的杀菌性和通透性增加能力测定中可看出：细菌对BPI的杀菌力和通透性增加能力的敏感性是同步的，所需BPI的剂量相同，说明BPI的杀菌活性与通透性增加能力是紧密相关的。电镜观察结果也表明BPI可迅速引起细菌外膜的改变，导致细菌死亡。
, 百拇医药
J5菌是一株无UDP-半乳糖-4-表异构活性的粗糙型大肠杆菌。当J5菌生长于不加半乳糖的TEM培养液中时，其细胞膜的脂多糖(LPS、内毒素)为短链；而当TEM培养液中加入2mmol以上半乳糖后，J5菌的LPS则为长链[3]。TEM培养液中加入半乳糖后虽然仅改变J5菌的LPS链的长度，但J5菌对BPI的敏感性也随之改变。说明短链LPS细菌对BPI较敏感，这也进一步表明细菌对BPI的敏感性与LPS有密切关系。这可能与BPI为一带正电荷的阳性蛋白，易和带负电的G-菌外膜的LPS结合(而LPS为G-菌外膜的主要成份)，导致细菌外膜通透性增加有关[4]。而G-菌外膜通透屏障的修复有赖于LPS的生物合成[5]。有实验表明较长的LPS链能阻挡BPI到达其与LPS的结合位点类脂A，故BPI对LPS的亲和力下降，杀菌力也随之降低[5]。所以BPI的杀菌作用与其结合并中和内毒素的作用有着密切关系。
, 百拇医药
由于BPI既能直接杀菌又具有增加G-菌外膜通透性的作用，可以促进其它杀菌制剂进入细菌内，如加速抗生素进入菌体内。因此，BPI在治疗G-菌感染中具有非常重要的作用，并有着良好的应用前景。
国家“八五”攻关资助课题
参考文献
1 Weiss J, Elsbach P, Olsson I, et al. Purification and characterization of a potent bacteria and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1978, 253:2664-2672.
2 Elsbach P, Weiss J, Franson PC, et al. Separation and purification of a potent bactericidal/permeability increasing protein and a closely associated phospholipase A2 from rabbit polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1979, 254:11000-11009.
, 百拇医药
3 Gazzano-Santoro H, Parent JB, Grinna L, et al. High affinity binding of the bactericidal/permeability increasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of Lipopolysaccharide. Infect Immun, 1992, 60:4754-4761.
4 Weiss JS, Beckerdite Q, Elsbach P, et al. Resistance of gram-negative bacteria to purified leukocyte proteins: relation to binding and bacterial lipopolysaccharide structure. J Clin Invest, 1980, 65:619-628.
5 Weiss J, Victor M, Elsbach P, et al. Role of charge and hydrophobic interactions in the action of the bactericidal/permeability increasing protein of neutrophils on gram-negative bacteria. J Clin Invest, 1983, 71:540-549.
(收稿：1997-09-22 修回：1998-03-06), 百拇医药
单位：400038 重庆，第三军医大学烧伤研究所
关键词：
中华传染病杂志990114 杀菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein, BPI)是一种存在于人及哺乳动物中性粒细胞(PMN)嗜天青颗粒中的蛋白质，相对分子质量约为55 000，具有特异杀死革兰阴性(G-)菌及中和内毒素的作用。我们已成功地从猪PMN中提取纯化BPI，并对其体内外生物活性进行了研究。现将其对革兰阴性菌的杀菌作用作一报道。
材料与方法
一、实验材料
(一) 细菌 大肠杆菌、绿脓杆菌等均为我室分离并鉴定。
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(二) 放线菌素D(Act D) Fluka产品。
(三) 3H-亮氨酸 中国原子能研究所产品。
(四) 猪源BPI 由我室按照Weiss的方法提取并纯化[1]。
二、实验方法
(一) 猪源BPI对G-菌杀菌活性的测定 将细菌培养至对数生长期，吸取0.4ml菌液(9×107cfu/ ml)，加入一定量纯化的猪源BPI， 37°C培养30分钟后，梯度稀释后进行菌落计数。
(二) 半乳糖对猪源BPI杀灭J5菌作用的影响 将J5菌接种于含有5mmol/L半乳糖及无半乳糖的TEM培养液中，37°C振荡培养18小时后，再转移至新鲜培养液中4小时，吸取0.4ml菌液(9×107cfu/ ml)，加入BPI 1μg,37°C温育30分钟后，梯度稀释后进行菌落计数。
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(三) 猪源BPI增加G-菌外膜通透性能力的测定 利用细菌对Act D的不通透性，测定在BPI存在与不存在情况下，Act D对3H亮氨酸的掺入情况的影响。
(四) 猪源BPI对J5菌形态学的影响 将J5菌接种于无半乳糖的TEM培养液中，按方法1中所述进行BPI杀菌实验。常规方法收集菌体并制作透射电镜标本，菲利浦透射电镜观察并拍照。
三、统计分析
t检验方法进行均数比较。
结果
一、猪源BPI对G-菌杀菌活性及通透性增加能力的测定
猪源BPI具有强大的杀灭G-菌作用和增加G-菌外膜通透性的能力，对G+菌无影响，见表1。
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表1 各种细菌对BPI的敏感性 细菌
增加通
透性活性
杀菌活性
革兰阴性菌
大肠杆菌
++++～++
++++～++
痢疾杆菌
++
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绿脓杆菌
++++～++
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++++～++
沙雷氏菌
++++～+++
++++～+++
肺炎杆菌
++++～+++
++++～+++
阴沟杆菌
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革兰阳性菌
金黄色葡
萄球菌
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表皮葡
萄球菌
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链球菌
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0
注：1～4+表示BPI产生>90%杀菌或增加通透性活性的蛋白质用量；++++：<1μg,+++:1～2.5μg,++:2.5～5μg,+：5～10μg,0:>20μg无效；—：表明该菌对放线菌素D敏感
二、半乳糖对猪源BPI杀灭J5菌作用的影响
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在无半乳糖TEM培养液中生长的J5菌对BPI敏感，BPI杀菌率为84.3%，而在有半乳糖培养液中生长的J5菌对BPI较不敏感，BPI杀菌率为14%。
三、猪源BPI对J5菌形态的影响
在透射电镜下观察，正常J5菌形态完整，细菌内外膜清晰、完整，胞质成份均匀。而当加入猪源BPI 30分钟后，细菌外膜破碎，胞质浊化甚至流出，细菌周围出现碎片。
讨论
猪源BPI对许多G-菌具有增加其外膜通透性并将之杀灭的作用，其中包括大肠杆菌、绿脓杆菌、沙雷菌等，而对G+菌无此作用，说明BPI特异地作用于G-菌。但各种菌之间乃至同种细菌之间对BPI的敏感性不同。这与文献报告的人源、兔源BPI的作用相似[1，2]。关于BPI的杀菌机制目前尚不清楚。但从对猪源BPI的杀菌性和通透性增加能力测定中可看出：细菌对BPI的杀菌力和通透性增加能力的敏感性是同步的，所需BPI的剂量相同，说明BPI的杀菌活性与通透性增加能力是紧密相关的。电镜观察结果也表明BPI可迅速引起细菌外膜的改变，导致细菌死亡。
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J5菌是一株无UDP-半乳糖-4-表异构活性的粗糙型大肠杆菌。当J5菌生长于不加半乳糖的TEM培养液中时，其细胞膜的脂多糖(LPS、内毒素)为短链；而当TEM培养液中加入2mmol以上半乳糖后，J5菌的LPS则为长链[3]。TEM培养液中加入半乳糖后虽然仅改变J5菌的LPS链的长度，但J5菌对BPI的敏感性也随之改变。说明短链LPS细菌对BPI较敏感，这也进一步表明细菌对BPI的敏感性与LPS有密切关系。这可能与BPI为一带正电荷的阳性蛋白，易和带负电的G-菌外膜的LPS结合(而LPS为G-菌外膜的主要成份)，导致细菌外膜通透性增加有关[4]。而G-菌外膜通透屏障的修复有赖于LPS的生物合成[5]。有实验表明较长的LPS链能阻挡BPI到达其与LPS的结合位点类脂A，故BPI对LPS的亲和力下降，杀菌力也随之降低[5]。所以BPI的杀菌作用与其结合并中和内毒素的作用有着密切关系。
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由于BPI既能直接杀菌又具有增加G-菌外膜通透性的作用，可以促进其它杀菌制剂进入细菌内，如加速抗生素进入菌体内。因此，BPI在治疗G-菌感染中具有非常重要的作用，并有着良好的应用前景。
国家“八五”攻关资助课题
参考文献
1 Weiss J, Elsbach P, Olsson I, et al. Purification and characterization of a potent bacteria and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1978, 253:2664-2672.
2 Elsbach P, Weiss J, Franson PC, et al. Separation and purification of a potent bactericidal/permeability increasing protein and a closely associated phospholipase A2 from rabbit polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1979, 254:11000-11009.
, 百拇医药
3 Gazzano-Santoro H, Parent JB, Grinna L, et al. High affinity binding of the bactericidal/permeability increasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of Lipopolysaccharide. Infect Immun, 1992, 60:4754-4761.
4 Weiss JS, Beckerdite Q, Elsbach P, et al. Resistance of gram-negative bacteria to purified leukocyte proteins: relation to binding and bacterial lipopolysaccharide structure. J Clin Invest, 1980, 65:619-628.
5 Weiss J, Victor M, Elsbach P, et al. Role of charge and hydrophobic interactions in the action of the bactericidal/permeability increasing protein of neutrophils on gram-negative bacteria. J Clin Invest, 1983, 71:540-549.
(收稿：1997-09-22 修回：1998-03-06), 百拇医药